全 文 ：第 45卷 第 5期 海 洋 与 湖 沼 Vol.45, No.5
2 0 1 4 年 9 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Sep., 2014

*国家高技术研究发展计划(863计划), 2012AA10A413号。庄琰, E-mail: zhuangyan8998@163.com
① 通讯作者: 宫相忠, 教授, E-mail: gxzhw@163.com
收稿日期: 2013-12-18, 收修改稿日期: 2014-02-15
包埋脱水法超低温保存萱藻(Scytosiphon lomentaria)
丝状体的研究*
庄 琰 宫相忠① 高 伟 张文健
(中国海洋大学海洋生命学院 青岛 266003)
提要 以本实验室保存的萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体为材料, 用包埋脱水法超低温保存萱
藻丝状体, 研究了蔗糖预培养浓度和时间、胶球含水量、化冻温度以及胶球恢复时间对萱藻丝状体
存活率和冻存后生长发育能力的影响。结果显示: (1) 萱藻丝状体胶球在 0.4mol/L的蔗糖溶液中预培
养 6h能获得最高的存活率; (2) 萱藻丝状体胶球的最佳含水量较低, 为 15%左右, 当含水量高于 27%
时, 冻存后的存活率为 0; (3) 40°C为最适的化冻温度; (4) 化冻后, 将萱藻丝状体胶球在黑暗条件下
恢复 18h能显著提高存活率; (5) 在最佳条件下, 萱藻丝状体经冻存后的存活率最高可达 54.79%, 恢
复后的丝状体与冻存前丝状体并无区别, 且经诱导后能够产生正常的孢子囊, 放散的孢子可以发育
成叶状体。
关键词 萱藻(Scytosiphon lomentaria); 丝状体; 包埋脱水法; 超低温保存
中图分类号 Q945 doi: 10.11693/hyhz20131200204
包埋脱水法是一种将生物材料用褐藻酸钠包埋,
然后经脱水后投入液氮保存的一种较为广泛使用的
种质保存方法 , 最早被法国学者应用于保存马铃薯
茎尖的研究中(Fabre et al, 1990)。与传统的两步法相
比, 包埋脱水法不仅能获得较高的存活率, 而且具有
省时省力、无需复杂的设备和仪器、无需使用抗冻保
护剂从而避免了其对生物材料的毒性等优点, 这无疑
是超低温保存技术的一项重大进步(Fabre et al, 1990;
王君晖等, 1999)。近年来, 包埋脱水法被广泛应用于植
物细胞、组织和器官的保存, 在藻类方面, 包埋脱水法
在诸如坛紫菜自由丝状体(王起华等, 2000)、裙带菜配
子体(王起华等, 2005)以及多种微藻(Hirata et al, 1996;
李贺等, 2005)等的保存上取得了初步的成功。
萱藻(Scytosiphon lomentaria)隶属于褐藻门(Pha-
eophyta), 是一种广泛分布于我国北起辽东半岛南至
广东省海陵岛之间沿海海域的大型海藻。萱藻不仅口
味鲜美、营养价值高, 而且具有抗氧化性(Kuda et al,
2005)、抗肿瘤(Noda et al, 1990; 徐年军等, 2001)和抗
病毒(Hudson et al, 1999)的特点, 是一种经济价值极
高的新型海藻。萱藻具有异形世代交替的生活史, 由
大型的叶状配子体世代和微小的孢子体世代构成。孢
子体世代主要有垫状体、类垫状体和丝状体三种形式
(邢永泽等, 2010)。萱藻丝状体是实验室扩增的主要
对象 , 而且丝状体能够形成单室孢子囊并释放游孢
子 , 进而发育成叶状体 , 因此是种质保存的最佳材
料。关于萱藻种质保存的研究目前国内外尚未见报道,
本研究用包埋脱水法对萱藻丝状体进行保存 , 探讨
了预培养蔗糖浓度和时间、胶球含水量、化冻温度、
胶球恢复时间对冻存后萱藻丝状体存活率和生长发
育能力的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
萱藻成熟叶状体于 2012 年 4 月采自长岛自然海
5期 庄 琰等: 包埋脱水法超低温保存萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体的研究 991
区。将叶状体用消毒棉棒反复擦洗干净后阴干刺激并放
散雌、雄配子, 雌、雄配子结合后培养约一周形成黄褐
色丝状体, 收集丝状体在光照培养箱中扩增培养。培养
条件为(22.0±0.5)°C, 光强 86.4—97.2μmol/(m2·s), L︰
D=14︰10, 培养液为 F1培养液(高伟等, 2012)。当丝
