全 文 ：收稿日期:2004 - 06 - 21　　修回日期:2004 - 12 -28
基金项目:福建省科技厅资助项目(200H004和 2001Z127).
作者简介:王盛(1972 -),男 ,博士.研究方向:植物病理学.
*通讯作者.
珊瑚藻藻红蛋白 β亚基脱辅基蛋白基因克隆
与序列分析
王　盛 1, 2 , 钟伏弟 1, 2 , 吴祖建 1, 2 , 林奇英 1, 2 , 谢联辉1, 2*
(1.福建农林大学植物病毒研究所;2. 农药生物化学教育部重点实验室 (福建农林大学 ), 福建 福州
350002)
摘要:首次报道珊瑚藻 R-藻红蛋白 β 亚基基因的全序列. 测定的基因序列长为 983个碱基 ,包括 β 亚基起始密码子上游的
10个碱基 、β 亚基编码区的 534个碱基(编码 177个氨基酸)、101个碱基的间隔区以及 α亚基编码区近 5′端的 338个碱基
(编码 112个氨基酸).对其序列在核酸和氨基酸水平上的同源性与已知基因序列的 9种红藻作了比较分析 ,认为 β 亚基氨
基酸序列在红藻分类上具有重要意义.
关键词:珊瑚藻;藻红蛋白基因;β 亚基;克隆
中图分类号:Q2251 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2005)03-0334-05
C loning and analysis of beta subun it sequence of phycoerythr in gene from
Cora llina officinalis
WANG Sheng
1, 2 , ZHONG Fu-di1, 2 , WU Zu-jian1, 2 , LIN Q i-y ing1, 2 , X IE Lian-hui1, 2
(1. Institu te o f P lant V iro logy, Fu jian Ag ricu lture and Fo re stry Un ive rsity;2. Key Labo ra to ry fo r Biope sticide and Chem ica lB io logy
(Fu jian Ag riculture and Fo re stry Unive rsity), M in istry o f Education, Fuzhou, Fujian 350002, China)
Abstrac t:C loning and sequencing o f the gene encoding β subunit o f phycoe ry thrin of a red a lga-Cora llina officina lis we re repo rted
firstly. The sequence con ta ined 983 nuc leo tide s, inc luding 10 nuc leo tide s of upstream befo re the initiation codon o fβ subunit, 534
nuc leo tide s of β subun it(encoding 177 am ino ac ids), 101 nucleotides fo r gene spacer and 338 nucleotides of 5′-term ina l ofα sub-
unit(encod ing 112 am ino acids). Sim ila ritie s in the nuc leo tide leve l and am ino acid level w ith n ine known red a lga PE genes we re
analyzed. The im po rtan t taxonom ic value o f β subunitw as suggested in a lga taxonom y.
K ey words:Cora llina officina lis;phycoe ry th rin-gene;be ta subunit;cloning
藻胆体是红藻光合作用捕光色素的蛋白复合体 ,是由不同藻胆蛋白按照一定的顺序排列而成的.藻红
蛋白位于藻胆体的尖端 ,藻蓝蛋白位于中间 ,变藻蓝蛋白形成核心通过锚蛋白附着在类囊体的基质膜
上 [ 1] ,与光反应中心连接 ,藻胆蛋白之间通过多肽相连. 光能从藻红蛋白传递到藻蓝蛋白 ,再传递到变藻
蓝蛋白 ,最后传递到光反应中心 [ 2] .藻红蛋白在能量传递体系中位于第 1环节 ,是第 1级捕光色素 ,直接吸
收和传递光能 ,对藻体的生理活动影响很大[ 3] .
珊瑚藻藻红蛋白的分子质量及亚基组成均与前人报道的有所不同 ,其藻胆体不含有藻蓝蛋白和异藻
蓝蛋白 ,在结构上与其它红藻不同 ,是一种新的藻红蛋白 [ 4] .珊瑚藻藻红蛋白的基因组研究尚未见报道 ,
通过基因克隆以及研究藻红蛋白基因结构 、功能 ,有助于进一步阐明其分子机制.
目前 ,对原核蓝藻藻红蛋白亚基基因结构的研究报道较多 ,而对红藻的研究报道不多.本文利用 PCR
方法从珊瑚藻总 DNA中克隆了藻红蛋白基因 β亚基的全序列 ,并进行了序列比较分析.
1　材料与方法
1. 1　材料
珊瑚藻采自福建省莆田海域;PCR试剂 、Lambda DNA /EcoR Ⅰ +H ind Ⅲ marker、EcoR Ⅰ 、 IPTG、X-
福建农林大学学报(自然科学版) 第 34卷 第 3期
Journa l o f Fu jian Ag ricu lture and Fo re stry University (Natura l Sc ience Edition) 2005年 9月
DOI牶牨牥牣牨牫牫牪牫牤j牣cnki牣j牣fafu牗nat牣sci牣牘牣牪牥牥牭牣牥牫牣牥牨牬
G al购自上海生工生物工程技术服务有限公司;大肠杆菌 (E scherichia coli)DH5α由本所自行保存;凝胶回
收试剂盒 Q IAEX Ⅱ Ge l Ex traction K it为 Q IAGEN公司产品;克隆载体连接试剂盒 pGEM-T Easy Vecto r
System s为 Promega公司产品.
