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第 39 卷第 4 期
2015 年 4 月
水 产 学 报
JOUＲNAL OF FISHEＲIES OF CHINA
Vol． 39，No． 4
Apr．，2015
文章编号:1000 － 0615(2015)04 － 0485 － 11 DOI:10． 11964 / jfc． 20140909475
收稿日期:2014-09-18 修回日期:2015-01-19
资助项目:国家“八六三”高技术研究发展计划(2012AA10A411) ;国家自然科学基金(41176151，41276177) ;福建省种业创新与产业
化工程(2014S1477-10)
通信作者:谢潮添，E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
坛紫菜 6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的
克隆及表达特征分析
史健志， 徐 燕， 纪德华， 陈昌生， 谢潮添*
(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)
摘要:6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶，在植物逆境胁迫应答中发挥着重
要的作用。实验以坛紫菜转录组测序获得的 unigene 序列为基础，采用 ＲACE 技术克隆获得坛
紫菜的 3条 TPS 基因序列:PhTPS1，PhTPS2-1 和 PhTPS2-2。序列分析结果表明，PhTPS1(收录
号:KM580358)序列全长 3 557 bp，包含一个 3 462 bp的开放阅读框，所编码的多肽包含 1 153个
氨基酸，分子量为 124． 2 ku，等电点为 6． 73，属于 TPSⅠ亚家族;PhTPS2-1(收录号:KM519457)序
列全长 4 264 bp，包含一个 4 044 bp的开放阅读框，所编码的多肽包含1 374个氨基酸，分子量为
145． 2 ku，等电点为 5． 96;PhTPS2-2(收录号:KM519458)序列全长3 733 bp，包含一个 3 324 bp的
开放阅读框，所编码的多肽包含 1 107 个氨基酸，分子量为120． 2 ku，等电点为 5． 42。PhTPS2-1
和 PhTPS2-2属于 TPSⅡ亚家族。基因表达水平的定量分析结果表明高温胁迫条件下，3 条
PhTPS基因的表达模式基本一致，均表现为先上调后下调，再上调的趋势;而 PhTPS1 和 PhTPS2-
1基因在中低水平的失水条件下，基因表达水平均没有发生显著变化，只在高水平失水胁迫下显
著上调，PhTPS2-2基因在中高水平失水条件下，表达水平显著上调。说明 PhTPS 基因可能只在
高度失水胁迫下发挥应激调节作用。
关键词:坛紫菜;6-磷酸海藻糖合成酶;ＲACE;荧光定量 PCＲ
中图分类号:Q 786;S 968． 4 文献标志码:A
海藻糖(trehalose)是一种广泛存在于生物界
中，由两个吡喃环葡萄糖分子通过 α-1，1 糖苷键
连接而成的非还原性双糖，是天然双糖中理化性
质最为稳定的一类糖质［1］。已有研究结果表明
海藻糖能够阻止细胞磷脂双分子膜由液晶态向固
态转变，起到稳定蛋白质及核酸等高分子物质的
作用，从而增强植物细胞对脱水、干旱、高温、冷
冻、高渗透压及有毒试剂等逆境条件的抵抗力，而
自然界中其他糖类如蔗糖、葡萄糖等，均不具备这
一功能［1 － 4］。
植物细胞中海藻糖的合成反应包括两步:首
先由 6-磷酸海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate
synthase，TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖和 6-磷酸
葡萄糖反应形成 6-磷酸海藻糖 (trehalose-6-
phosphate，T6P)，然后再由 6-磷酸海藻糖酯酶
(trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)水解 T6P
形成海藻糖［3］。由于植物细胞内广泛存在各种
非特异性的磷酸酯酶，可以催化 T6P 转化为海藻
糖，所以 TPP基因的表达对海藻糖的积累作用不
大，但 TPS基因的转录表达则对于植物细胞中海
藻糖的合成具有决定性作用［1］。在植物抗逆机
制研究中，TPS 基因已经成为继谷氨酸、脯氨酸、
甜菜碱合成酶基因之后又一个与抗逆相关的基
因，向植物中导入 TPS 基因以提高植物对非生物
胁迫的抵抗力已经成为抗逆植物基因工程的一个
重要研究方向［5 － 8］。
坛紫菜(Pyropia haitanensis)是我国南方沿
海广泛栽培的一种大型海藻，创造了可观的经济
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价值。但近年来，受全球气候变暖影响，海水水温
过高严重影响着坛紫菜栽培的产量和效益［9 － 11］。
此外，坛紫菜自然分布于潮间带的中高潮区，由于
受潮汐的影响，需经历周期性的失水和复水过程，
期间伴随着温度、水分、光照和盐度等环境因子的
