全 文 ：Marine Sciences /Vol. 30 , No. 4 /2006
用包埋脱水法冰冻保存小新月菱形藻
王起华1 , 李　莹2 , 刘艳萍1 , 李大鹏3
(1. 辽宁师范大学 生命科学学院 , 辽宁 大连 116029;2. 辽阳职业技术学院 师范分院 , 辽宁 辽阳 111000;
3. 中国科学院 海洋研究所 ,山东 青岛 266071)
摘要:采用包埋脱水法研究了小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutissima)的超低温保
存 ,探讨了影响存活率的内 、外因素:藻细胞年龄 、脱水速率 、胶球含水量和化冻后的恢复方
法等。结果表明 ,将处于静止初期的藻细胞包埋在含有 0. 5 mo l /L 蔗糖的 3%褐藻酸钙胶球
中 ,以含水量每小时减少 0. 9%的平均速率脱水至胶球含水量为 40%,化冻后在冻存管中室
温下暗恢复 12 h 的条件下冰冻存活率较高 , 可达到 18. 3%左右。与常规的两步法冰冻保存
相比 ,包埋脱水法可大大简化操作程序 ,是保存小新月菱形藻的一种有潜力的方法。
关键词:小新月菱形藻(Nitz schia closteri um minutissima);包埋脱水法;冰冻(超低温)保存
中图分类号:Q33　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-3096(2006)04-0050-04
　　海洋饵料微藻在鱼 、虾 、贝类育苗生产中有着重
要作用 ,有关其超低温保存的研究近年来日益受到
重视[ 1 ～ 6] 。然而 , 以往的保存方法多采用常规的两步
冷冻法 ,限制了该技术的广泛应用[ 7] 。 20 世纪 90 年
代初 ,包埋脱水法在高等植物种质的冷冻保存中得
以建立并广泛应用。该法操作简单 , 不需复杂设备 ,
而且通常不使用抗冻保护剂 , 是对超低温保存技术
的一个重大发展[ 8] 。近年来采用该方法保存某些藻
类已获得初步成功[ 9 ～ 12] 。但是 , 采用该法保存海洋
饵料微藻的研究尚鲜有报道 , 作者[ 13] 曾尝试用包埋
脱水法冷冻保存牟氏角刺藻并取得了初步成功。作
者用包埋脱水法研究了藻细胞年龄 、脱水速率和胶
球含水量对另一种海洋饵料硅藻———小新月菱形藻
超低温保存的影响 , 并在此基础上进一步探讨了化
冻后恢复方法对小新月菱形藻和牟氏角刺藻冷冻保
存的影响。
1　材料和方法
1. 1　材料及其培养
小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutis-
sima)由大连水产研究所提供 , 并由辽宁师范大学藻
类生理研究室纯化为单种。藻种的培养条件为 18℃
±2℃;冷荧光 , 光强 2 500 lx ±200 lx , 光照周期
12∶12。实验材料的培养光强为 2 900 lx±200 lx ,
其他条件同前。牟氏角刺藻(Chaetoceros muelleri)
的培养条件见文献[ 13] 。除特殊说明外 ,取培养 10 d
的材料(静止期)用于冰冻保存。
1. 2　包埋和脱水
1. 2. 1　包埋
取上述培养材料 , 离心除去培养液 , 用含 0. 5
mo l /L 蔗糖的消毒海水再悬浮至适当密度 , 与含 0. 5
mo l /L 的蔗糖和 30‰NaCl的 6%褐藻酸钠(SIGMA
CH EMICAL Co.)溶液等体积混匀 , 移入具 6 号针头
的 10 mL 注射器中 , 将藻液滴入含相同浓度的蔗糖
和 NaCl的 0. 1 mo l/ L CaCl2溶液中 , 轻轻摇动 , 60
min 后完成包埋过程。 控制条件可制成直径为 2. 5
mm , 藻密度为 200×104个 /球的胶球。 此方法参照
文献[ 13] 。
1. 2. 2　脱水及含水量的测定
将上述胶球放置在 22℃暗室中 , 用硅胶吸湿法
脱水。除特殊说明外 , 以每小时含水量减少 0. 9%的
脱水速率脱水至 40%含水量后测定胶球的含水量 ,
方法参照李莹等[ 13] 。
1. 3　冰冻和化冻
胶球脱水后立即采用一步冰冻法快速冰冻 ,保存
24 h 后采用快速化冻法化冻 ,方法参照王起华等[ 12] 。
收稿日期:2004-02-25;修回日期:2004-08-10