1. 2　DNA提取
DNA提取采用隋正红等 [ 5]的方法.
1. 3　PCR扩增
根据已报道的藻红蛋白基因序列保守区设计合成引物 P1和 P2,在 P1 -P2片段序列测定的基础上设
计引物 P3和 P4.引物序列如下:
　　PCR扩增仪为 B iome tra T3 The rmocycler,反应体系 20 μL,含 1 μL珊瑚藻总 DNA 、2 μL引物 (10
μmo l L- 1)、0. 4 μL dNTPs(每种 10 mmo l L -1)、2 μL 10×反应缓冲液 、1. 2 μL 25 mmo l L -1MgC l2及
0. 4 μL Taq DNA聚合酶(4 U μL - 1). 反应条件为 95 ℃预变性 5 m in,之后 , 95 ℃80 s, 42 ℃(片段 P3 -
P4)或 62℃(片段 P1 - P2)120 s, 72 ℃80 s,循环 30次后 72 ℃延伸 10m in ,最后冷却至 4℃. PCR产物经
质量分数为 1%的琼脂糖电泳检测 、回收后 ,与 pGEM-T Easy V ector连接 ,转化大肠杆菌 DH5α.挑取在加
有 IPTG和 X-G a l的 LB平板上生长的白色菌落 ,进行质粒酶切鉴定.上海基康生物技术有限公司对序列进
行测定.序列分析采用 EBI序列比较分析软件 C lustaWl 和 NCB I序列比较分析软件 B las.t
2　结果与分析
2. 1　片段 P1 - P2的克隆
从图 1中可以看出 ,扩增产物在泳道中只有 1条特异性染色带 ,片段大小约 750 bp左右 ,包含 β亚基
3′端和 α亚基 5′端的部分序列 ,与预计的目的片段大小一致. PCR扩增产物经回收 、连接 、转化后克隆到
pGEM-T easy载体上 ,经蓝白斑筛选 ,采用碱裂解法小量提取克隆质粒 ,酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电
泳鉴定.从图 2可以看出 ,所挑选的 2个菌落都含有插入目的片段的重组子 ,片段大小与 PCR产物带大小
一致.
1、 2. PCR扩增;3. marker. 1、 2.重组质粒 E coRI酶切;3. m arker.
图 1　P1 - P2片段 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 图 2　重组质粒的 EcoR I酶切电泳鉴定
Fig. 1　Agarose gel electrophoresis of PCR amp lification of P1 - P2 Fig. 2　 Iden tification of recom b inan t p lasm id d igested by E coR I
2. 2　片段 P3 - P4的克隆
从图 3可以看出 ,产物在泳道中只有 1条特异性染色带 ,片段包含 β亚基和 α亚基 5′端的部分序列 ,
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第 3期 王盛等:珊瑚藻藻红蛋白 β 亚基脱辅基蛋白基因克隆与序列分析
大小约 750 bp,与预计的目的片段大小一致. PCR扩增产物经回收纯化 ,克隆到 pGEM-T easy载体上 ,经蓝
白斑筛选 ,采用碱裂解法提取质粒 ,酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定.从图 4中可以看出 ,所挑选的
菌落含有插入目的片段的重组子 ,片段大小与 PCR产物条带大小一致.
1、 2. PCR扩增;3. m ark er. 1.重组质粒 E coRI酶切;2. m arker.
图 3　P3 - P4片段 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 图 4　重组质粒的 EcoR I酶切电泳鉴定
Fig. 3　Agarose gel electrophoresis of PCR amp lification of P3 - P4 F ig. 4　 Iden tificat ion of recomb inan t p lasm id d igested by E coR I
2. 3　测序及序列分析结果
通过测定 2个克隆子及拼接获得一长为 983个碱基的基因序列 ,包括 β亚基起始密码子上游的 10个
碱基 、β亚基编码区的 534个碱基 (编码 177个氨基酸)、101个碱基的间隔区以及 α亚基编码区近 5′端的
338个碱基 (编码 112个氨基酸),基因排布顺序为 β亚基 -间隔区 -α亚基.该序列的 G /C含量较低 , β
亚基 G /C含量为 39%(其中 T、A、G 、C的含量分别为 34%、27%、21%及 18%),在其它几种已知序列红藻
基因序列中也存在类似现象.同时 ,该序列还表现出很强的密码子偏倚性 , β亚基三联体密码子第 3位碱
基 A /T的偏倚性为 80. 9%,这一偏倚性也体现在其它已知序列的藻红蛋白基因中.序列酶切位点分析结
果表明 ,多数酶切位点为稀有酶切位点 ,而常见酶在此序列上没有酶切位点 ,因此就可方便地进行基因操
作 (如基因表达 、转基因等 ).