激烈变化［12 － 13］。因此研究坛紫菜的抗逆机制，克
隆抗逆相关基因，对于后续海藻、乃至经济作物的
抗逆基因工程研究具有十分重要的理论和实际应
用价 值。目 前 已 经 在 条 斑 紫 菜 (Porphyra
yezoensis)、海带等 10 余种大型海藻中克隆获得
了 TPS 的全长基因［14 － 16］，在 GenBank 数据库中
也已经可以检索到 4 条坛紫菜的 TPS 基因，并且
青岛农业大学遗传研究室采用条斑紫菜 TPS 基
因转化水稻，利用 35S 启动子进行过表达，获得了
形态发育正常且耐盐、抗旱性显著提高的水稻植
株。本课题组前期在坛紫菜的转录组研究中，检
索到了 3 条序列与已克隆 TPS基因序列存在差异
的坛紫菜 TPS基因片段［13］，本研究对这 3 条坛紫
菜 TPS基因(PhTPS1，PhTPS2-1 和 PhTPS2-2)进
行全长克隆，并通过实时荧光定量 PCＲ 技术
(qPCＲ)比较这 3 条基因在高温和失水胁迫下的
表达特征，分析它们在坛紫菜胁迫应答中的作用，
以期为坛紫菜逆境胁迫响应机制的研究提供基础
资料。
1 材料与方法
1． 1 坛紫菜样品及胁迫处理
实验材料为人工杂交选育出的耐高温品系
Z-61，取自福建省坛紫菜种质资源库。将坛紫菜
Z-61 叶状体在适宜条件下［温度(21 ± 0． 5)℃，光
照强度 50 ～ 60 μmol /(m2 · s) ，光照周期
12L∶ 12D，每 3 天更换一次过滤的新鲜海水］培养
至(15 ± 2)cm 时，选取叶面平滑且生长健康的藻
体作为实验组，提取总 ＲNA，反转录成 cDNA 后
用于 TPS基因的全长克隆。
另取一组(15 ± 2)cm 的健康藻体，分别于
(29 ± 0． 5)℃的恒温光照培养箱中高温胁迫处理
(其余培养条件同适宜条件)0、3、6、12、24、48 h，
分别提取总 ＲNA，用于高温胁迫下基因表达水平
的 qPCＲ分析。
取(15 ± 2)cm 的健康藻体进行失水胁迫处
理，具体方法为用纱布轻压吸干藻体表面水分后，
置于干燥纱布上，置于 21 ℃，光照强度 50 ～ 60
μmol /(m2·s)的干燥箱内干燥失水。根据预实
验确定的干燥时间，分别取失水率为 0%、15%、
30%、45%、60%、75%及 90%的样品和干燥失水
至失水率为 90%后再浸泡于新鲜海水中培养 30
min后(复水)的样品提取总 ＲNA，用于失水胁迫
下基因表达水平的 qPCＲ 分析。失水率计算公
式为:
失水率(%)=［鲜重(mg)－失水后藻体重
(mg)］/［鲜重(mg)－干重(mg) ］× 100
以上每个处理，均设置 3 个生物学重复。
1． 2 引物及其序列
基因的 PCＲ 扩增、ＲACE 扩增、阳性克隆筛
选和基因的表达水平分析所用的引物序列均由上
海生工生物工程有限公司合成(表 1)。
1． 3 总 ＲNA的分离纯化
收集坛紫菜藻体 0． 1 g，滤纸吸干后液氮研
磨，采用 E． Z． N． A 植物 ＲNA 提取试剂盒
(OMEGA，德国)提取各样品的总 ＲNA。经凝胶
电泳检查所提取总 ＲNA 的完整性，并在 Cary50
紫外分光光度计(Varian，美国)上分别测定 OD260
和 OD280值，根据测定结果计算 ＲNA 的浓度，判
断核酸和蛋白质的污染情况。
1． 4 PhTPS基因的克隆
根据坛紫菜转录组数据库 unigene 的注释结
果，筛选出 1 条与坛紫菜 TPS 基因序列相似性为
99%的 unigene(Unigene6752)，2 条与皱波角叉菜
(Chondrus crispus)TPS 基因序列相似性分别为
58% 和 63% 的 unigene (Unigene8841，
Unigene10310)基因，进行 PhTPS 基因的克隆。
由于 Blast 序列比对分析时发现 Unigene8841 已
包含所编码基因 5端的起始密码子，因此根据
Unigene8841 的序列设计 5端普通 PCＲ引物和 3
端 ＲACE扩增的特异性扩增引物(GSP)和巢式
引物(NGSP)(表 1) ;而对于 Unigene6752 和
Unigene10310，则分别设计 5-和 3-ＲACE 扩增的
特异性扩增引物(GSP)和巢式引物(NGSP) (表
1)。PCＲ 30 μL 反应体系包含:15 μL Mix 预混
液(全式金，北京) ，1 μL cDNA(10 ng /μL) ，0． 5
μL 正向引物(20 μmol /L) ，0． 5 μL 反向引物(20
μmol /L) ，13 μL ddH2O。PCＲ反应程序:95 ℃变
性 5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 个
循环;72 ℃ 10 min。ＲACE 扩增参照 SMAＲTer
ＲACE cDNA Amplification Kit 试剂盒(Clontech，
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4 期 史健志，等:坛紫菜 6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析
美国)的指示说明进行。
