全 文 ：第 13 卷第 4期
1 9 89 年 1 2月
水 产 学 报
O U J R N
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覃研究简报羹
条斑紫菜果抱子的液氮保存 ’
P R E S E R V A T I O N O F C A R P O S P O R E S O F
L A V E R I N L I Q U I D N I T R O G E N
陈国宜
(上海水产大学 )
C h e n G u o y i
(月孔砚月 g加落夕镇子阶 r `己, 口月心勺呼犷` 落公夕 )
随着生物工程学的发展 , 在超低温下 ( 一 1 96℃ )保存生命有机体变得越来越重要 。 在超低温下生命
活动几乎停止 ,变异的频率降到很低的程度 , 可以提供稳定的种质〔“ 〕。 超低温保存生物体不需大量人力
和物力 ,也不需要巨大的空间 , 是种质保存的一种好形式 。 凡kn 工。 , B . J 等报道 , 到 19 85 年止 , 至少有
40 多种高等植物的组织 、 器官或细胞培养物在 一 19 6℃冷冻保存而不失去活力 t “ ’ 。 S at wn 。 。 i 利用特殊
的液氮贮存器保存 30 多种植物种子 『, ’ 。 在藻类方面报道成功保存培养物的资料也很多 ,其中 H W a o g ,
5
.
W
. 等人从 飞969 年保存 2 2 种单细胞藻类达 6一 8 年之久 t , ’ 。 陈国宜 , 网求登在液氮中成功保存坛紫
菜果抱子和海萝的四分抱子【“ , ,并提出用超低温保存法建立海藻抱子库的设想 。 为实现该设想 , 扩大保
存材料种类 , 最近我们研究了条斑紫菜果抱子的超低温保存后的 活力及再应只到斗产上的可能 性 。 结
果报告如下 。
材 料 与 方 法
1
甲 果抱子的采集与处理 从江苏省启东县养殖架上选绎几泉袍子成熟的 条斑紫菜作为种菜 , 阴干
后置于 一 l o O C冰箱中保存备用 。 果饱子放散及采染应用以前的方法川 。 果抱子收集到 仓, l 塑料离心管
中 , 加入保护剂即 ’可试验 。 与此同时一用另一支离心管的抱子计数抱子在冷冻前的自然死亡宝 。
2
. 冷冻保护剂的配制 冷冻保护剂浓度采用重量体积百分比浓度 (W了V 劣 ) , 用比重 1 . 0 2 0 的海
水配制 。 木试验所用的保护剂种类及浓度如下 :
单一保护剂 : 5万 , 10 男 , 15 那 D M默 ) (二甲亚飒 )
混合保护剂 : 1 . 功% D M S o + 8劣 G (葡萄搪 ) 十 10 澎 P E G〔聚乙二醇 ) 。
2
.
4 0形p G (丙二醇 ) + 1 0落G
3
.如 形 P G (丙二醇 ) 十 10 形 P E G
3
. 超低温保存程序 超低温保存程序有快速冷冻和缓慢降温两种 。 前者是将保存材料直接投入
液氮中保存 。 缓慢降温程序是采用自制的降温装置控制材料降温速度 , 从室温降至 。℃为 2 · 。℃厂m in ,
在 o o C停留 10 一 15 分钟 , 在 一 1℃以下的降温 , 以 1℃ /` i n 左右的速率降至 一 6。℃ , 然后投入液氮中保
存 。 解冻复温采取四种不同方法 。 第一种是用在。℃左右的水浴 , 第二种是用 3。℃左右的水浴 , 第三种
是放在 1 6一 2。℃的室温下 ,第四种是置于 犷 C左右的冰箱中。 在这四种条件下材料一旦全部冰融 , 复温
过程就告完成 。
上海水产大学 1邻今届毕业生耿绪云参加本项研究。 丝状体生产性培养在江苏省启东县国营养殖场进行 , 该
场技术员张 奎参加培养与采苗工作 。 在此一并致谢 。
收稿年月 : 1娜 8 年 8 月 ; 1卯 g 年 4 月修改 。
4 期 陈国宜 : 条斑紫菜果抱子的浓氮保存 3 5 7
4
, 抱子存活率检查 按以前的方法确定抱子存活率 〔君, 。 由于朱冷冻前种菜放散的抱子具有一定
程度的自然死亡率 (咖 ) ,因此 ,计算冷冻后的存活率 ( S ) , 需考虑冻前自然死亡率 。
吕 = S , ( 1 + 而 ) ( 1 )
这里 S, 为显微镜检查冻后抱子存活率 ,而 为冻前袍子自然死亡率 , 言 为冷冻实际存活率 。
弓. 保护剂的毒性试验 在抱子液中加入被试验的保护剂 , 从室温移到 。℃左右的冰箱中放置 30
分钟 , 然后除去保护剂 , 计数死亡抱子数和总泡子数 ,求出死亡率 D, ,再按下式计算保护剂毒性引起抱子
死亡率 D
D = D
, 一而 ( 2 )
6
` 抱子萌发率试验 将刻有定点标志的玻片一放在培养皿内 , 加入适量果抱子及海水 ,气L其附着 2
个小时后 ,定点检查活泡子数 ,然后在室温 20℃ , 光强 1。。。一 2O0 L 。 ,光 : 暗周期 1连: 10 小时条件下涪
养 4~ 5 夭 , 再计数萌发袍子数 , 求其萌发率 。
结 果
1
. 果抱子在离心前后的死亡率 因为果袍子在超低温保存前经过离心收集 , 而离心收集过程是
否会引起抱子的死亡 , 以前是不知道的 ,所以我们进行了离心前后抱子死亡率的测定 , 结果如表 1 , 其结
论是差异不显著 。
表 1 禽心前后条斑紫菜果抱子死亡率 比较
T a b l e I T加 e f fe e t o f o e n t r j f u g a t i o n o n t h e d e a t h 伴 r o e n t 压ge
o f e a r po s po r e g o f p o r , 凡习 r 口 勺 e 写 o e 耳 s 下s
差异 显著性判别 玉
’工 ( 3
.
