全 文 ：北方园艺 2009(6):51～ 53 ·试验研究 ·
第一作者简介:杨丽娟(1984-),女 ,在读硕士, 从事园林植物培育
的研究。 E-mail:yangflower1220@126.com。
通讯作者:高素萍(1966-),女,博士,教授, 现主要从事城市生态及
园林植物应用研究工作。 E-mail:gsp65@126.com。
基金项目:四川省“十一五”育种攻关资助项目。
收稿日期:2009-01-16
秋水仙素离体诱导大花蕙兰多倍体试验
杨丽 娟1 , 高 素萍1 , 邹宗兰2 , 陈 　果3
(1.四川农业大学林学园艺学院 ,四川雅安 625014;2.阳春园艺有限公司 ,四川郫县 611700;3.成都市百花潭公园 ,四川成都 610072)
　　摘　要:在离体培养条件下 ,以大花蕙兰“红宝石”原球茎为材料 ,比较了秋水仙素浸泡法和
混培法在不同浓度 、不同处理时间诱导大花蕙兰体细胞染色体加倍的效果。结果表明:无论是用
秋水仙素溶液浸泡处理还是将秋水仙素加入培养基中混培处理 ,均可诱导大花蕙兰多倍体的产
生。但以后者混培法效果较好 ,在秋水仙素浓度为 3%,处理15 d的条件下 ,诱导率最高达30%。
对变异株进行细胞学观察后发现 ,染色体为 2n=4x=80 ,为四倍体;而二倍体对照染色体为2n=
2x=40。
关键词:大花蕙兰;秋水仙素;多倍体
中图分类号:S 682.2+9　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2009)06-0051-03
　　大花蕙兰(Cymbidium hybrid)是兰科(Orchidaceae)
兰属中的一部分大花附生种类及其杂交种 ,是世界上栽
培最普及的洋兰之一。我国于20世纪80年代开始从国
外引进大花蕙兰 ,对大花蕙兰的组织培养技术进行了不
少探索研究 ,一些品种建立了脱毒快繁体系[ 1-4] ,但有关
多倍体的诱导国内尚未见报道。多倍体植物普遍具有
器官巨大性 、抗性强 、新奇变异等特征 ,是花卉育种中重
要的种质资源[ 5] 。试验以大花蕙兰二倍体“红宝石”为
材料 ,利用秋水仙素进行多倍体诱导[ 6-8] ,创造大花蕙兰
多倍体新种质资源 ,为尽快培育具有自主知识产权的大
花蕙兰新品种奠定基础。
1　材料与方法
1.1　供试材料
二倍体大花蕙兰“红宝石”(C.Ruby Shower`Mu-
rasakin Okimi )由四川农业大学园林苗圃提供 ,取其侧
芽作为诱导外植体 ,灭菌后接种到培养基上诱导原球
茎 ,以原球茎作为多倍体诱导的材料。
1.2　多倍体的诱导
1.2.1　浸泡法　将增殖培养20 d的具有旺盛分生能力
的原球茎 ,在无菌条件下切割为 0.5 cm3 的小块 ,放入
0.5%、1%、3%、5%的秋水仙素溶液中浸泡 24 、48 、72 h
后取出 ,无菌水冲洗3 ～ 5次 ,转入不含秋水仙素的培养
基1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/ L+AC 1.5
mg/L+椰汁 100 mL/ L中进行分化培养。以未经秋水
仙素处理的原球茎为空白对照 ,培养温度(25±1)℃ ,光
照强度 1 000 ～ 2 000 lx ,每日光照 10～ 12 h ,观察其形态
变化。每处理原球茎数为 90块(每块由 6 ～ 8个单个原
球茎组成)。
1.2.2　混培法　将增殖培养20 d的具有旺盛分生能力
的原球茎 ,在无菌条件下切割为0.5 cm3 的小块 ,转入含
有秋水仙素浓度分别为 0.5%、1%、3%、5%的培养基
1/2MS+6-BA 1.0 mg/ L+NAA 0.3 mg/L +AC 1.5
mg/L+椰汁100 mL/L中 ,分别处理 7 、15 、30 d ,每处理
原球茎数为90块。处理完毕后转入不含秋水仙素的分
化培养基 1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/ L+
AC 1.5 mg/ L+椰汁 100 mL/ L中进行分化培养。以未
经秋水仙素处理的原球茎为空白对照。
1.3　多倍体的稳定
选择形态变异明显的不定芽和原球茎 ,继续在
MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+AC 1.5 mg/L+
椰汁100 mL/ L培养基上培养 ,重新诱导长出丛生芽 ,从
中选择变异明显的植株进行鉴定 ,对鉴定为多倍体的植
株进行扩繁 ,以获得纯合的多倍体植株[ 9] 。
1.4　倍性鉴定
形态鉴定:以外部形态作为初步判断 ,观察植株根、