以上所有扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离
后，采用 DNA 纯化回收试剂盒(TIANGEN，北
京)回收目的片段，与 PMD19-T 载体(TaKaＲa，大
连)连接后导入感受态细胞 E． coli DH5α中，筛选
出阳性克隆进行扩大培养，采用质粒小提试剂盒
(TIANGEN，北京)提取质粒后送往上海生工生
物工程股份有限公司测序。
表 1 实验中所用引物的名称和序列
Tab． 1 Name and sequence of primers for the experiment
用途
purpose
基因
gene
引物名称
primer name
引物序列
sequences(5-3)
PCＲ PhTPS2-1
T21F-5 GATCTACGACTCGGGCATGG
T21Ｒ-5 CTCCTCATTGACCCGCTTGT
全长扩增
ＲACE
PhTPS1
PhTPS2-1
PhTPS2-2
ＲT1GSP-5 CGGGCGTAGTCGTAGGTGTGAAAGC
ＲT1NGSP-5 CACCTTGTTCCGCATCGGCAAAAT
ＲT1GSP-3 CTGGCTGACCTCGCTACCCCCTC
ＲT1NGSP-3 GGTGTTCTCGTACCTGTCCACGTACATCA
ＲT21GSP-3 GCCCCTGGCAGACACGCCCAGTT
ＲT21NGSP-3 GTTGGCGACGACAAGTCTGATGAGC
ＲT22GSP-5 TCACCGCCTGATAGGCCTCCCAGTC
ＲT22NGSP-5 ACGTCACTGCCACGTACCGTGAGCG
ＲT22GSP-3 GGTGTGCTGTCGTCGTCGGGCGT
ＲT22NGSP-3 CCCACCGTAACGCCCATACCCG
定量分析
qPCＲ
PhTPS1
PhTPS2-1
PhTPS2-2
QT1F TGACGCCCACCTCTACTACA
QT1Ｒ CAAACCGATGGTTGGCCTTG
QT21F TCTGTCACGTGGTTGTACCG
QT21Ｒ GATCTTGTGACCGACGAGCA
QT22F GGCCGGATCAATAGCACGTA
QT22Ｒ CGTGCTGACAGATAGCCCAT
内参
internal control
PhUBC
UBCF TCACAACGAGGATTTACCACC
UBCＲ GAGGAGCACCTTGGAAACG
阳性克隆筛选
validate positive clone
M13F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
M13Ｒ GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
1． 5 PhTPS基因的生物信息学分析
对所获得的全长基因序列利用 NCBI 的 Blast
程序(http:∥blast． ncbi． nlm． nih． gov /Blast． cgi)进
行序列同源性检测，并采用 OＲF Finder(http:∥
www． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html)软件分析
各基因的开放阅读框(OＲF)和所编码氨基酸序列;
使用在线软件 PＲOSITE(http:∥prosite． expasy．
org /)、InterProScan (http:∥ www． ebi． ac． uk /
Tools /pfa / iprscan /)和 PrediSi (http:∥ www．
predisi． de)查找基因序列的保守位点和信号肽序
列;采用 Clustal X［17］进行氨基酸多重序列比对，并
采用 MEGA 6． 06［18］软件最大似然法(Maximum
Likelihood，ML)构建 PhTPS 蛋白系统进化树。
1． 6 PhTPS基因表达水平的 qPCＲ分析
分别根据各基因序列设计 qPCＲ 正反向引
物，并以坛紫菜泛素连接酶(ubiquitin conjugating
enzyme，UBC)基因作为内参，对 PhTPS 基因在高
温和失水胁迫下的表达水平进行 qPCＲ检测。
提取的各样品总 ＲNA 按 PrimeScript ＲT
reagent Kit(TaKaＲa，大连)的说明书进行操作。
25 μL 的反应体系包含:12． 5 μL 2 × SYBＲ
Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaＲa) ，0． 2 μmol /L 引物
和 2 μL 反转录产物。扩增程序为 95 ℃ 变性
30 s;95 ℃ 5 s，62 ℃ 31 s，40 个循环。循环结束
后从 55 ℃ 缓慢升温至 95 ℃，绘制溶解曲线。
qPCＲ扩增在 7300 型定量 PCＲ 仪(ABI，美国)上
进行。
以 10 ×梯度稀释的 cDNA 为模板进行 qPCＲ
扩增，分别制作 PhTPS1，PhTPS2-1，PhTPS2-2 和
内参基因的标准曲线。每次反应都设置阴性对照
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和无模板对照，每个反应设 3 个平行复孔。应用