3 )
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.幼 ,
x 取 0 . 沥 ` 毛工旧 = 1 , 2 2
下 = 1 甲 O< F 工 ( 3
.
3)
七 = 0 . 0良 < 七又 2
方差齐性
甲 ’ 接受 H o .
由表 1 可以看出 , 果饱子经离心后死亡率有所升高 ,但经统计学判别 , 可判定果泡子死亡率在离心
前后无显著变化 。 这样 ,前面方法中计算抱子存活率和毒性死亡率的公式 ( 1 ) 〔2) 才有可靠的根据 .
2
. 不同低温保护剂的保护效果 七匕胶了在快冻与慢冻条件下 , 不同保护剂的保护效果 , 结果见
表 2 。 在快冻条件下 , 以 40 形 E G + 加 劣 G 保护效果最好 ,存活率达 57 , 7落 , 比不加保护剂的对照组 (快
冻 )高出即形 , 但只接近慢冻对照组的存活率 。 单独以 D M S O 作保护剂的各种浓度快冻组 , 随 D M S O
浓度提高 ,存活率也上升 ,最高者达 6 1 甲 1绍。 在慢冻组中 , 单独用 10 形D溅 o , 或 10 芳 D M s o 、 8粥 G +
10 男 P E G 的混合保护剂 ,保存效果都很好 , 果抱子存活率均在 90 形以上 。 以 幼落皿 G + 10 苏 P E G 作为
保护剂 , 效果最差 , 果抱子存活率只有 49 . 4粥 。 在毒性死亡率一栏中可以看出 , 该组保护效果差的原因
是保护剂对果抱子有很强的毒害作用 。
比较快冻与慢冻两种情况下的抱子存活率 ,可以看到 ,慢冻的保存效果优于快冻。
弓二 不同融冰复温速率对果抱子存活率的影响 比较四种融冰复温速率对果抱子存活率的影 响 ,
结果表明 ,在不同融冰条件下所进行的复温过程 , 对果抱子的存活率无明显影响 。 见表 o3
4
、 果抱子萌发率及生产性采苗 分别以 10 男 D M S O和 10 劣 D州唱 O 十 3形G 十 10 侣 P E G作保护剂 ,
经冷冻保存后的果抱子与未冷冻泡子进行萌发率的对比试验 。 未冷冻对照组的萌发率比冷冻组略高 , 两
种保护剂的冷冻组萌发率接近 。 见表 4 。 经观察 , 冷冻保存后的果抱子萌发生长的丝状体与未冷冻组的
358 水 产 学 报 1 3卷
T ab l eZ
表 2 不同保护剂对条斑紫菜果抱子冷冻存活率的影响
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4〔 ]℃ 水浴
月` J℃水浴
.几℃卞 ;显
5℃冰箱
复温速率 (℃ m in ) 实 验 位 (存活万 )
1 1石 . 4
祀 . 4
9
。
2
6
。
4
9 6
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1
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、
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8 士 6 。 生
9 1
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7 士6 . 0
9 1
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3 士 5 ` 0
翎〕 . 7 土 2 . 9
邻郎盯舫
注 : 以 ] 。写 D M SO 作保护剂 , 冻存三夭再复温
表 4 冷冻与未冷冻果抱子萌发率的比较
T汕 l e 4 c om P a r l s i o n o f ge r m i n就 i o n 碘 r eC n t a g o b心 t w e o n t he f r o z e n
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u fn 恤 e n e ar OP sp 伽 o f P . 絮仑写 o e 井 , 主s
实 验 处 理 未 冷 冻 组 冷 冻 组
1 0万 D M S O D M SQ + G + P F G
萌发率 (男 ) 6 7 , 1 士 1 3 . 1 5 9 , 2 士 3 . 3 5石 . 9 士 4 . 7
丝状体没有什么变化 。
为了探讨冷冻保存的果抱子进行生产的可能性 , 4 月下旬在启东县国营海水养殖场利用冷冻保存后
的果抱子与未冷冻的果泡子进行贝壳丝状体生产性采苗 , 两组的贝壳采苗面积均为 3 M , 。 冷冻组投 果
抱子密度为 25 0 个 Zcln , ,未冷冻组为 30 0个 Zom Z 。 由于冷冻组投抱子密度小于对照组 , 加上冷冻后的泡
子经离心作用结成团块 ,解冻复温后难以分散到单个抱子的水平 , 所以从贝壳丝状体的生长情况看 , 冷