状体培养至褐色时即可作为保存材料。
1.2 实验方法
1.2.1 包埋 将上述丝状体材料用搅拌器打碎至
约 500—600μm长的小段, 用消毒筛绢过滤掉培养液,
再用灭菌海水冲洗两遍后将丝状体小段与 3%的褐藻
酸钠溶液混匀。然后用 10mL注射器将藻液滴入含有
0.1mol/LCaCl2的 3%的 NaCl 溶液中, 轻轻摇动混合
液, 约 20min后胶球硬化完成包埋过程。通过控制针
头到液面的高度以及藻液滴入的速度 , 可将胶球的
直径控制在 3mm左右。
1.2.2 胶球的蔗糖预培养 将完成固定化的胶球
置于不同浓度的蔗糖溶液中, 在室温(22.0±0.5)°C 及
黑暗条件下预培养不同的时间。蔗糖浓度梯度为 0、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol/L; 预培养时间
梯度设置为 0、2、4、6、8、10、12、24h。
1.2.3 胶球脱水与含水量的测定 胶球在蔗糖溶
液中预培养完成后 , 用吸水纸吸干胶球表面残留的
液体。以每 60 个胶球为一组称量鲜重并置于直径为
9cm的培养皿中, 将装有胶球的培养皿放在底部铺有
干燥硅胶且直径为 15cm 的大培养皿中, 盖上大培养
皿盖并用保鲜膜封口, 随即放入 21°C 的培养箱中在
黑暗条件下干燥脱水。胶球脱水 8h过程中, 每隔 0.5h
取出一个培养皿称取胶球脱水后的重量 , 通过烘干
(105°C, 4h)可测出胶球的干重。胶球脱水后的含水量
计算公式如下:
胶球脱水后的含水量=
胶球脱水后的重量 胶球干重
胶球鲜重 ×100%
1.2.4 胶球的冰冻保存及化冻 将脱水后的胶球
每 15个为一组放入 2mL的冻存管中, 密封后立即投
入液氮中保存。24h 后, 取出冻存管, 迅速放入不同
温度的恒温水浴锅中不停搅动, 约 20s后胶球表面白
色消失, 化冻完成。化冻温度梯度设置为 20、30、40、
50、60°C。
1.2.5 胶球的恢复、脱固定化与萱藻丝状体的恢复培
养 将化冻后的胶球放入装有消毒海水的 10mL
离心管中在 21°C 黑暗条件下恢复不同的时间, 然后
用含 0.05mol/L柠檬酸钠的 3%的 NaCl溶液对胶球脱
固定 , 胶球溶解后重新得到含有丝状体小段的混合
液。通过对混合液离心(2500r/min, 3min)得到萱藻丝
状体, 然后用添加了 F1 培养液的消毒海水重新悬浮
丝状体, 再将藻液置于扩增条件下恢复培养。胶球在
黑暗条件下恢复时间梯度设为 0、6、12、18、24、
48h。
1.2.6 存活率的测定 取恢复培养 2d 的丝状体悬
液 2mL 于离心管中, 加入等体积的 0.1%的中性红染
液进行染色, 30min 后离心去除染液, 并用消毒海水
重新悬浮丝状体。在显微镜下进行观测, 凡是被染成
红色的丝状体细胞即为活细胞。脱水后存活率和冻存
后存活率计算公式如下:
脱水后的存活率=
脱水后活细胞数占细胞总数的比例
脱水前活细胞数占细胞总数的比例 ×100%
冻存后的存活率=
冻存后活细胞数占细胞总数的比例
冻存前活细胞数占细胞总数的比例 ×100%
上述每组实验至少重复 2次, 每次实验同一处理
均设置三个平行样, 每个样品至少计数 2000 个细胞,
文中数据为 6个平行样品的平均值。
1.2.7 生长发育能力的鉴定 将完成脱固定化的
萱藻丝状体移至扩增条件下培养 , 定期观察丝状体
的生长发育情况。待丝状体长到一定量后置于(17.0±
0.5)°C, L︰D=10︰14, 光强 (28.0±2.7)μmol/(m2·s)条
件下诱导孢子囊, 阴干刺激孢子囊使其放散孢子, 观
察孢子的发育情况。
2 结果
2.1 脱水时间与胶球含水量的关系
由图 1可知, 在胶球脱水 8h内, 脱水速率逐渐降
低, 脱水过程大致可分成三个阶段。0—2h, 脱水速率
较高, 胶球含水量从 80.42%下降到 44.87%, 平均脱
水速率约为 17.78%/h; 2—5h, 胶球含水量从 44.87%
降至 18.22%, 平均脱水速率减小至 8.88%/h; 5—8h,
平均脱水速率进一步降低, 约为 4.26%/h, 8h 时含水
量为 5.45%。从整个脱水过程来看, 胶球的平均脱水
速率约为 9.37%/h。
2.2 胶球含水量对萱藻丝状体存活率的影响
胶球含水量对冻存前、后萱藻丝状体的存活率的
影响显著。实验结果显示(图 2), 随着胶球含水量的
降低, 冻存前丝状体的存活率呈下降趋势, 当含水量
降至 9.34%时, 丝状体存活率仍在 50%以上, 说明经
992 海 洋 与 湖 沼 45卷