Excel和 SPSS 19． 0 软件对实验数据进行统计分
析，并采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)
和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的
差异，P ＜ 0． 05 表示差异显著，P ＜ 0． 01 表示极显
著差异。
2 结果
2． 1 PhTPS基因的全长克隆及序列分析
PhTPS1 以坛紫菜 Unigene 6752 为核心序列，
通过 ＲACE 扩增及测序，分别得到 1 条长度为
948 bp 的 5-末端序列(图 1-a)和 1 条长度为
1 071 bp的 3-末端序列(图 1-b)。根据两条末端
序列与核心序列 Unigene 6752 的重叠区进行序列
拼接，得到 1 条长度为 3 557 bp的全长序列，经过
blast比对，确定该基因为坛紫菜的 TPS1 基因，命
名为 PhTPS-1。该基因已提交到 GenBank数据库
中，收录号为 KM580358。通过 OＲF Finder 在线
软件分析发现，该基因序列 108 ～ 3 569 个碱基为
完整的开放阅读框(open reading frame，OＲF)，可
编码包含 1 153 个氨基酸，分子量为 124． 2 ku，等
电点为 6． 73 的蛋白质。通过 NCBI 的蛋白保守
区数据库(CDD)对该基因编码的蛋白质进行保
守区预测，发现该蛋白 N 端包含 1 个 GT1_TPS
保守结构域(图 2)，该结构域编码的蛋白属于糖
基转移酶家族，能够催化 6-磷酸葡萄糖合成 6-磷
酸海藻糖。
PhTPS2-1 以坛紫菜 Unigene 8841 为核心序
列，通过 5端普通 PCＲ 和 3端 ＲACE 扩增及测
序，分别得到 1 条长度为 874 bp 的 5-末端序列
(图 1-c)和 1 条长度为 912 bp的 3-末端序列(图
1-d)。根据 2 条末端序列与核心序列 Unigene
8841 的重叠区进行序列拼接，得到 1 条长度为
4 264 bp的全长序列，经过 Blast 比对，确定该基
因为坛紫菜的 TPS2 基因，命名为 PhTPS2-1。该
基因已提交到 GenBank 数据库中，收录号为
KM519457。通过 OＲF Finder 在线软件分析发
现，该基因序列 17 ～ 4 060 个碱基为完整的 OＲF，
可编码包含1 347个氨基酸，分子量为 145． 2 ku，
等电点为5． 96的蛋白质。通过 NCBI 的蛋白保守
区数据库(CDD)对该基因编码的蛋白质进行保
守区预测，发现该蛋白 N 端包含 1 个 GT1_TPS
保守结构域(图 2)。
PhTPS2-2 以坛紫菜 Unigene 10310 为核心序
列，通过 ＲACE扩增和测序，获得 1 条长度为 649
bp的 5-末端序列(图 1-e)和 1 条长度为 838 bp
的 3-末端序列(图 1-f)。根据 2 条末端序列与核
心序列 Unigene 10310 的重叠区进行序列拼接，得
到 1 条长度为 3 733 bp的全长序列，经过 blast比
对，确定该基因为坛紫菜的 TPS2 基因，命名为
PhTPS2-2。该基因已提交到 GenBank 数据库中，
收录号为 KM519458。通过 OＲF Finder在线软件
分析发现，该基因序列 253 ～ 3 576 个碱基为完整
的 OＲF，可编码包含 1 107 个氨基酸，分子量为
120． 2 ku，等电点为 5． 42 的蛋白质。通过 NCBI
的蛋白保守区数据库(CDD)对该基因编码的蛋
白质进行保守区预测，发现该蛋白 N 端同样包含
1 个 GT1_TPS 保守结构域(图 2)。
图 1 PhTPS基因扩增产物电泳图
(a)PhTPS1 基因的 5-PCＲ扩增产物; (b)PhTPS1 基因的 3-ＲACE 扩增产物(箭头) ; (c)PhTPS2-1 基因的 5-PCＲ扩增产物; (d)
PhTPS2-1 基因的 3-ＲACE 扩增产物(箭头) ; (e)PhTPS2-2 基因的 5-ＲACE 扩增产物; (f)PhTPS2-1 基因的 3-ＲACE 扩增产物
Fig． 1 Agarose electrophoresis of PCＲ or ＲACE products of PhTPS genes
(a)5-PCＲ products of PhTPS1; (b)3-ＲACE products of PhTPS1(Arrow) ; (c)5-PCＲ products of PhTPS2-1; (d)3-ＲACE products
of PhTPS2-1(Arrow) ; (e)5-ＲACE products of PhTPS2-2; (f)3-ＲACE products of PhTPS2-2
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图 2 PhTPS蛋白氨基酸序列的多重序列比对
下划线部分为 N 端的 GT1_TPS 保守结构域，阴影和“▲”标记位点为 6-磷酸葡萄糖底物结合的保守位点，阴影和“●”标记位点为
UDP-葡萄糖底物结合的保守位点，阴影和方框标记位点为糖原磷酸化酶糖基转移酶(GPGTF)家族共有的保守位点，方框部分为磷
