全 文 ：·基础理论研究 ·
孔石莼和条斑紫菜凝集素对鲫鱼免疫活性物的诱导作用
李丹彤 1＊ ,吕景才 1 ,邢殿楼1 ,杨　滴1 ,李石磊 1 ,姜　川 2
(1.大连水产学院 农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室 , 辽宁 大连 116023;
2.华东理工大学 理工优秀生部 ,上海 200237)
摘　要:从孔石莼(UlvaPertusaKjellm)和条斑紫菜(PorphyraYezoensisUeda)中提取凝集素作为免疫增强
剂 ,来研究它对鲫鱼免疫活性的诱导作用 .实验结果表明 ,孔石莼和条斑紫菜凝集素的投喂组和灌喂组鲫鱼血
清中免疫活性物—凝集素 、溶菌酶 、过氧化氢酶 、超氧化物歧化酶的活力均高于对照组 , 其中:孔石莼凝集素的
投喂组免疫活性物分别比投喂对照组提高了 3.0、1.8、2.4、 0.2倍;条斑紫菜凝集素的投喂组免疫活性物分别
比投喂对照组提高了 3.0、1.6、0.7、0.8倍;孔石莼凝集素的灌喂组免疫活性物分别比灌喂对照组提高了 3.0、
1.6、2.3、0.6倍;条斑紫菜凝集素的灌喂组免疫活性物分别比灌喂对照组提高了 3.0、1.4、1.4、0.8倍.
关键词:孔石莼;条斑紫菜;凝集素;鲫鱼;免疫活性物
中图分类号:S942.1　　　文献标识码:A　　文章编号:1003-0972(2007)03-0309-04
TheInductionofImmunitySubstanceinCassiasAuratusby
LectinsofUlvaPertusaandPorphyraYezoensis
LIDan-tong1 , LVJing-cai1 , XINGDian-lou1 , YANGDi1 , LIShi-lei1 , JIANGChuan2
(1.KeyLaboratoryofMaricultureandBiotechnologyMinistryofAgriculture, DalianFisheriesUniversity, Dalian116023, China;
2.DepartmentofExcellentStudentsofScienceandTechnology,
EastChinaUniversityofScienceandTechnology, Shanghai200237, China)
Abstract:LectinsextractedfromUlvaPertusaandPorphyraYezoensiswereusedasimmunity-
stimulantstostudytheimmuneactivityonCasiasauratus.Theresultsshowtheagglutinativeactivity,
lysozymeactivity, CATactivityandSODactivityinserumofCasiasauratusincreasedthanthatof
controlgroup.TheimmuneactivityofthegroupfedlectinfromUlvaPertusawas3.0、1.8、2.4 and
0.2 times, respectively, thanthatofcontrolgroup.Theimmuneactivityofthegroupfedlectinfrom
PorphyraYezoensisgroupwas3.0、1.6、0.7 and0.8 times, respectively, thanthatofcontrolgroup.
TheactivityofinfusinglectinfromUlvaPertusawas3.0、1.6、2.3、and0.6times, respectively, than
thatofcontrolgroup.TheimmuneactivityofthegroupinfusedlectinfromPorphyraYezoensiswas
3.0、1.4、1.4 and0.8times, respectivelythanthatofcontrolgroup.
Keywords:UlvaPertusa;Porphyrayezoensis;cassiasauratus;Lectin;immunitysubstance
　　随着养殖业的发展 ,病害问题日益严重 ,提高
动物自身免疫能力是抗病的途径之一 .LALL和
OLIVIER发现服用维生素 C可以提高养殖鱼的抗
病能力 [ 1] , WAAGBO[ 2]认为维生素 C可以提高大
西洋鲑的抗病能力 .凝集素是一类非免疫起源的
蛋白质或糖蛋白 ,具有抗菌 、激活淋巴细胞等多种
功能 ,孔石莼和条斑紫菜的生物量较大 ,孔石莼凝
集素的分离纯化及性质研究[ 3]已有报道 ,经筛选
条斑紫菜凝集素的活性及含量也较高 ,而凝集素对
鲫鱼免疫活性物的诱导作用未见报道 ,本文研究了
孔石莼和条斑紫菜凝集素对鲫鱼免疫活性物的诱
导作用 .