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30170099 , 30470184);
辽宁省教育厅科研基金资助项目(20041015)
作者简介:王起华(1943-),男 ,辽宁北宁人 ,教授 ,主要从事
藻类生理和生物技术研究 , E-mai l:qih ua_ mai l@163. com;
李大鹏 ,通讯作者 , E-mai l:dpli@ms . qdio. ac. cn
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1. 4　化冻后的恢复
化冻后的胶球采用下述 3 种方法恢复:(1)将胶
球移入 f /2 培养基中;(2)将胶球移入直径 3 cm 的培
养皿中 , 将培养皿分别置于含有过饱和盐(KNO 3 、
NaCl和 NaNO2)溶液的密闭玻璃罐的上部气相中 ,
其相对湿度(RH)分别为 KNO 3 , 92%;NaCl , 75%;
NaNO 2 , 64%;(3)将胶球保留在密封的冻存管中。
上述处理都是在 22℃暗中进行 , 除特殊说明外 , 恢复
时间都是 12 h。
1. 5　存活率的测定
上述实验均以未脱水且未冰冻的包埋材料作为
对照样品 , 将对照样品和冰冻前后的包埋-脱水样品
分别再培养 5 d ,培养条件与前述实验材料的培养条
件相同。用 90%丙酮提取叶绿素后计算其含量 , 并
根据叶绿素含量计算存活率[13] 。
2　结果与讨论
2. 1　藻细胞年龄对小新月菱形藻存活率的
影响
　　分别取指数期(6 d)和静止期(10 d)的材料用于
冰冻保存。其结果如表 1 所示 ,指数期的小新月菱形
藻的冰冻保存存活率为 8. 3%。 而静止期的材料存
活率显著升高 , 达到 18. 3%。这与王起华等[ 5] 采用
两步法冰冻保存该藻的结果基本一致。 Mor ris[ 14]指
出 ,静止期的细胞由于受许多营养条件及物理因子
的限制 ,生理状态发生了很大变化 , 因而导致抗冻性
的增强。但对某些藻类的研究结果表明 ,藻细胞年龄
对抗冻性的影响与藻类种类有关[4] 。
表 1　藻细胞年龄对小新月菱形藻存活率的影响
Tab. 1　The effect of the age of algal cells on the viabili ty of
N. closterium minuti ssima
处理
存活率(%)
指数期 静止期
冰冻前 84. 8±2. 4 85. 6±2. 3
冰冻后 8. 3±1. 8 18. 3±2. 8
2. 2　脱水速率对小新月菱形藻存活率的影
响
　　如图 1 所示 ,脱水速率对冰冻前包埋材料的存活
率影响很小 ,存活率都在 80%左右。然而 , 脱水速率
对冰冻后材料的存活率有显著的影响 , 当脱水速率
在含水量每小时减少 0. 9%时 , 可获得最大存活率 ,
为 18. 3%。这一结果与 Hirata 等[ 10] 对杜氏藻的研
究结果基本一致 , 即脱水速率显著影响冰冻后材料
的存活率。不同的是 , 如前所述 , 脱水速率对小新月
菱形藻冰冻前的存活率影响很小 ,而对杜氏藻冰冻前
的存活率影响较大。本实验结果与作者冰冻保存牟
氏角刺藻的实验结果[ 13] 都表明 , 脱水速率是影响冰
冻存活率的重要因素之一 ,应该给予更大的重视。
图 1　脱水速率对小新月菱形藻存活率的影响
Fig. 1　The effect of dehyd rat ion rate on the viabi lit y of
N. closter ium minut issima
2. 3　含水量对小新月菱形藻存活率的影响
胶球含水量对存活率的影响如图 2 所示 ,当含水
量高于 30%时 , 冰冻前藻细胞的存活率随含水量减
小而缓慢下降;当含水量为 30%时 , 存活率仍在
80%以上;当含水量低于30%后 , 存活率随含水量的
减少而迅速下降;到含水量为 15%时存活率已为零。
对冰冻后的材料 , 当含水量为 40%时存活率最高 ,
约为 18. 3%,增大或减小含水量都会使存活率下降。
上述结果与 Hira ta[ 10] 和李莹[ 13] 用其他微藻得到的
结果相似。本实验结果进一步表明 ,确定最适含水量
是提高冰冻存活率的重要因素之一。样品保存前的
最适含水量因植物种类和材料类型的不同而不同。
对高等植物来说 ,最适含水量变化范围很大 , 如体胚