酸水解酶(TPS2)的保守位点
Fig． 2 Multi-alignment of amino acid sequence of PhTPS
The underline sections were the conserved N-domains of GT1_TPS． The amino acid sites which indicated with gray background and“▲”
were the conserved substrate binding sites of glucose-6-phosphate，the amino acid sites which indicated with gray background and“●”
were the conserved substrate binding sites of UDP-glucose;the amino acid sites which indicated with gray background and box were the
conserved sites of glycogen phosphorylase glycosyltransferase family，and the amino acid residues which indicated with boxes are the two
typical conserved sites in the phosphatase family(TPS2)
2． 2 PhTPS基因的多序列比对及系统进化分析
TPS 蛋白氨基酸序列的多重序列比对结果表
明，所克隆的 3 条基因均属于 TPS 基因家族，其中
PhTPS1与 GenBank数据库中已公布的其中 1 条坛
紫菜 TPS 氨基酸序列(AGT80036． 1)的同源性为
99%，而与其他 3 条已公布坛紫菜 TPS 氨基酸序列
的同源性均为 38%;PhTPS2-1 和 PhTPS2-2 与已公
布的坛紫菜 TPS 氨基酸序列的同源性较低，仅为
37%～51%(表 2)。多重序列比对结果表明，PhTPS1
蛋白只具有 N 端的 GT1_TPS 保守结构域，属于Ⅰ型
TPS 亚家族;而 PhTPS2-1 和 PhTPS2-2 蛋白除了具
有N端的GT1_TPS 保守结构域外，还包含C端具两
个磷酸水解酶保守位点的 TPP结构域(图 2)，因此
PhTPS2-1和 PhTPS2-2为双功能蛋白，属于Ⅱ型 TPS
亚家族。同时这 3条 PhTPS基因所编码的氨基酸序
列均包含部分高度保守的位点，如参与结合 6-磷酸
葡萄糖底物的位点 Arg9、Gly40、Tyr76、Trp85 和
Arg300，参与结合 UDP-葡萄糖底物的位点 Gly22、
Asp130、His154、Arg262、Asp361 和 Glu369，其中，
Asp361 和 Glu369 是糖原磷酸化酶糖基转移酶
(glycogen phosphorylase glycosyltransferase，GPGTF)
家族共有的保守位点(图 2)。
表 2 坛紫菜 TPS蛋白氨基酸的序列同源性
Tab． 2 Sequence similarity among TPS of P． haitanensis %
PhTPS1 PhTPS2-1 PhTPS2-2 AGT80036． 1 AGT98612． 1 AHB86958． 1
PhTPS2-1 50
PhTPS2-2 42 40
AGT80036． 1 99 51 42
AGT98612． 1 38 39 37 38
AHB86958． 1 38 39 38 38 97
ABG75728． 1 38 39 37 38 97 99
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为进一步明确 PhTPS 蛋白的系统进化关系，
选取 GenBank 数据库中公布的藻类和高等植物
的 4 条Ⅰ型或 12 条Ⅱ型 TPS 蛋白的氨基酸序列
与本研究所克隆的 3 条 PhTPS 基因所编码的氨
基酸序列，通过 MEGA 6． 06 程序采用最大似然
法(Maximum Likelihood，ML)构建了系统进化树
(图 3)。结果显示，TPS 系统进化树分为明显的
两支:4 条Ⅰ型 TPS 蛋白先和 PhTPS1 聚类后，再
与皱波角叉菜(XP_005712424． 1)Ⅱ型 TPS 蛋白
及两条 PhTPS2 蛋白共同聚类为一个大分支，而
剩余的Ⅱ型 TPS 蛋白聚类为另一个大分支(图
3)。说明坛紫菜和皱波角叉菜的Ⅱ型 TPS 蛋白
与Ⅰ型 TPS 蛋白的亲缘关系更近，而与其他植物
和藻类的Ⅱ型 TPS 蛋白的亲缘关系更远;尤其是
条斑紫菜和坛紫菜，尽管二者亲缘关系很近，但它
们所具有的Ⅱ型 TPS 蛋白的亲缘关系却很远。
图 3 基于氨基酸序列构建 TPS的系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree constructed with TPS amino acid sequences
2． 3 PhTPS基因表达水平的实时荧光定量 PCＲ
分析
为分析 PhTPS 基因在坛紫菜响应逆境胁迫