茎 、叶是否有明显膨大或变异。染色体鉴定:对有明显
变异的植株 ,当根生长到2 ～ 3 cm ,切取生长旺盛 、洁白
的根尖 ,采用改良苯酚品红染色法制片 ,在显微镜下观
察并照像 ,观察其染色体数目的变化 ,根据染色体数判
断其倍性[ 10] 。
2　结果与分析
从试验结果可以看出 ,未经秋水仙素处理的原球茎
无染色体倍性变异出现 ,说明即使在离体培养条件下发
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·试验研究· 北方园艺 2009(6):51～ 53
生染色体倍性变异的频率极低 ,要获得染色体倍性变异
必须经过人为干预。
经细胞染色体鉴定表明 ,采用秋水仙素溶液浸泡处
理法和秋水仙素加入培养基处理法都可获得一定频率
的多倍体细胞。二倍体细胞染色体数为 2n=2x=40(图
2),而四倍体细胞染色体数为 2n=4x =80(图3)。诱变
后对大花蕙兰幼苗进行观察发现:大部分诱变植株与对
照植株相比表现为分化晚 ,真叶长出后表现畸形 、扭曲 、
肥厚 、颜色深绿等。
2.1　浸泡法的诱导效果
秋水仙素浸泡法处理大花蕙兰“红宝石”原球茎的
结果如表 1所示 ,部分原球茎产生了多倍体变异。当秋
水仙素浓度为 0.5%时 ,只有处理 72 h 的发生 3.3%的
变异。当秋水仙素浓度 1%、处理72 h和浓度 3%、处理
48 h诱变率比较高 ,分别为 21.1%、23.3%。秋水仙素
浓度 3%处理时 ,整体变异率最高 ,可视为原球茎诱导多
倍体的适宜处理浓度。经秋水仙素处理的原球茎在转
入分化培养基后前期生长缓慢 ,这种现象随着处理浓度
的升高或时间的延长而加剧 ,相同浓度下处理时间与原
球茎死亡率成正相关。当秋水仙素浓度5%时 ,死亡率
较高 ,最高达41.1%,对原球茎的伤害最大。
2.2　混培法的诱导效果
　　表 1 浸泡处理对大花蕙兰“红宝石”多倍体诱导的影响
　　Table 1 The inducing effects of immersing of PLBS of` Murasakin Okimi
秋水仙素
Concentration of colchicine/ %
处理时间
Time o f soaking/ h
接种数 Number
of inoculation/个
死亡数
Number of death
死亡率
Rate of death/ %
变异数Number
of inducing/个
变异率Rate
of inducing/ %
CK - 90 0 0.0 0 0.0
0.5 24 90 0 0.0 0 0.0
48 90 0 0.0 0 0.0
72 90 4 4.4 3 3.3
1 24 90 3 3.3 2 2.2
48 90 7 7.8 6 6.7
72 90 10 11 19 21.1
3 24 90 4 4.4 13 14.4
48 90 8 8.9 21 23.3
72 90 15 16.7 18 20.0
5 24 90 11 12.2 12 13.3
48 90 19 21.1 8 8.9
72 90 37 41.1 10 11.1
　　如表 2所示 , 秋水仙素混培法对原球茎的诱导效果
因处理浓度和时间的不同而异。0.5%的秋水仙素对原
球茎伤害最小 ,但诱变效果较差 ,即使延长处理时间也
无法得到加倍植株。随着秋水仙素处理浓度的增加 ,诱
变效果逐渐增强 ,在附加 3%秋水仙素的培养基中处理
15 d和1%的培养基中处理 30 d ,原球茎的诱导率最高 ,
分别达 30%和27.8%。但过高的秋水仙素浓度会对丛
芽产生较大的毒害作用 ,在含 5%秋水仙素的培养基中
处理 15 、30 d后 ,原球茎的死亡率达 14.4%和 18.9%。
即使已发生加倍的植株生长也非常缓慢。
　　表 2 不同浓度秋水仙素混培原球茎的结果
　　Table 2 The inducing effects of adding colchicines in medium for PLBS of `Murasakin Okimi
秋水仙素
Concentration of colchicine/ %
处理时间
Time of soaking/ d
接种数Number
of inoculation/个
死亡数
Number of death
死亡率
Rate of death/ %
变异数 Number
of inducing/个
变异率 Rate
of inducing/ %
CK - 90 0 0.0 0 0.0
0.5 7 90 0 0.0 0 0.0
15 90 0 0.0 0 0.0
30 90 2 2.2 0 0.0