2. 4　β亚基与已知 PE基因序列的比较
将珊瑚藻(Cora llina officinalis, AF510986)藻红蛋白 β亚基编码区的 177个氨基酸与已知基因序列红
藻门红藻 Rhodella reticulata (AF114823)、R. violacea (L02188)、Porphyra purpurea (U38804)、P. tenera
(D89877)、P. yezoensis(D89878)、Poly siphon ia boldii(Z14094)、Griffithsia monilis(Z98528)、Ag laothamn ion
neglectum (Z11907)、Gracilaria lemaneiform is(AF275685)的同源性序列进行比较(图 5).
从图 5可以看出 ,在不同红藻中 β亚基氨基酸序列保守性较高 ,其中 5′端保守性高于 3′端.其相互间
的同源性比较结果表明 , β亚基核酸序列间同源性为 68% - 98%,氨基酸序列同源性为 71% - 100%.其
中以珊瑚藻与 R. reticulata之间的核酸和氨基酸同源性最低 , P. tenera和 P. yezoensis的核酸和氨基酸同源
性最高.氨基酸序列的保守性高于核苷酸序列 ,这是因为大多数核苷酸的变异发生在密码子的第 3位.蛋
白质序列的高度保守对维持光合作用器结构和功能的稳定是必要的. K lo tz和 G lazer确定了红藻 Gastroco-
nium cou lteri中藻红蛋白亚基色基结合部位氨基酸序列 [ 6] .经氨基酸序列比较 ,推测在珊瑚藻的藻胆素结
合位点区域 (如图 5中阴影部分 )中 ,半胱氨酸 (C)是其色基的结合位点.
从图 5可以看出 ,氨基酸序列在此区域上极为保守 ,这对于维持其稳定的光谱特性极为重要.
2. 5　进化树与传统分类学
将 β亚基氨基酸序列 (图 6)进化树与传统分类地位进行对比 ,发现这两者基本吻合 ,说明 β亚基氨
基酸序列在红藻分类上具有一定价值.
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福建农林大学学报 (自然科学版) 第 34卷
*.完全相同的氨基酸.
图 5　珊瑚 R-藻藻红蛋白 β 亚基氨基酸序列比较
Fig. 5　A lignm en ts of deduced am ino acid sequen ce of beta subun it of R-PE
图 6　β亚基氨基酸序列进化树
Fig. 6　The phylogenetic tree of deduced am ino acid sequ ence of beta subun it of R-PE
3　讨论
本文首次报道了真核红藻 ———珊瑚藻的藻红蛋白 β亚基的基因全序列(G enbank登录号 AF510986),
该基因序列长为 983个碱基 ,编码 β亚基以及 α亚基近 5′端序列;基因排布顺序为 β亚基 -间隔区 -α
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第 3期 王盛等:珊瑚藻藻红蛋白 β 亚基脱辅基蛋白基因克隆与序列分析
亚基 ,且 β、α亚基编码区中不含内含子 ,编码区连续排布.与已报道的红藻基因序列相比 ,它们在基因排
布顺序和编码区碱基数上基本一致 ,在间隔区长度上差异较大. 例如龙须菜 (G. lemaneiform is)藻红蛋白基
因间隔区只有 55个碱基[ 7] ,珊瑚藻 (C. officina lis)的间隔区长度为 101个碱基 , A. neg lectum的间隔区长度
为 108个碱基 [ 8] .不但间隔区长度变异大 ,而且彼此之间的碱基组成差异也比较大.由于间隔区序列很短 ,
不足以起始新的转录 ,所以推测它与其它红藻藻胆蛋白的基因转录相似 ,珊瑚藻藻红蛋白 β 、α亚基也是
同时转录的 ,以维持细胞中两亚基的等量存在.在基因排布方式上 ,此基因序列与已报道的红藻门海藻 R.
reticulata和 R. violacea的基因排布方式不同. R. reticulata和 R. violacea除两亚基间的非编码间隔区外 ,其
β 、α亚基编码区中还含有不同数量和长度的内含子 ,形成编码区不连续的排布方式 [ 9] . 此基因序列与已
报道的红藻门 9种红藻的基因序列相比 ,其基因排布顺序基本一致 ,但间隔区长度和碱基组成差异较大 ,
其基因功能尚不清楚.
在不同红藻中 β亚基核苷酸和氨基酸序列保守性较强 ,而且 5′端保守性强于 3′端. 蛋白质序列的保
守性高于核苷酸序列 ,这可能对于维持光合作用器结构和功能的稳定性是必要的. 此外 ,推测在两亚基藻
胆素结合位点附近 ,序列保守性较高 ,这对维持其稳定的光谱特性有重要意义.将 β亚基氨基酸序列进化
树与传统分类地位进行对比 ,发现这两者基本相吻合 ,说明 β亚基氨基酸序列可以作为红藻分子生物学
分类的标准之一.
国内外对原核蓝藻和蓝细菌的藻红蛋白基因结构及功能已有较多研究 ,而对真核藻类的研究仅限于
为数不多的几个藻种 ,本研究有助于进一步了解真核红藻的基因结构 ,对藻红蛋白的功能研究及应用具有
重要意义.
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(责任编辑:叶济蓉 )　　
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