中的可能作用，本研究通过 qPCＲ 技术对 3 条
PhTPS基因在高温和失水胁迫下的表达特征进行
了相对定量分析(图 4)。
在 29℃ 高温胁迫不同时间水平条件下，
PhTPS1、PhTPS2-1 和 PhTPS2-2 3 个基因的表达
模式基本一致:在高温胁迫 3 h 时，PhTPS1 和
PhTPS2-1 的表达水平由于受短时间高温刺激，表
达水平显著上调(P ＜ 0． 05)，而 PhTPS2-2 的表达
水平则没有发生显著变化(P ＞ 0． 05) ;但当高温
胁迫 ＞ 3 h时，3 个基因的表达水平均受到较长时
间高温胁迫的抑制，表达水平显著下调(P ＜
0． 05);当高温胁迫持续超过 12 h(PhTPS1 和
PhTPS2-2)或 24 h(PhTPS2-1)时，3 个基因的表
达水平可能受到藻体细胞中自身应激反馈机制的
干预，又显著上调至高温胁迫开始前的水平
(PhTPS2-1 和 PhTPS2-2)，甚至更高(PhTPS1)
(P ＜ 0． 05，图 4-a，c，e)。说明 PhTPS基因在坛紫
菜高温胁迫应答中可能没有发挥明显的作用，其
表达水平的动态变化只是一种被动适应的结果。
在不同失水胁迫条件下，PhTPS1、PhTPS2-1
和 PhTPS2-2 3 个基因的表达水平变化模式基本
一致，但表达水平发生显著变化的节点并不一致:
PhTPS1 在中低水平(失水率≤60%)的失水胁迫
条件下，表达水平没有发生显著变化(P ＞ 0． 05)，
但当失水率为 75%时，表达水平显著上调(P ＜
0． 05)，上调至失水胁迫前表达水平的 4． 47 倍，但
随着失水胁迫的加剧，表达水平又显著下调(P ＜
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0． 05) ，并可在复水 30 min后，恢复到失水胁迫发
生初期水平(图 4-b) ;PhTPS2-1 在低水平(失水
率≤15%)的失水胁迫条件下，表达水平没有发
生显著变化(P ＞ 0． 05)，但当失水率 ＞ 15%时，表
达水平显著上调(P ＜ 0． 05) ，并在失水率为 30%
～75%时维持稳定(P ＞ 0． 05)，当失水率为 90%
时，表达水平再次显著上调(P ＜ 0． 05) ，此时复水
30 min，PhTPS2-1 的表达水平可迅速下调至失水
胁迫发生前的水平(图 4-d);PhTPS2-2 在失水率
≤75% 时，表达水平没有发生显著变化(P ＞
0． 05);但当失水率为 90%时，表达水平显著上调
(P ＜ 0． 05)，此时复水 30 min，表达水平又迅速下
调至失水胁迫发生前水平(图 4-f)。说明 PhTPS1
和 PhTPS2-2 基因可能只在高水平的失水胁迫应
答中发挥应激调节作用，而在低水平的失水胁迫
下，作用并不明显;而 PhTPS2-1 基因则可能在中
高水平的失水胁迫应答中发挥应激调节作用。
图 4 不同胁迫条件下 PhTPS的相对表达水平
a、c、e:高温胁迫;b、d、f:不同水平失水胁迫及复水 30 min。不具有相同字母上标的数据间差异显著(P ＜ 0． 05)
Fig． 4 The relative expression levels of PhTPS genes at different levels of stress
a，c，e:The relative expression levels of PhTPS genes in different time of high temperature stress;b，d，f:The relative expression levels of
PhTPS genes in different level of desiccation and in rehydration for 30 min． Bar of each column with different small letters mean significant
difference(P ＜ 0． 05)
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4 期 史健志，等:坛紫菜 6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析
3 讨论
海藻糖作为一种贮藏性的碳水化合物，提高
其在细胞中的积累量是通过基因工程手段提高植
物抗逆能力的一种有效方法［4］，而 TPS 是海藻糖
生物合成途径的关键酶，将 TPS 基因直接导入水
稻等多种植物中已成功获得了抗逆能力明显改善
的基因工程作物［5 － 8］。然而在已有的转 TPS基因
研究中，大都采用来自大肠杆菌或酵母菌的 TPS
基因作为目的基因，克隆来源更加安全的 TPS 基
因是非常必要的。因此本研究以转录组测序获得
的 TPS unigene 序列作为核心序列，采用普通
PCＲ或 ＲACE 扩增技术成功克隆了 3 条来自坛
紫菜的 TPS基因。
TPS 基因属于多基因家族，已完成全基因组
测序的物种中，拟南芥(Arabidopsis thaliana)［19］
和水稻［20］中均发现了 11 个 TPS基因。根据序列
的相似性和特异性，可以将 TPS 同源基因分为 2