　收稿日期:2006-10-26;修订日期:2007-01-23;＊.通讯联系人 , E-mail:lidantong@dlfu.edu.cn
　基金项目:大连市科学技术基金项目 [ 2003] 445号
　作者简介:李丹彤(1965-), 女 ,辽宁营口人 , 副教授 ,硕士 , 主要从事生物化学研究 .
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信阳师范学院学报:自然科学版 JournalofXinyangNormalUniversity
第 20卷　第 3期　2007年 7月 NaturalScienceEditionVol.20 No.3Jul.2007
1　材料和方法
1.1　试验材料
条斑紫菜 (PorphyraYezoensisUeda)、孔石莼
(UlvaPertusaKjelm)于 2004年 3月 12日采于大
连黑石礁海域 .鲫鱼(Casiasauratus)购于大连市
香炉礁鱼市;鲫鱼体长 10 ～ 13cm,体重 32 ～ 41 g.
新西兰兔 ,体重 2.3 kg,购于大连医科大学动物实
验中心 .溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)冻
干粉(为 Sigma公司生产),生理盐水(大连德泽制
药有限公司生产),其他均为国产分析纯 .
1.2　方法
1.2.1　凝集素的制备　参照文献 [ 3]略有改动:
条斑紫菜 、孔石莼采回后立即用过滤海水洗净 ,用
纱布及滤纸吸去水分 ,放入 -20 ℃冰箱中冷冻 ,解
冻后阴干 ,然后置于电热鼓风干燥机中烘干(40 ～
50 ℃).将烘干的条斑紫菜用超速捣碎机研磨成
粉末 ,放入密封袋内保存 .将干粉用 PBS缓冲液
(0.15 mol/LNaCl, 0.015 mol/LNa2HPO4 -
NaH2PO4 , pH7.2)以 1∶10(w∶v)浸泡 16 h,并间歇
搅拌 ,以 4 000r/min离心 30 min,取上清液即为粗
提液 .
1.2.2　配合饲料的制备　将鱼饲料粉碎 ,加入凝
集素(0.6L/kg),制成配合饲料 ,备用 .
1.2.3　凝集活力的测定　先将注射器 、针头消毒 ,
然后用 1%的肝素钠润洗针头﹑针筒及离心管 ,兔
耳后静脉用 70%酒精消毒 ,抽取兔血 ,用生理盐水
洗涤离心 4次(4 000 r/min, 10 min),每次弃去上
清液 ,并用生理盐水稀释 ,最后用 0.9%的生理盐
水配成 2%的红细胞悬液 .在 96孔 V型血凝板上
用 40 μL凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀
释后 ,加入 2%红细胞悬液 40 μL,混匀 ,室温静置
2 h后 ,肉眼观察 ,无凝集现象时红细胞沉积在 V
型孔底部 ,呈大红点状 ,有凝集现象时呈网状不下
沉 .血凝活力以能产生凝集现象的凝集素最大稀
释倍数表示 [ 3] .
1.2.4　分组试验　鲫鱼运回实验室后 ,放于 40 L
塑料水槽内暂养 ,每天换水 2次 ,连续充气 .待鲫
鱼在实验室稳定 7 d再进行实验 .