或小孢子胚一般为 13%～ 20%, 而茎尖和分生组织
多为 20%～ 40%[ 8] 。已报道的藻类的最适含水量一
般为 40%[ 10 , 11 , 13] 。但也发现有例外 , 作者在保存坛
紫菜丝状体时曾观察到 , 当含水量在 20%～ 40%范
围内 , 样品冰冻后的存活率几乎不受含水量的影响 ,
都在 65%左右[ 12] 。
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图 2　胶球含水量对小新月菱形藻存活率的影响
Fig. 2　The ef fect of the w ater content of beads on the
viabili ty of N. closterium min uti ssima
2. 4　化冻后恢复方法对存活率的影响
图 3 为恢复方法对小新月菱形藻存活率的影响。
由图可知 ,各种恢复处理都在 12 h 达到最高存活率 ,
在冻存管中恢复时存活率最高 , 达 18. 3%。在含过
饱和 NaCl溶液的密闭气相(RH75%)中恢复时 , 存
活率较高 ,为 17. 1%。 而在培养基中恢复存活率最
低 ,仅为 10. 9%。
图 4 为恢复方法对牟氏角刺藻存活率的影响。
各种恢复处理都在 12 h 达到最高存活率 , 这与小新
月菱形藻的情况相似。不同的是 ,牟氏角刺藻在含过
饱和 NaCl溶液的密闭气相(RH75%)中恢复时 , 存
活率最高 ,达 35. 1%。在冻存管中恢复存活率较高 ,
为32. 5%。 而在培养基中恢复存活率较低 , 为
25. 1%。
图 3　化冻后恢复方法对小新月菱形藻存活率的影响
Fig. 3　T he ef fect of recovery method af ter th aw ing
on the viabi lit y of N. closter ium minut issima
图 4　化冻后恢复方法对牟氏角刺藻存活率的影响
Fig. 4　The ef fect of recovery meth od af ter thawing on
th e viabili ty of Cha toceros muelleri
在包埋脱水法中 ,对经历了脱水-冰冻-化冻过程
的胶球 , 在再培养之初 , 还要经历一个“复水”的过程 ,
即恢复到正常含水量的过程。在本实验所采用的 3
种恢复方法中 ,第一种方法是将含藻细胞的胶球直接
移入培养基中恢复 ,在恢复开始 ,藻细胞会经历一个
快速的复水过程;第二种方法是将含藻细胞的胶球移
入含有过饱和盐类的密闭气相中恢复 ,藻细胞在修复
损伤过程的同时 ,会经历一个相对慢速的复水过程 ,
其复水速率与过饱和盐类的相对湿度有关;第三种方
法是将含藻细胞的胶球保持在密封的冻存管中 ,使胶
球含水量保持在脱水后的状态 ,细胞在恢复过程中并
不经历复水过程 ,需等到再培养开始(胶球移入培养
基)时 ,才完成复水过程 。本实验结果表明 ,第三种方
法适合于小新月菱形藻细胞的恢复 ,而第二种方法中
含过饱和 NaCl溶液的密闭气相(RH75%)适合于牟
氏角刺藻的恢复。关于恢复方法对藻类冰冻保存的
影响的研究至今尚无公开报道[ 7 ,15] , 许多问题仍有待
更进一步的研究。
综上所述 ,作者首次采用包埋(胶囊化)脱水法研
究了小新月菱形藻的冰冻保存。结果表明 ,藻细胞年
龄 、脱水速率 、胶球含水量和化冻后恢复方法等因素
都对存活率有较大的影响。与常规的两步冰冻法相
比 , 该方法不需要使用抗冻保护剂 , 也不需要严格控
制降温速率 , 因而大大简化了冰冻 - 化冻操作程序 ,
是一种有潜力的保存方法。然而 ,用包埋 -脱水法冰
冻保存小新月菱形藻所获得的存活率仍然明显低于
用两步法所能得到的存活率[ 5] 。因此 ,如何提高存活
率是一个需要进一步探讨的课题。
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参考文献:
[ 1] 　C anavate J P , Lubian L M. Some aspects on the cryo-
p reservation of m icroalgae used as food for m arin e spe-
cies[ J] . Aquacul ture , 1995 , 136:277-290.