个亚家族［20 － 21］:Ⅰ型 TPS 亚家族基因只含有 N
端的 TPS 保守结构域，该结构域编码的蛋白属于
糖基转移酶家族，能够催化 6-磷酸葡萄糖合成 6-
磷酸海藻糖;而Ⅱ型 TPS 亚家族基因除了具有 N
端的 TPS 保守结构域外，还包含 C 端具 2 个磷酸
水解酶保守位点的 TPP 结构域，为双功能基因。
本研究克隆的 3 条坛紫菜 TPS基因，PhTPS1 属于
Ⅰ型亚家族，而 PhTPS2-1 和 PhTPS2-2 则属于Ⅱ
型 TPS 亚家族。Wang 等［15］根据基因的保守序
列设计特异性引物，采用 PCＲ分段扩增及序列拼
接的方法克隆了红藻、褐藻与绿藻等 10 种大型海
藻(包括坛紫菜和条斑紫菜)的 TPS 基因，结果发
现这 10 条 TPS 基因的同源性均在 90%以上，无
内含子，OＲF均为 2 727 bp，其中坛紫菜与条斑紫
菜的亲缘关系最近，但两者 TPS 基因的同源性却
最低。而本研究克隆的 3 条坛紫菜 TPS 基因，从
OＲF长度到氨基酸序列的同源性均与其他大型
海藻的 TPS基因相差较大，这在系统进化树中即
可看出。即使同样来自坛紫菜的 TPS 基因，只有
PhTPS1 基因与 GenBank数据库中已公布的其中
1 条坛紫菜 TPS 基因(AGT80036． 1)的序列同源
性为 99%，而 PhTPS2-1 和 PhTPS2-2 基因与
GenBank数据库中已公布的坛紫菜 TPS 基因的
序列同源性均很低，且 PhTPS1、PhTPS2-1 和
PhTPS2-2 基因之间的序列同源性都低于 50%。
究其原因可能是 Wang 等［15］是依据基因序列的
保守性设计特异性引物进行全长基因克隆的，而
本研究则依据的是转录组测序获得的不同 TPS
基因序列片段进行基因全长克隆，因此所克隆的
PhTPS基因序列同源性较低。鉴于 PhTPS2-1 和
PhTPS2-2 基因序列与已有坛紫菜 TPS 基因的序
列同源性差异较大，却拥有典型的 TPS 基因的结
构域特征，这 2 个基因应为坛紫菜 TPS 基因家族
的新成员。
植物对逆境胁迫的响应是一个非常复杂的生
理生化过程，其中包括多种基因、多种生理机制的
共同调控。海藻糖由于可与 2 个水分子结合形成
玻璃态结构，具有很强的抗脱水作用，在逆境条件
下可稳定生物膜、蛋白质和核酸等细胞结构和生
物大分子，显著提升植物的抗逆性［2］，因此成为
了近年来抗逆基因工程研究的重点。由于栖居环
境的特殊性，紫菜被认为是研究潮间带海藻抗逆
性的理想物种［12］，摸清坛紫菜海藻糖合成关键酶
TPS基因在逆境胁迫条件下的表达水平变化，对
于了解海藻糖在坛紫菜逆境胁迫应答中的可能作
用具有重要意义。本研究采用 qPCＲ技术检测了
3 条 PhTPS基因在坛紫菜受不同程度高温和失水
胁迫条件影响时的表达水平变化，结果表明在高
温胁迫应答中，PhTPS 基因可能没有发挥明显作
用，其表达水平的动态变化只是一种被动适应的
结果;而在失水胁迫应答中，PhTPS基因的表达水
平也只在中高水平(PhTPS2-1)，甚至只在高水平
(PhTPS1 和 PhTPS2-2)的失水胁迫中显著上调，
说明 PhTPS 基因可能在中高水平的失水胁迫中
发挥应激调节作用。PhTPS基因在失水胁迫条件
下的表达模式与 PhHsp70［22］及 PhHsp90［23］等基
因在失水胁迫下的表达模式基本一致。这些逆境
胁迫相关基因在中低水平的失水胁迫条件下表达
水平没有发生显著变化的原因可能与坛紫菜的栖
息环境有关:坛紫菜分布于潮间带的中高潮区，在
长期的进化过程中已经适应了潮间带伴随潮涨潮
落而产生的周期性失水和复水环境条件，中低水
平的失水对坛紫菜藻体而言已不构成胁迫，只是
生命活动过程中的一个日常现象，因此在发生中
低水平的失水时，其不启动应激响应机制，而只在
发生高度失水时才启动。这一点同样可以在坛紫
菜藻体失水条件下的光合作用速率检测结果中得
到证实，中低水平的失水对坛紫菜藻体的光合速
394
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水 产 学 报 39 卷
率并没有影响，失水率达 60%时，藻体仍然能以
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Cloning and expression analysis of trehalose-6-phosphate synthase(TPS)
family genes from Pyropia haitanensis
SHI Jianzhi，XU Yan，JI Dehua，CHEN Changsheng，XIE Chaotian*
(College of Fisheries，Jimei University，Xiamen 361021，China)
Abstract:Trehalose-6-phosphate synthase(TPS) ，the key enzyme involved in trehalose biosynthesis，plays
particularly important roles in a variety of stress responses． In this study，based on unigene sequences which
