全 文 ：收稿日期: 2001- 07- 30
基金项目:福建省科技厅重大资助项目 ( 2000H004和 2001H127) .
作者简介:王盛 ( 1972- ) ,男 ,博士 .研究方向:植物病理 .
* 通讯联系人 .
珊瑚藻藻红蛋白分离纯化技术及光谱学特性
王　盛 , 吴祖建 , 林奇英 , 谢联辉*
(福建农林大学植物病毒研究所 ,福建 福州 350002)
摘要: 藻红蛋白 ( PE)具有特征性吸收光谱和荧光光谱 ,是一种新颖的荧光分子探针 .经反复探索研究建立了盐析、离子交
换层析、羟基磷灰石吸附层析和凝胶过滤层析的分离纯化方案 ,从珊瑚藻中分离纯化出 R-藻红蛋白 ( R-PE) ,其纯度 [D
( 565 nm) /D ( 280 nm) ]高达 11.
关键词: 珊瑚藻 ; 藻红蛋白 ; 柱色谱层析 ; 荧光光谱
中图分类号: Q2251 文献标识码: A 文章编号: 1006-7817( 2002) 04-0495-05
Isol ation and purification of phycoerythrin fromCorallina of ficinalis and its spectrum charac-
teristics
WANG Sheng , WU Zu-jian, LIN Qi-ying , XIE Lian-hui
*
( Institute of Plant V irolog y , Fujian Ag riculture and Fo restry Univ ersity, Fuzhou, Fujian 350002, China )
Abstract: The phycoer ythrin ( PE) was a kind of fluorescence mo lecula r probe with the characteristics of absorption spectra
and fluo rescence spectra. The successiv e procedures o f frac tion precipita tion of ammonium sulfa te, ion exchange, modified hy-
drory lapa tite and gel filt ration ch romatog raph y w ere set up. A kind o f R-ph ycoery th rin( R-PE) from Corallina of f icinalis was
sepa rated and purified, the purity [ra tio of D( 565 nm ) /D( 280 nm) ] of R-PE reached 11.
Key words: Corallina of f icinalis; phycoerythrin; column chromatog raphy; fluor escence spectrum
荧光免疫分析是最早使用的一种标记免疫分析法 ,其灵敏度高 ,在传染病诊断上有着极为广泛的用
途 .但生物样品的荧光 ( 400- 600 nm )与常用的荧光标记物的荧光的发射光谱相重叠 ,影响检测的灵敏
度 .藻红蛋白是一种独特的荧光标记物 ,克服了人工合成荧光素价格高、存在有毒物质以及长期保存后与
蛋白质结合能力减弱甚至消失等缺点 [1 ] .国外许多公司已相继开发出藻红蛋白产品 ,但售价高 ( 126美元
· mg- 1 ) [2 ] ,而目前国内使用的这类产品全部依赖进口 ,所以开发这类高新技术产品 ,对我国具有重要意
义 .本文对珊瑚藻的藻红蛋白分离纯化方案和光谱学性质进行了研究 .
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试样品采自福建省福清高山、江阴和莆田南日岛等海域 .采回后用清水洗去藻体表面附生物 ,编号
分装后置于超低温冰箱中于 - 50℃保存备用 .同时留下少许相应编号样品 ,以供藻种鉴定 .
1.2　离子交换和凝胶过滤介质
试验中使用的离子交换介质为 DEAE-sepharose FF,凝胶过滤介质为 Superdex 200 HR、 Sephacryl S-
200 HR和 Sepharose 6B等 .以上产品由 Amersham Pharmacia公司提供 .
1.3　主要仪器
BSZ-100自动部分收集器和梯度混合器为上海沪西仪器公司产品 ; Z型系列层析柱购自上海精科实
业有限公司 ;恒流泵 ( YZ1515)购自保定兰格恒流泵有限公司 ; UV-1600紫外分光光度计为北京瑞利公司
产品 ;荧光分光光度计 ( 850型 )为 Hitachi公司产品 .
福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷 第 4期
Journal of Fujian Ag riculture and Forestry Univ ersity ( Na tural Science Edition) 2002年 12月
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 2002. 04. 021
1.4　藻红蛋白的粗提和盐析
1. 4.1　粗提　取珊瑚藻材料 20 g于研钵中充分磨碎 ,用 50 mL蒸馏水浸提 ;三层纱布过滤后 , 4℃下于高
速离心机中 15 000 g离心 20 min,取出的上清液即为藻红蛋白粗提液 .