[ 2] 　Day J G , Fenwick C. Cryopreservat ion of members of
th e genu s Tetraselmis used in aquaculture[ J] . Aqua-
culture , 1993 , 118:151-160.
[ 3] 　马志珍 , 张继红. 海产饵料微藻超低温保存技术的研
究[ J] . 中国水产科学 , 1997 , 4(4):13-17.
[ 4] 　王起华 , 石若夫 , 程爱华. 三种饵料金藻超低温保存
的研究[ J] . 中国水产科学 , 1999 , 6(2):89-92.
[ 5] 　王起华 , 张恩栋 , 王冰 ,等. 两种海洋饵料硅藻的超低
温保存[ J] . 辽宁师范大学学报 , 1999 , 22(4):310-
314.
[ 6] 　王起华 , 张恩栋 , 李大鹏 , 等. 盐生杜氏藻和青岛大
扁藻的超低温保存[ J] . 植物学报 , 2000 , 42(4):399-
402.
[ 7] 　王起华 , 张恩栋 , 周春影. 藻类种质超低温保存研究
概况[ J] . 植物学通报 , 2002 , 19(1):21-29.
[ 8] 　王君晖 , 边红武 , 黄纯农. 植物样品包埋脱水法超低
温保存的研究进展[ J] . 植物学通报 , 1999 , 16(5):
582-586.
[ 9] 　Day J G , Fleck R A , Benson E E. C ry op reservation-
recalci trance in milcoalgae:novel approaches to ident i-
f y and avoid cryo-inju ry[ J] . J Appl Phycol , 2000 , 12:
369-377.
[ 10] 　H irata K , Phunchindaw an M , T akamoto J , et al .
C ryop reservat ion of microalgae u sing encapsu lation-
dehydration[ J] . Cryo-Letters , 1996 , 17:321-328.
[ 11] 　Vignerom T , A rb eul t S , Kaas R. Cryopreservat ion
of gam etophytes of Laminar ia deg i tata (L) Lam-
ouroux by encapsu lated dehydration[ J] . Cryo-Let-
ters , 1997 , 18:93-98.
[ 12] 　王起华 ,刘明 ,程爱华. 坛紫菜自由丝状体的胶囊化
冰冻保存[ J] . 辽宁师范大学学报 , 2000 , 23(4):
387-390.
[ 13] 　李莹 ,王起华 ,李贺 ,等. 用包埋脱水法冰冻保存牟氏
角刺藻[ J] . 海洋科学 , 2003 , 27(7):48-51.
[ 14] 　M orri s G J. The cryopreservation of 250 st rains of
Ch lorococcales b y th e meth od s of tw o-step cooling
[ J] . Br Phycol J, 1978 , 13:15-24.
[ 15] 　Tay lor R , Fletcher R L. Cryopreservat ion of eucary-
otic algae-a review of meth od ologies[ J] . J Appl Phy-
col , 1999 , 10:481-501.
Cryopreservation of Nitzschia closterium minutissima by en-
capsulation-dehydration
WANG Qi-hua1 , LI Ying2 , LIU Yan-ping 1 , LI Da-peng3
(1. The School of L ife Sciences , Liaoning Normal Univ ersity , Dalian 116029 , China;2. Liaoyang Vocational
Technolog y Colleg e , Liaoyang 111000 , China;3. Institute of Oceano lo gy , the Chinese Academy o f Sciences ,
Qingdao 266071 , China)
Received:Feb. , 25 , 2004
Key words:Nitzsch ia closterium minut issima;encapsulat ion-dehydration;cryopres ervation
Abstract:Nitzschia closteri um minutissima was prese rved in liquid nitro gen by encapsula tion-dehydra-
tion. The main facto rs influencing the alg al viabilitiy after c ryoprese rvation , such as the age of algal cells , the
dehydra tion rate , the water content o f beads and the recovery me thod after thawing , we re studied. The results
show ed tha t the alg ae viability after cry opreserv ation reached about 18. 3%——— a relativ ely high viable rate
when the algal cells in a stationar y pha se we re encapsulated in the beads o f 3% Ca-alg inate with 0. 5 mol /L of
sucro se and the beads we re dehydrated at an ave rage rate of w ater content reduction 0. 9%/h to 40% of the
water content. Compared with the conventional tw o-step freezing method , the encapsulation-dehydration meth-
od sim plified the ope ration pro cedure of cryoprese rva tion g rea tly and so did a po tential method f or preserv ation
of N. closteri um minutissima.
(本文编辑:张培新)
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