were obtained from whole transcriptome sequencing of Pyropia haitanensis，three full-length PhTPS genes
were obtained by rapid amplification of cDNA ends(ＲACE) ，and named PhTPS1，PhTPS2-1 and PhTPS2-
2． The full-length cDNA of the PhTPS gene comprised 3 557 nucleotides and contained an open reading
frame of 3 462 bp(GenBank accession:KM580358) ，encoding a protein of 1 153 amino acid residues with
the predicted molecular weight of 124． 2 ku and theoretical isoelectric point of 6． 73;the full-length cDNA of
the PhTPS2-1 gene comprised 4 264 nucleotides and contained an open reading frame of 4 044 bp(GenBank
accession:KM519457) ，encoding a protein of 1 374 amino acid residues with the predicted molecular weight
of 145． 2 ku and theoretical isoelectric point of 5． 96;and the full-length cDNA of the PhTPS2-2 gene
comprised 3 733 nucleotides and contained an open reading frame of 3 324 bp(GenBank accession:
KM519458) ，encoding a protein of 1 107 amino acid residues with the predicted molecular weight of 120． 2
ku and theoretical isoelectric point of 5． 42． On the basis of conserved motifs and phylogenetic tree analysis，
PhTPS1 belongs to the Ⅰ subfamily of TPS and PhTPS2-1 and PhTPS2-2 belong to the Ⅱ subfamily of
TPS． The expressions of the three PhTPS genes，as measured by real-time quantitative PCＲ，were
significantly induced by high-temperature stress and desiccation stress，but had different expression patterns．
During high-temperature stress，the expression levels of the three PhTPS genes were all significantly
upregulated firstly and then decreased，but as the high-temperature stress continues，the expression levels were
upregulated again． However，during desiccation，the expression levels of PhTPS1 and PhTPS2-2 were
significantly upregulateded only when the water loss was ＞ 60% or 75%，but the expression level of
PhTPS2-1 was significantly upregulat when the water loss was ＞ 15% ． These results suggested that the three
PhTPS genes may play important roles in the response to higher desiccation stress．
Key words:Pyropia haitanensis;trehalose-6-phosphate synthase;ＲACE;real-time quantitative PCＲ
Corresponding author:XIE Chaotian． E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
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