设 6个实验组 ,分别为条斑紫菜灌喂组与投喂
组 、孔石莼灌喂组与投喂组 ,灌喂对照组与投喂对
照组 ,每组 1水槽 , 1水槽 8尾 ,一天换 2次水 ,水
温在 16.2 ～ 19.4 ℃,连续充气 .灌喂组每天 09:
00对鲫鱼鱼进行灌喂 ,每尾鱼灌喂 1mL凝集素粗
提液 ,每天灌喂 1次 ,灌喂对照组每尾鱼灌喂 1 mL
生理盐水;投喂组每天在 09∶00, 16∶00时将配好
的饲料对鲫鱼鱼进行投喂 ,投喂对照组投喂基础饵
料 ,投饵量以略有剩余为准 .投喂 15 d和灌喂 10
d后 ,从尾鳍基部抽取血淋巴液 ,在 4℃冰箱放置 2
h后 ,以 3 000 r/min转速离心 15 min,取出上层血
清 ,将 8尾鱼血清混合 ,对血清中的凝集素 、溶菌
酶 、超氧化物歧化酶 、过氧化氢酶进行活力测定 .
1.2.5　过氧化氢酶 (CAT)活力的测定 　将 65
μmol/L的过氧化氢置于 37 ℃的水浴中 5 min,分
别在对照管 、标准管 、测定管各加入 1.0 mL65
μmol/L的过氧化氢 ,并在对照管 、标准管各加入
1.0 mL35mmol/L钼酸铵 ,再在对照管 、测定管加
入 0.2 mL血清 ,标准管加入 0.2 mL缓冲液 (67
mmol/LNa2HPO4 -KH2PO4 pH7.4),然后将对照
管 、标准管 、测定管置于 37 ℃水浴中准确保温 60 s
后 ,立即向测定管加入 35mmol/L钼酸铵 1.0mL,
摇匀 ,用 0.5 cm的比色皿 , 10 min后于 405 nm以
蒸馏水调零比色 ,记录光密度值 A[ 4] .
CAT活性(U/L)=[ (A对 -A测)/A标 ] ×
　　(65×1×10-3 ×1000 /0.2)=
　　[ (A对 -A测)/A标 ] ×325, (1)
式(1)中 65为标准管 H2O2浓度 65 μmol/L, 1为
1.0 mLH2O2体积 , 0.2为 0.2mL血清量.
CAT活力单位定义为每分钟分解 1μmol的过
氧化氢为 1个酶活力单位(U).
1.2.6　溶菌酶活力的测定　以溶壁微球菌为底
物 ,参照文献 [ 5]的方法测定溶菌活力 .用 0.1
mol/L的磷酸钾盐缓冲液(pH6.4)配成底物 (溶
壁微球菌)悬液(OD570 =0.3).取 3 mL该悬液于
试管内置冰浴中 10 min,再加入 50 μL待测血清 ,
混合 , 570nm测 A0值 .然后将试液移入 37℃温浴
中作用 30 min,取出后立即置于冰浴中 10 min终
止反应 ,测反应后的试液在 570 nm波长处的光密
度值 A.溶菌活力计算公式:
UL=(A0 -A)/A. (2)
1.2.7　超氧化物歧化酶(SOD)活力的测定　超氧
化物歧化酶活力的测定参照文献 [ 6] ,在 25 ℃,
4.5 mL50mmol/LpH8.3的 K2HPO4 -KH2PO4缓
冲液中加入 10 μL50 mmol/L的连苯三酚(用 10
mmol/L的盐酸配制),迅速摇匀 ,倒入光径 1 cm的
比色杯中 ,在 325 nm波长下每隔 30 s测 A值一
次 ,要求自氧化速率控制在 0.070 OD/min左右 .
SOD活性的测定与测连苯三酚自氧化速率相同 ,
310
第 20卷　第 3期 信阳师范学院学报:自然科学版 2007年 7月
在加入连苯三酚前加入待测 SOD样液 (一般为
10μL,可根据需要增减),测的数据按公式(3)计算
酶活性:
每毫升酶液活力单位(U/mL)=
　　{[ (0.070-加酶自氧化速率)/0.070]
　　 ×100%/50%}×反应液总体积 ×
　　酶样品液稀释倍数 /酶样品液体积. (3)
SOD活力单位定义为每毫升反应液中 ,每分
钟抑制连苯三酚自氧化速率达 50%的酶量为一个
活力单位 .