图 1 脱水时间与胶球含水量的关系
Fig.1 The relationship between dehydration time and water
content of the beads
蔗糖预培养浓度和时间分别为 0.4mol/L和 4h, 胶球恢复 12h, 化
冻温度为 40°C


图 2 含水量对冻存前后萱藻丝状体存活率的影响
Fig.2 The effect of water content on survival rate of the
filaments of S. lomentaria before and after cryopreservation
蔗糖浓度和预培养时间分别为 0.4mol/L和 4h, 胶球恢复 12h, 化
冻温度为 40°C

蔗糖预培养后萱藻的抗脱水能力较强; 随含水量的
进一步降低, 冻存前丝状体的存活率大幅度下降, 当
含水量为 5.45%时 , 冻存前丝状体的存活率只有
12.51%。相比之下, 胶球含水量对冻存后丝状体存活
率的影响呈现不同的趋势 : 若胶球含水量高于
26.96%, 冻存后丝状体的存活率都为 0; 随着含水量
的降低, 冻存后丝状体的存活率逐渐升高, 当胶球含
水量为 15.01%时 , 存活率达到最高 , 约为 36.83%;
之后含水量进一步降低 , 冻存后丝状体的存活率也
随之降低。因此, 萱藻丝状体胶球含水量为 15%时最
有利于其冰冻保存。
2.3 蔗糖预培养浓度对萱藻丝状体存活率的影响
蔗糖是一种“复合型”冻存保护剂, 可提高细胞脱
水过程中的存活率并增强其抗冻能力。由实验结果可
知(图 3), 蔗糖预培养对冻存前、后萱藻丝状体的存
活率影响显著。若不用蔗糖进行预培养, 冻存前、后
丝状体的存活率均为 0。蔗糖浓度在 0.2—0.4mol/L
范围内, 随着蔗糖浓度的升高, 冻存前、后丝状体的
存活率均逐渐升高, 并在蔗糖浓度为 0.4mol/L 时达
到最大值, 分别为 74.84%和 35.18%。随蔗糖浓度的
继续升高, 冻存后的存活率逐渐下降, 0.8mol/L 时仅
为 13.15%; 而冻存前的存活率也缓慢下降, 但都保
持在 60%以上。因此 , 蔗糖预培养的最佳浓度是
0.4mol/L。
2.4 蔗糖预培养时间对萱藻丝状体存活率的影响
图 4为蔗糖预培养时间对冻存前、后萱藻丝状体
存活率的影响。结果表明: 除 0h时, 冻存前、后丝状
体的存活率均为 0以外, 从 2—24h, 冻存前丝状体的
存活率基本一致, 都在 70%左右, 说明萱藻丝状体对
高浓度蔗糖有较大的适应性; 而冻存后丝状体的存
活率呈现先增大后减小的趋势, 并在 6h 时达到最大
值 50.08%。可见, 蔗糖预培养 6h 可大幅度提高冻存