冻组比对照组藻落稀些 。 但从丝状体生长趋势估计 , 冷冻组的丝状体能达到生产要求 。 培养的两组丝
状体至秋季 , 成熟度好 ,各组丝状体放散的壳饱子健壮 ,于 9 月 28 目分别采苗的紫菜网帘 , 紫菜尚在海
区现场生长中。
讨 论
文献报道 , D M S O , G , P E G 是超低温保存植物材料的常用保护剂 ,而且三者混合使用效果更好川 。
最近我们单独使用 D M S O 超低温保存坛紫菜果抱子 〔” 和其他红藻饱子仁’ ]都得到良好的保护效果。 现在
我们在条斑紫菜果饱子冷冻保存中 , D五踢 O 单独使用或与 G , P卫G 混合使用都能获得 黝男以上的存活
率 , 而且混合使用 , 似平效果更佳 , 这证明在多种红藻抱子超低温保存中 D五15 0 有普遍的使用价值 。 在
4期 陈国宜 :条斑紫菜果抱子的液氮保存 3 59
人类白细胞超低温保存中有资料介绍 40男E G 午 1 D形G 或 40形 E G 十 1 0男 E PG 都有很好的保 护 效 果 ,
然而我们的试验证明 ,在快冻条件下 , 这些化合物保护效果是好的 , 但在慢冻条件下效果不佳 , 根据毒性
试验分析 ,是由于这些化合物对泡子有较大毒性的原故 。
冷冻保存生物材料的保护剂必须在使用范围无毒。 而这种毒性 , 推测在未结冰状态 (如我们在 o℃
试验的 )与结冰进行过程可能是不一样的 。 后一状态下产生的毒性 , 我们无法测出 , 所以本试验测定毒
性的资料只供参考用 。
在我们的试验中 ,快冻比慢冻的抱子存活率显著低得多 , 这与大多数研究结果相一致 〔 ” 。 在快冻中
抱子所含自由水不能及时一排出细胞 , 冷冻时形成胞内冰 , 引起细胞机械损伤 ,使抱子死亡 , 即使提高很高
浓度保护剂也只能达到 5。落存活率 。 缓慢降温能使抱子适当脱水 , 有效阻止胞内冰的形成 , 所以有较
高的存活率 。 这也就是慢冻法被广泛应用的原因 。
关于融冰复温速率对果抱子存活率没有 明显影晌 , 这与 N 。。 : u , M . 5 . 在盐沼藻类的液氮保存中
的结果是一致的『” 。 这是由于缓慢降温到 一 6。℃时 , 抱子得到充分脱水 ,胞内溶液十分浓稠 ,在解冻复温
时 ,无论复温逗度如何 , 不会出现重结晶 , 从而避免机械损伤 。
经液氮冷冻保存的果泡子萌发率略低于未冷冻组 , 可能是由于冻害的延续作用 。 但从冷冻果 抱子
萌发成丝状体以及生产性采苗试验看 , 超低温保存的果抱子再用于生产是可行的。
参 考 文 献
[ 1 〕
[ 2 了
[ 3 J
〔 4 ]
[ 5 ]
〔 6 ]
〔 7 〕
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F i n k ] 0
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C 了留。石功了叩夕. , 15 : 5 6 3一568 .
s 七a n d w o o d , p 』 C . , 19 8 6。 C r y o p er 册 r v a 七l如 o f eS ed 罗m p l胡m 生o r g抓。 t 主e e o n 弟 r v a t i叱 , I n 《 C r y -O
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、声 、片诊曰二曰浮` 诊曰韶诊夕萨 、萨 、` 约于夕岁孰卢枯还 冶￡ 七` 七￡、笋 、声 、澎我绪诊马乒嚼瞬飞J ` 、声诊三 、岁自 J ` 诊叭卢、卢毕、弃瞬 、群诊么岁气声砧述诊叭笋
[ 3 了
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朱 洗 、王幽蓄 , 1 9能 。 金鱼和编鱼卵球成熟的细胞学研究 。 实验生物学报 , 3 ( 1 ) : 1~ 3 3 。
人 ida , 时 a 忑, 1盯3 。 p b 丫, i o lo g i e a l , 七一1 ( l ”` , o n 学 l、吕山 d M五 t u扮 t i o n O f F i s he s , 1 . 头 x 妞 a l d i f f白二幻。 。 i n
e o m p叱 i七10几 o f p功。m , p r o 七e l n o f & y u 工n r 。恤士加n t o 卯 n a d a l m a 七u饰七或似 . B 心乙。`咖 oj 落肠 扣卿仆 e se 。卜
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z w a r e t , t e 且n , R . , I朋 7 . E 工邵 r i m e n t a l I n d uc 七i姐 o v u la t 止o n w i t h P r o 罗 s t。加 n e . 万。寸“ r o . 1韵 : 1 1 2 -