1. 4. 2　盐析　在上清液中加入固体 ( N H4 ) 2 SO4至 30%饱和度 ,于 4℃冰箱中静置 12 h;之后在 4℃下
25 000 g离心 20 min,除去沉淀 ,再加入 ( N H4 ) 2 SO4至 45%饱和度 , 4℃静置盐析过夜 ; 4℃下 25 000 g离
心 20 min,弃上清液 ,收集红色沉淀 ,加少量蒸馏水溶解后置于透析袋中 ;于 4℃下在蒸馏水中连续透析
36 h,换水 4- 5次 ;截留液再用 PEG20000浓缩 ,然后用 0.01 mol· L- 1 PBS( pH 7.0)缓冲液平衡透析 12
h,将截留液在 4℃下 25 000 g离心 20 min,取上清液 .
1.5　珊瑚藻藻红蛋白的柱色谱层析分离纯化
1. 5. 1　 DEAE-Sepharose FF柱层析　将装好的 DEAE-Sepharose FF柱 ( 1. 6 cm× 20 cm ) ,以 0. 01
mol· L- 1 PBS( pH 7.0)缓冲液平衡 ,直至流出液的 pH为 7.0;将平衡好的样品上样于柱顶 ,用上样缓冲液
洗柱 30- 40 min;再用 0- 0. 5 mol· L- 1 NaCl作线性梯度洗脱 ,洗脱液总体积为 200 mL,流速 1. 5 mL·
min
- 1 .每管收集洗脱液约 5 mL,并测其 D ( 280 nm )和 D ( 565 nm ) ,作出 280 nm层析曲线 .根据洗脱峰
和 D ( 565 nm ) /D ( 280 nm )比值 ,收集较纯的样品 ,经反复透析、浓缩、离心后备用 .
1. 5.2　羟基磷灰石 ( HA)的制备　参考韦萍等 [3 ]的方法 .
1. 5.3　 Test tube法确定的 HA操作初始条件及洗脱盐浓度的测定　参考殷钢等 [4 ]的方法 .
1. 5. 4　 HA柱层析　根据 Test tube法测定的离子强度 ,用 0. 01 mol· L- 1的 PBS( pH7.0)缓冲液平衡已装
好的 HA柱 ;层析柱平衡好后 ,将预先用相同缓冲液平衡好的、经 DEAE-Sepharose FF柱层析的样品 ,上
样于柱顶 ;待样品完全进入层析柱后 ,再用平衡缓冲液洗柱过夜后 ,用离子强度为 0. 01- 0. 1 mol· L- 1的
PBS作线性梯度洗脱 ,洗脱液总体积为 100 mL,流速 0.5 mL· min-1 .每管收集洗脱液 3 mL,并测其 D
( 280 nm )和 D ( 565 nm ) ,作出 280 nm层析曲线 .根据洗脱峰 ,收集 D ( 565 nm ) /D ( 280 nm)比值大于 4
的样品 .以上缓冲液中均含有 0.2 mol· L- 1的 NaCl,以消除非特异性吸附 .
1. 5. 5　凝胶过滤层析　将上述经 HA纯化后的样品再进行一次凝胶过滤 ,介质为 Superdex200 HR、
Sephacryl S-200 HR或 Sepharose 6B中的任何一种 .向 1.6 cm× 80 cm的凝胶过滤柱顶上样 400μL,待样
品进入柱中后用洗脱液洗脱 ,流速 9 mL· h- 1 .每管收集洗脱液 3 mL,并测其 D ( 280 nm)和 D ( 565 nm ) ,
作出 280 nm层析曲线 .根据洗脱峰和 D ( 565 nm ) /D ( 280 nm)比值 ,收集样品 .洗脱液为 0.01 mol· L- 1
的 PBS( pH 7.0,含 0.1或 0.2 mol· L- 1 NaCl) .
1.6　藻红蛋白纯度的光学表示法
藻红蛋白纯度以藻红蛋白溶液在最大可见吸收峰波长下的光密度值与蛋白质的特征光密度值之比
[D ( 565 nm ) /D ( 280 nm) ]来表示 .
1.7　藻红蛋白 Native-PAGE纯度的测定
参考文献 [5 ]和郭尧君 [6 ]的方法 .电泳条件为含质量分数为 4%的浓缩胶和质量分数为 7. 5%的分离
胶 ,电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸缓冲液 .
1.8　藻红蛋白可见光光谱特性的测定
在室温下将上述分离纯化的藻红蛋白 ( pH 7.0, 0. 01 mol· L- 1 PBS) ,用 UV-1600紫外分光光度计对
其 400- 700 nm的可见光吸收区域进行扫描分析 .