图 3 蔗糖浓度对冻存前后萱藻丝状体存活率的影响
Fig.3 The effect of sucrose concentration on survival rate of the
filaments of S. lomentaria before and after cryopreservation
胶球含水量为 15%, 蔗糖预培养时间为 4h, 胶球恢复 12h, 化冻温
度为 40°C


图 4 蔗糖预培养时间对冻存前后萱藻丝状体存活率的影响
Fig.4 The effect of preculture time on survival rate of the
filaments of S. lomentaria before and after cryopreservation
胶球含水量为 15%, 蔗糖浓度为 0.4mol/L, 胶球恢复 12h, 化冻温
度为 40°C
5期 庄 琰等: 包埋脱水法超低温保存萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体的研究 993
后萱藻丝状体的存活率。
2.5 化冻温度对萱藻丝状体存活率的影响
实验结果显示(图 5), 化冻温度对存活率有极大
的影响。若在 20°C 条件下对胶球化冻, 存活率仅为
8.78%; 当化冻温度为 40°C 时, 存活率最高, 可达
50.64%; 而当化冻温度为 60°C 时 , 存活率降至
20.53%。由此说明, 化冻温度过高或者过低都会对胶球
化冻过程产生不利的影响, 40°C可达到最佳化冻效果。


图 5 化冻温度对萱藻丝状体存活率的影响
Fig.5 The effect of thawing temperature on survival rate of the
filaments of S. lomentaria
胶球含水量为 15%, 蔗糖浓度和预培养时间分别为 0.4mol/L和 6h,
胶球恢复 12h

2.6 胶球恢复时间对萱藻丝状体存活率的影响
胶球化冻后置于消毒海水中在黑暗条件下进行
恢复, 使脱水的胶球进行“复水”。实验结果表明(图
6): 如不对胶球进行恢复, 萱藻丝状体的存活率只有
18.92%; 胶球恢复时间长于或短于 18h都会降低存活
率, 当胶球恢复 18h 时, 萱藻丝状体存活率最高可达
54.79%。因此, 胶球在黑暗条件下恢复 18h效果最好。