2　结果
2.1　凝集素的粗提
采用 40 ～ 50℃烘干的方法 ,从条斑紫菜及孔
石莼中分离出条斑紫菜和孔石莼凝集素 ,条斑紫菜
凝集素比活力是孔石莼凝集素的 1.7倍 .
表 1　凝集素的分离测定结果
Tab.1 Resultsofdeterminationforisolationoflectin
凝集素的来源 蛋白浓度 /mg· mL-1
血凝活力 U/
μg
比活力 /
U· mg-1
条斑紫菜 32.22 80.55 12.41
孔石莼 27.72 138.6 7.22
2.2　血凝活力
孔石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组 、灌喂组分别比
投喂对照组 、灌喂对照组的血凝活力提高了 3.0倍 .
2.3　溶菌酶活力
孔石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组分别比投喂对
照组提高了 1.8和 1.6倍;孔石莼 、条斑紫菜凝集
素灌喂组分别比灌喂对照组提高了 1.6和1.4倍 .
灌喂组比投喂组溶菌活力都高 ,其中灌喂对照组是
投喂对照组的 1.2倍 ,孔石莼凝集素灌喂组是投喂
组 1.1倍 , 条斑紫菜凝集素灌喂组是投喂组 1.1
倍 ,孔石莼凝集素组比条斑紫菜凝集素组溶菌活力
高 ,孔石莼凝集素投喂组 、灌喂组溶菌活力是条斑
紫菜凝集素投喂组 、灌喂组的 1.1倍(如图 2).
2.4　过氧化氢酶(CAT)活力
孔石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组和灌喂组相对
其各自对照组 ,过氧化氢酶活力均有较明显的提
高 ,孔石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组分别比投喂对
照组提高了 2.4和 0.7倍;孔石莼 、条斑紫菜凝集
素灌喂组分别比灌喂对照组提高了 2.3和1.4倍 .
孔石莼凝集素灌喂组是投喂组 1.9倍 ,条斑紫菜凝
集素灌喂组是投喂组 2.7倍 ,孔石莼凝集素组比条
斑紫菜凝集素组过氧化氢酶活力高 ,孔石莼凝集素
投喂组 、灌喂组过氧化氢酶活力分别是条斑紫菜凝
集素投喂组 、灌喂组的 2.0、1.4倍(如图 3).
图 1　不同凝集素对鲫鱼体内血凝活力的影响
Fig.1 Efectoflectinsonhemagglutinating
activityofCassiasauratus
图 2　不同凝集素对鲫鱼体内溶菌酶活力的影响
Fig.2 EfectoflectinsonlysozymeactivitiesofCassiasauratus
图 3　不同凝集素对鲫鱼体内 CAT活力的影响
Fig.3EfectoflectinsonCATactivitiesofCamsiusauratus
2.5　超氧化物歧化酶(SOD)活力
孔石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组和灌喂组相对
其各自对照组的超氧化物歧化酶活力均有提高 ,孔
石莼 、条斑紫菜凝集素投喂组分别比投喂对照组提
高了 0.2和 0.8倍;孔石莼 、条斑紫菜凝集素灌喂组
分别比灌喂对照组提高了 0.6和 0.8倍 .条斑紫菜
凝集素投喂组 、灌喂组分别是孔石莼凝集素投喂组 、
灌喂组过氧化氢酶活力的 1.5、1.1倍(如图 4).