1.9　藻红蛋白荧光光谱特性的测定
在室温下将纯化的藻红蛋白 ( pH 7.0, 0.01 mol· L- 1 PBS)在 Hitachi 850型荧光分光光度计上测定其
荧光激发光谱 .在已知激发波长的情况下 ,测定其荧光发射光谱 .
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2　结果与分析
2.1　珊瑚藻藻红蛋白柱色谱层析的分离纯化
2. 1.1　 DEAE-Sepharose FF柱层析　样品上样后被压缩吸附在柱层顶端 ,形成一层红色区带 ,随洗脱梯度
的增加 ,依次出现 3个蛋白峰 .首先出现 2个低而宽的无色蛋白峰 ,紧接着是一红色蛋白峰 (图 1) ,即目的
蛋白峰 .
图 1　珊瑚藻藻红蛋白 DEAE-Sepharose FF柱层析图谱　　　　　图 2　珊瑚藻藻红蛋白 HA柱层析图谱
Fig. 1　 The absorption spectra of PE collection af ter DEAE-　　　　　　　　 Fig. 2　 The absorption spectra of PE collection
Sepharos e FF colum n ch romatograph y　　　　　　　　　　　　　　　　　 af ter HA column ch romatography
2. 1.2　 HA柱层析　上样后 ,样品被吸附于柱子上端 ,形成一层红色区带 ,洗去其中不能吸附的部分时 ,流
出少量淡红色液体 ,向其中加入体积分数为 10%的三氯乙酸 ( TCA) ,无沉淀反应 ,加入固体 ( N H4 ) 2 SO4至
100%饱和度 ,静置 1周后仍无沉淀出现 ,据此推测该淡红色液体为藻红蛋白脱落的色基 .在洗脱过程中 ,
红色区带随磷酸盐离子浓度的提高而逐渐出现一个明显的红色洗脱峰 (图 2) .
2. 1. 3　凝胶过滤层析　先后使用 3种凝胶过滤介质对上述样品进行进一步纯化 ,从纯度来看 ,
Superdex200 HR和 Sephacryl S-200 HR的分离效果比 Sepharose 6B的好 .样品经过不同介质的凝胶过滤
后 ,出现的 2个相连的蛋白质吸收峰均呈红色 ,第 2个峰颜色较淡 (图 3) ,第 1个峰为目的蛋白峰 .
2.2　藻红蛋白的各级纯化结果
表 1中列出了 3种不同的分离纯化程序 .粗提液中 R-藻红蛋白纯度很低 (仅 0. 23) ,经 ( N H4 ) 2 SO4分
级沉淀后 ,有所上升 ( 0.60) ;经 DEAE-Sepharose FF和 HA柱层析后 ,纯度高达 5.60.据文献报道 [7 ] ,纯度在
4. 5以上的为藻红蛋白纯品 .对纯度为 5. 60的样品进行凝胶过滤 ,纯度高达 11.19.从表 1可知:方法Ⅱ中 ,
不经 HA纯化的样品 ,即使进行凝胶过滤 ,纯度仍然达不到要求 ;而方法Ⅲ中 ,粗提液经 HA就可达到与方
法Ⅱ相近的纯度 .说明 HA柱层析是提取藻红蛋白乃至藻胆蛋白的一有效手段 ,同时也说明我们自制的
HA介质可以较好地应用于藻红蛋白的纯化 .
　表 1　 R-藻红蛋白各级纯化结果
　 Table 1　 The purity standard of R-PE
分离程序 D(565 nm) /D(280 nm )方法Ⅰ 方法Ⅱ 方法Ⅲ
粗提液 0.23 0.23 0.23
( NH4) 2 SO4盐析 0.60 0.60 -
DEAE-Seph arose FF层析 3.00 3.00 -
HA层析 5.60 - 4.37
凝胶过滤层析 11.19 4.39 -
2.3　藻红蛋白纯度的 PAGE鉴定
经凝胶过滤和 HA纯化后的 R-藻红蛋白 ,经
PAGE电泳后 ,未经染色 ,在胶上只有 1条红色电
泳带 ;经染色后 (图 4) ,仍然只见 1条染色带 ,说
明经上述方法纯化的藻红蛋白已经达到电泳纯 .
而 HA纯化后的 R-藻红蛋白在胶上部可见 1条
微弱的杂蛋白带 ,可见凝胶过滤步骤不可缺省 .