图 6 胶球恢复时间对萱藻丝状体存活率的影响
Fig.6 The effect of recovery time of the beads on survival rate
of the filaments of S. lomentaria
胶球含水量为 15%, 蔗糖浓度和预培养时间分别为 0.4mol/L和 6h,
化冻温度为 40°C
2.7 冻存后萱藻丝状体生长发育能力的观测
将脱固定后的萱藻丝状体移入扩增条件下恢复
培养, 恢复一个月的萱藻丝状体长势良好, 且与未冻
存的萱藻丝状体并无差别(见图 7a, b)。另一方面, 冻
存后的萱藻丝状体具有生长发育能力 , 能够形成正
常的孢子囊并释放孢子 , 而且释放的孢子能发育成
正常的幼叶状体(见图 7c—f)。由此, 我们认为包埋脱
水法适用于萱藻丝状体的种质保存。
3 讨论
在高等植物的种质保存中, 包括两步法、包埋脱
水法、玻璃化法以及包埋-玻璃化法等在内的多种超
低温保存法均已成功得到运用 , 而对于藻类种质保
存来说, 更多采用的是两步法和包埋脱水法。就目前
各种包埋脱水法的研究来看 , 胶球的蔗糖预培养和
含水量是影响生物材料冻存后存活率的两个重要因
素 , 而不同的生物材料对预培养和含水量的要求也
不尽相同。
用包埋脱水法保存种质 , 细胞须脱水至细胞溶
质充分浓缩到热力学的凝固点以下 , 避免冰晶的形
成(Stillinger, 1995)。细胞若未充分脱水, 则会在冻存
和复苏的过程中遭遇冰晶的伤害而降低冻存后的存
活率(Day et al, 2000)。保存材料的种类不同, 其最适
含水量亦有较大的差异。对高等植物材料来说, 其最
适含水量范围变化较大, 如体胚为 13%—20%, 而茎
尖和分生组织多为 20%—40%(王君晖等, 1999)。已报
道的几种大型海藻的最适含水量一般在也在 20%—
40%左右, 如海带配子体的最适含水量为 40%(Zhang
et al, 2008), 裙带菜配子体的最佳含水量是 25%(王起
华等, 2005), 而坛紫菜自由丝状体在含水量在 16%—
40%范围内 , 都可保持较高的存活率 (王起华等 ,
2000)。本研究发现, 萱藻丝状体有较宽的脱水范围,
当含水量为 9%时, 其冻存前的存活率仍在 50%左右。
但冻存后萱藻丝状体的存活率范围较窄 , 只有当含
水量低于 27%才可存活, 并且在含水量为 15%时可达
到最佳效果。
蔗糖是一种“复合型”冻存保护剂, 它既可以作为
细胞内也可作为细胞外保护剂。通过对胶球进行蔗糖
预培养, 一方面可以使细胞适度脱水, 另一方面又可
提高细胞外液的浓度, 减少细胞内冰晶的生长(刘涛
等, 2006)。高等植物材料预培养时一般选用的蔗糖浓
度为 0.3—0.75mol/L, 有些研究所用的蔗糖浓度甚至
高达 1.0mol/L, 但 0.75mol/L 更为常用(王君晖等,
994 海 洋 与 湖 沼 45卷

图 7 冻存前后萱藻丝状体生长发育的比较
Fig.7 Comparison between cryopreserved and non-cryopreserved filaments of S. lomentaria in the growing development
a. 冻存前萱藻丝状体; b. 冻存后萱藻丝状体; c. 冻存前萱藻丝状体形成的孢子囊; d. 冻存后萱藻丝状体形成的孢子囊; e. 由冻存前萱藻
丝状体放散的孢子发育成的幼叶状体; f. 由冻存后萱藻丝状体放散的孢子发育成的幼叶状体