1 7 90 0 0.0 2 2.2
15 90 2 2.2 6 6.7
30 90 5 5.6 25 27.8
3 7 90 2 2.2 9 10.0
15 90 4 4.4 27 30.0
30 90 8 8.9 14 15.6
5 7 90 3 3.3 5 5.6
15 90 13 14.4 14 15.6
30 90 17 18.9 7 7.8
2.3　多倍体的鉴定
2.3.1　外部形态　大花蕙兰“红宝石”四倍体试管苗比
二倍体苗生长旺盛 ,叶片宽大而肥厚 ,表面粗糙 ,颜色深
绿 ,茎秆粗壮。叶片比二倍体大而厚 ,甚至叶形都发生
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了显著的变化 ,叶形由狭长变为钝圆。将对照和变异的
植株在形态上作对比 ,如图 1所示。
2.3.2　染色体鉴定　选择外部形态变化明显的试管苗 ,
取其分裂旺盛茎尖进行染色体观察 ,发现除了一小部分
为四倍体之外 ,变异植株中大部分为嵌合体 ,其中染色
体数为 2n=40(图 2)、2n=80(图 3),还有少数存在一些
非整倍体。混倍体类型的植株 ,其形态也表现为嵌合体
的形态特征 ,如:茎扭曲 ,叶片卷曲 、变形等。
3　讨论
试验中发现 ,经过不同浓度秋水仙素的处理后 ,原
球茎的分化时间明显比对照长 ,且秋水仙素的浓度越
高 ,处理时间越长 ,分化就越晚。说明 ,秋水仙素对原球
茎的分化及幼苗的生长均有一定的抑制作用。
秋水仙素浸泡处理法与混培处理法比较而言 ,秋水
仙素溶液浸泡处理法对原球茎的伤害较直接 ,而且要经
过多次的转移和冲洗 ,增加了受污染的几率。所以秋水
仙素溶液浸泡处理法不论在操作还是在加倍效果上均
不如秋水仙素加入培养基处理法。
在染色体观察鉴定过程中 ,在变异植株中观察发现
部分细胞染色体数为非整倍体 ,对其产生的原因及影响
有待进一步的研究。对产生的嵌合体 ,需进一步分离纯
化。现已有部分四倍体材料练苗移栽成活 ,将进一步在田
间对其性状进行观察 ,并开展田间的一系列试验及对比测
试 ,期望筛选出具大花、奇花 、抗病性好等优良商品性状的
品系 ,获得具有自主知识产权的大花蕙兰新品种。
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Primary Studies on Polyploid Induction of Cymbidiumhybrid In Vitro
YANG Li-juan1 , GAO Su-ping1 , ZOU Zong-lan2 , CHEN Guo3
(1.Fo restry and Ho rticulture College , Sichuan Agricultural University , Yaan , Sichuan 625014 , China;2.Sichuan Provincial Yangchun Ho rti-
culture Co.Ltd , Pixian , Sichuan 611700 , China;3.Baihuatan Park of Chengdu , Chengdu , Sichuan 610072 , China)
Abstract:The PLBS of C.Ruby Shower `Murasakin Okimi were treated with colchicines for two different condition in
vitro.The results showed that polyploidy callus was obtained by colchicines soaking or by adding colchicines into the
medium.The latter method was better than the former one.The best result for inducing tet raploid was by adding colchi-
cines 300 mg/L into the medium treated for 15 days , the inducing rate was up to 30%.The chromosome number of the
tet raploid w as 2n=2x=40 ,while that of diploid was 2n=4x=80.
Keywords:Cymbidium hybrid ;Colchicine;Polyploid
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