3　讨论
3.1　凝集素活力
本实验证明 ,鲫鱼血清中存在天然凝集素因
子 ,凝集素活力为 21.鱼类血清中存在凝集素早就
有报道 ,罗依惠等 [ 7] 研究了草鱼血清中凝集素的
性质 ,凌善峰 [ 8] 研究了鲫鱼血清中凝集素的生物
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李丹彤 , 等:孔石莼和条斑紫菜凝集素对鲫鱼免疫活性物的诱导作用
学性质 .凝集素的存在 ,在一定程度上弥补了鱼类
的免疫功能的不足 ,它通过有效地识别和结合异己
物质 ,提高巨噬细胞对它们的吞噬 、杀灭作用而在
鱼体的免疫防御中起着重要的作用 .因此 ,鱼类凝
集素很可能作为鱼体防止外源微生物等入侵的一
道防线 ,是一种重要的免疫调节因子 ,它为鱼类免
疫机制研究和水产养殖鱼病防治提供了基础 .
经投喂和灌喂孔石莼 、条斑紫菜凝集素后 ,鲫
鱼血清的凝集素活力为 23 , 比对照组提高了
3.0倍 .推测可能是外源凝集素促进了鲫鱼细胞凝
集素的合成或对鲫鱼凝集素具有激活作用 .
图 4　不同凝集素对鲫鱼体内 SOD活力的影响
Fig.4EffectoflectinsonSODactivitiesofCamssiusauratus
3.2　溶菌酶活力
溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物
细胞壁的水解酶 ,它具有抗菌的功效 .孔石莼 、条
斑紫菜投喂组和灌喂组相对其各自对照组 ,溶菌活
力均有较明显的提高 ,说明孔石莼 、条斑紫菜凝集
素对鲫鱼血清免疫系统均有激活作用 ,这与陈孝萱
等 [ 9] 、李桂峰等 [ 10] 、鄢庆枇等 [ 11]用免疫添加剂来
研究银鲫鱼 、赤眼鳟 、大黄鱼免疫机能的结果相
似 .孔石莼投喂组和灌喂组的溶菌活力均比条斑
紫菜高 ,而提取的孔石莼凝集素比活力比条斑紫菜
低 ,这可能是因为孔石莼凝集素的组成和结构比条
斑紫菜凝集素更利于激活鲫鱼血清免疫系统 .灌
喂组比投喂组溶菌活力都高 ,这可能是灌喂方式使
鲫鱼产生应激性 ,溶菌活力升高 .
3.3　过氧化氢酶活力和超氧化物歧化酶活力
在所有的需氧生物中 ,都含有抗氧化防御系统
来防止内源代谢活性氧自由基产生 .这个系统关
键组成包括超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等 .超
氧化物歧化酶具有清除活性氧自由基的能力 ,同时
产生 H2O2 ,过氧化氢酶具有清除 H2O2的能力 .因
此这 2种酶在抗氧化防御系统中起着非常重要的
作用 .孔石莼 、条斑紫菜投喂组和灌喂组相对其各
自对照组 ,过氧化氢酶活力均有较明显的提高 ,超
氧化物歧化酶的活力也有提高 ,推测凝集素能激活
鲫鱼的免疫系统 ,增强其抗氧化能力 .
3.4　不同凝集素 、不同饲喂方式对鲤免疫活性物
的影响
不论是投喂还是灌喂 ,孔石莼组溶菌酶 、过氧
化氢酶活力都比条斑紫菜组高 ,而超氧化物歧化酶
活力条斑紫菜组比孔石莼组高 , 2种凝集素的凝集
活力是一样的 .
从凝集活力 、溶菌酶活力 、过氧化氢酶活力 、超
氧化物歧化酶活力测定结果中可以看出:灌喂对照
组活力均比投喂对照组高 ,这可能是由于灌喂这种
方式使鱼产生的应激性 .从这 4种活力测定结果
不能得出投喂与灌喂哪一种效果更好 ,但灌喂这种
方式费时 、费力 ,所以投喂这种方式比较适用 .
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责任编辑:任长江
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第 20卷　第 3期 信阳师范学院学报:自然科学版 2007年 7月