1999)。蔗糖培养时间一般为 1d, 有些可达 3—10d
(Mari et al, 1995)。关于对藻类进行蔗糖预培养的报道
并不多见 , 有研究证明掌状海带配子体的最佳蔗糖
预培养浓度和时间分别为 0.3— 0.4mol/L 和 6h
(Vigneron et al, 1997)。本研究证明, 蔗糖可大幅度提
高萱藻丝状体的抗脱水能力和抗冻能力, 对冻存前、
后萱藻丝状体胶球的存活率有极大影响。若不用蔗糖
进行预培养 , 萱藻丝状体会因过度脱水和冻存过程
中冰晶的形成而死亡。萱藻丝状体的最佳蔗糖预培养
浓度和时间为 0.4mol/L 和 6h 左右, 而这与掌状海带
配子体具有相似性。
化冻操作对材料的存活率有很大影响(Dumet et
al, 2002), 一般采用快速化冻法, 即将冻存的材料迅
速移入 25—40°C 的恒温水浴锅中快速搅动, 直至最
后一粒冰晶消失。快速化冻法可有效阻止化冻过程中
细胞内冰晶的形成(Taylor et al, 1999 )。本研究探讨了
20—60°C 的化冻温度对萱藻丝状体存活率的影响 ,
证明了 40°C 是最佳的化冻温度, 温度太低会导致化
冻过程中冰晶的重新生成而损害细胞 , 而温度过高
又会对细胞自身产生不利的影响。因此, 选取合适的
化冻温度也是包埋脱水法的一个重要环节。
在包埋脱水法中, 对经历了脱水-冰冻-化冻过程
的胶球 , 在培养之初 , 还要经历一个“复水”的过程 ,
即恢复到正常含水量的过程(王起华等, 2006)。本研
究采取的恢复方法是将化冻后的胶球放入海水中在
黑暗条件下进行恢复, 在恢复开始时, 细胞会经历一
5期 庄 琰等: 包埋脱水法超低温保存萱藻(Scytosiphon lomentaria)丝状体的研究 995
个快速的复水过程。研究表明: 将化冻的萱藻丝状体
胶球恢复 18h, 能有效提高存活率; 恢复时间太短 ,
会导致“复水”不够充分; 恢复时间太长, 对细胞存活
有抑制作用。关于恢复方法对藻类冰冻保存影响的研
究鲜有报道(Taylor et al, 1999), 还有许多问题需要进
一步的探究。
将脱固定后的萱藻丝状体置于正常条件下进行
培养, 观察其生长发育能力。研究发现, 冻存后的萱
藻在初始生长阶段较多地以团状细胞形式存在 , 并
且颜色呈较浅的黄褐色, 随着培养时间的延长, 丝状
体慢慢从团状细胞伸出。充气培养一个月后, 可见呈
褐色念珠状的萱藻丝状体。冻存后的萱藻丝状体与冻
存前的丝状体在形态、结构上完全一致, 且经诱导后
能够产生孢子囊并释放孢子 , 孢子能发育成正常的
幼叶状体。以上说明, 包埋脱水法能够成功运用于萱
藻的种质保存。
综上所述 , 本研究首次采用包埋脱水法成功冻
存了萱藻丝状体。研究结果表明: 胶球含水量和蔗糖
预培养是影响冻存后萱藻丝状体存活率的关键因素,
为了提高冻存后的存活率 , 适宜将胶球脱水至较低
的含水量并采用较低的蔗糖浓度和较短的预培养时
间。另外, 对胶球进行快速的化冻以及适当的恢复也
可在一定程度上提高存活率。冻存后的萱藻丝状体有
较高的存活率, 而且经恢复后仍具有生长发育能力。
因此 , 包埋脱水法是保存萱藻丝状体一种较为理想
的方法 , 在以后的实验室萱藻种质保存以及萱藻种
质库构建过程中可以使用该方法。但是 , 本研究中
萱藻丝状体的最高存活率与已报道的经包埋脱水
冰冻保存后的坛紫菜丝状体 (王起华等 , 2000)等的
最高存活率仍有一定的差距 , 如何进一步提高萱藻
丝状体经包埋脱水超低温保存后的存活率仍需进
一步探究。
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996 海 洋 与 湖 沼 45卷
CRYOPRESERVATION OF FILAMENTS OF SCYTOSIPHON LOMENTARIA BY
ENCAPSULATION-DEHYDRATION
ZHUANG Yan, GONG Xiang-Zhong, GAO Wei, ZHANG Wen-Jian
(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)
Abstract Filaments of Scytosiphon lomentaria cyropreserved were used as the materials to study the impacts of
encapsulation-dehydration in terms of sucrose concentration, preculture time, water content of the beads, thawing
temperature and the recovery time of the beads, on the survival rate and the growth performance of the filaments. The
results are followed. The beads of S. lomentaria had highest survival rate after precultured in 0.4mol/L sucrose for 6 hours.
The optimal water content of the beads was relatively low, only about 15%; the survival rate was zero when water content
was higher than 27%. Temperature at 40°C was best for thawing the beads. The survival rate of S. lomentaria thawed could
be enhanced significantly after recovery in dark for 18h. Under the optimal conditions, the survival rate of the filaments
thawed could reach as high as 54.79%, and the recovered filaments were the same to those before cryopreservation. The
induced filaments could produce normal sporangia, and the spores released from the sporangia were able to grow into thalli.
Key words Scytosiphon lomentaria; filaments; encapsulation-dehydration; cryopreservation