·497·第 4期 王盛等: 珊瑚藻藻红蛋白分离纯化技术及光谱学特性
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
图 3　珊瑚藻藻红蛋白凝胶过滤层析图谱　　　　　　　　 1- 3. HA柱层析样品 ; 4- 6.凝胶过滤样品 .
Fig. 3　 The absorption spectra of PE collection　　　　　　　　　　图 4　藻红蛋白 PAGE图谱
af ter gel fi lt ration column ch romatog raph y　　　　　　　　　　　　 Fig. 4　 PAGE gel elect roph oresi s of pure PE
2.4　藻红蛋白可见光光谱学特性
R-PE在 565 nm和 498 nm处存在 2个完全吸收峰 , 545 nm为吸收肩峰 , 565 nm为最大吸收峰 (图
5) ,这与前人报道 [8 ]的双峰型 R-藻红蛋白可见光光谱特性基本一致 .
2.5　藻红蛋白荧光光谱特性
对 R-PE进行 200- 500 nm的荧光激发情况进行研究 ,结果表明 R-PE在此范围内存在 458、 376和
310 nm 3个荧光激发峰 .分别用 3种不同波长对 R-PE的荧光发射情况进行研究 (图 6) ,在 3个不同波长
激发下 , R-PE的发射峰位置基本一致 ,位于 584 nm左右 ,其中 458 nm的荧光激发强度最大 .因此 ,选用
458和 584 nm作为其最适荧光激发和发射波长 .前人研究认为 , R-PE的最适荧光激发和发射波长分别为
490和 578 nm[9 ] ,这与我们的研究结果不同 ,可能是 R-PE间色基含量差异较大造成的 .此外 ,珊瑚藻 R-
PE的 Stokes位移为 126 nm,远远超过一般荧光试剂的 Stokes位移 ( 80 nm) ,因此可作为理想的荧光标记
试剂 .
图 5　 R-PE的可见光光谱　　　　　　　　　　　　　　图 6　 R-PE的荧光发射光谱
Fig. 5　 The absorption spectra of R-PE　　　　　　　　　　　　 Fig. 6　 Fluorescence-emission spect ra of R-PE
3　讨论
以珊瑚藻为材料 ,对其进行分离纯化和光谱学性质研究 .在最初分离纯化程序中 ,我们选用了离子交
换和凝胶过滤 2种分离纯化手段 ,但都很难达到令人满意的效果 .后来引入自制的羟基磷灰石 ( HA)柱层
析后 ,藻红蛋白分离纯度高达 11左右 .为了进一步验证 HA在藻红蛋白分离纯化中的作用 ,用珊瑚藻粗提
液进行 HA柱层析 ,分离纯度与离子交换层析加凝胶过滤层析的相差不大 .此外 ,还以另一种未知种属的
·498· 福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 31卷
红藻为材料 ,用 HA进行分离纯化 ,也获得了满意的结果 ,说明 HA在藻红蛋白的分离纯化上极具应用价
值 .由于其可自行制备 ,成本较低 ,因此可以广泛应用于藻红蛋白的纯化 .但是在试验中还发现: 仅用 HA
柱层析进行分离纯化 ,得到的样品经 PAGE鉴定 ,发现其中还存在杂蛋白 ;经凝胶过滤后 ,杂蛋白带消失 ,
但光谱学纯度并未大幅度提高 .将该样品进行琼脂糖凝胶电泳 ,发现其中存在大量核酸 ;用链霉素处理后 ,
核酸带消失 ,但是其纯度仍未提高 ,反而有不同程度的下降 .在 HA柱层析洗柱过程中 ,发现有大量红色洗
脱液流出 ,据此推测链霉素对其色基影响较大 ,不能用来去除样品中的核酸 .由于盐析和离子交换层析可
去除部分核酸 ,因此最终选择了盐析、离子交换、 HA和凝胶过滤的分离纯化程序 .王勇等 [10 ]在螺旋藻藻蓝
蛋白的分离纯化中先使用凝胶过滤 ,再进行离子交换、 HA,最后再经凝胶过滤的分离纯化程序 ,获得了纯
度高达 14的藻蓝蛋白产品 .但是 ,一般认为一个较好的分离纯化方案中各纯化方法的排布 ,应先选用粗
放、快速 ,有利于缩小样品体积和后续处理的方法 ,精确、费时及需样品量少的方法应后选 [ 11] ,这有利于获
得大量样品以及该产品在工业化生产上的应用 .
参考文献:
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(责任编辑:叶济蓉 )　　
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