全 文 ：委内瑞拉产地龙须菜藻红蛋白基因
的克隆及其系统学研究
隋正红　张学成
(中国海洋大学海洋生命学院 ,青岛 266003)
摘　要　本文报道了红藻 Gracilaria lemaneiformis委内瑞拉株的藻红蛋白基因的部分序列 ,将所得
序列与其它红藻 -Rhodella violacea , Poly siphonia boldii , Griff ithsia monolis, Porphy ra tenera ,
Porphy ra yezoensis及青岛产龙须菜的相应序列对齐后 ,进行了系统学研究。结果显示 ,同一属的藻红
蛋白α和 β亚基之间的间隔序列 ,从长度到核苷酸序列均非常相似 ,而同一科不同属或同一目的科间
的该序列有很大的不同 ;两不同产地龙须菜的 PE基因在 β亚基上的转换多于颠换 ,说明 β亚基比α
亚基保守 ;委内瑞拉来源龙须菜与青岛产地龙须菜可能不属于同一物种 ,应为同属不同种关系 ;由藻
红蛋白基因所得的系统树包括 3个与建立在形态标准上的遗传位置一致的分支 ;藻红蛋白基因序列
可用于种间及更高地位的分子系统研究。
关键词　龙须菜 ;藻红蛋白基因 ;系统学
中图法分类号　 Q946. 1　　　　　文章编号　 1001-1862( 2003) 03-384-07
江蓠是藻胶的重要来源之一 ,在印度和智利得到大规模培养 [1-2 ] ,江蓠属的龙须菜在中国、
日本、南非、委内瑞拉等国家是重要的产藻胶红藻 ,除应用于生产外 ,该种在生理和遗传学研究
中也有重要意义 [3 ]。种属地位的确立对理论研究和大规模培养均是不可缺少的 ,另外还将促进
对藻类资源的应用及遗传育种和对藻类的遗传操作 [4-5 ]。而龙须菜的分类地位存在分歧 [4, 6 ]。本
文中 ,作者克隆了委内瑞拉产地龙须菜的藻红蛋白基因 ,并将其应用于红藻系统研究。 结果显
示委内瑞拉来源的龙须菜与青岛产地的龙须菜可能属于同属的不同种 ;由藻红蛋白基因所得
的系统树将几种红藻分成 3个与建立在形态标准上的遗传位置一致的分支 ,藻红蛋白基因序
列在分辨不同种及对在种的水平及更高地位的分子系统研究中是有用的。
藻红蛋白聚合体加上藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白聚合体及连接蛋白构成藻胆体 ,藻胆体存在于
红藻、蓝藻、部分甲藻和隐藻中 ,在捕获光能进行光合作用过程中有重要作用。藻胆体在类囊体
膜表面形成紧密结构 ,光能由藻红蛋白捕获 ,沿藻蓝、别藻蓝蛋白顺序传递 ,最终传递到在类囊
体膜的叶绿素 a进行光合作用。藻红蛋白由 3种不同亚基组成-α、β、γ,在聚合体中以 6∶ 6∶ 1[7 ]或
6∶ 3∶ 1[8 ]的比例存在。一些红藻的α,β亚基研究的较多 ,它们由质体基因组编码 ,常形成从 β
到α排列的 1个操纵子 [9-10 ]。
第 33卷　第 3期　
2003年 5月　 　　
青 岛海 洋 大学 学 报
JOU RNAL O F OCEAN UNIV ERSITY OF QINGDAO 　　　　
33( 3): 384～ 390
May, 2003

通讯联系人
国家自然科学基金项目 ( 39670405及 30000126)资助
收稿日期: 2002-05-14;修订日期: 2003-03-01
隋正红 ,女 , 1969年出生 ,博士 ,副教授。
1　研究方法
1. 1材料　　委内瑞拉产地龙须菜由 Marianne Pedersen博士 (瑞典 Uppsala大学 ,植物生理
系 )惠赠。
1. 2 DN A分离　　 DN A提取按 Pa tw ary方法 [11 ]略作修改。 藻体在液氮中研磨粉碎 ,加 1～
2mL /g藻重 CTAB抽提缓冲液 ( cetyl t rimethy l ammonium bromide) [ 100mmol Tris-HCl
( pH8. 0) , 20mmol EDTA, 1. 4mol NaCl, 3%十六烷基溴化铵 ( w /v ) , 0. 2% β -巯基乙醇 ],然后
在 60～ 65℃ 温浴 30min,并轻柔震荡 ,之后加蛋白酶 K至终浓度 500μg /mL, 50℃ 3h,用等体
积氯仿 /异戊醇 ( 24∶ 1)抽提几次 ,取上清加入 2 /3体积的异丙醇 , 15 000r /min离心沉降 ,用
70%乙醇洗沉淀 ,真空抽干。 37℃下 ,把核酸溶在 100～ 200μL TE1 [10mmo l Tris-HCl , ( p H
8. 0) , 1mmol ED TA ]中 10～ 15min,离心 ,在不干扰沉淀的情况下 ,把主要含核酸及一些小分
子多糖的上清液移离离心管 ,留下主要由多糖及附着核酸组成的沉淀 ,加入 RNase至终浓度
100μg /mL, 37℃消化 30min。用 Pha rmacia Gene Quant RN A /DN A calculato r进行 DNA浓度
测定。
1. 3 PCR　　引物由上海生工公司合成 ,正向引物序列为 5 -ACCGTCGT ATGGC ( AT )
GCT T-3 ,反向引物序列为 5 -GCACC( TCA) GC( GA) AT ACCCCAT T-3 。在 PE-9600(美国
PE公司 )循环仪上进行 PCR扩增 ,循环参数为 94℃ 80s, 52℃ 2min, 72℃ 80s, 35个循环。
1. 4基因分离　　目的片段以低熔点胶琼脂糖法回收 ,连入 dT载体 [12 ] ,以一般实验方法 -互
补筛选及与上述相同的条件进行 PCR扩增选择重组体 [13 ]。
1. 5测序和分析　　在 PE-ABI377DN A测序仪上进行序列测定 ,序列分析软件为 DNASIS
(v er 5. 0) , CLUST AL X ( ver 1. 8)和 TREEV IEW ( ver 1. 5. 2)。
2　结果
2. 1委内瑞拉来源龙须菜 PE基因克隆　　经 PCR扩增获得委内瑞拉产地龙须菜 lv的部分
PE基因序列 ,并被 Genbank收录 ,序列号分别为 AF275686。与已知的红藻 PE基因比较 [ 9] ,可
知所得序列位于 β亚基的近碳端、α亚基的近氮端 ,包括 β亚基部分 309个核苷酸 , α亚基部分
167个核苷酸 ,以及 56个核苷酸的间隔序列 ;可编码 β亚基的 102个氨基酸和α亚基的 55个
氨基酸。其中可见α亚基的核糖体结合位点。与青岛产龙须菜 [14 ]相应基因的核苷酸及氨基酸
序列对齐图 (图 1, 2)。
2藻株的对应基因序列极为保守 ,核苷酸的相似性为 95. 1% ,氨基酸的相似性为 98. 7%。
氨基酸仅有 2个不同 ,由 qd中的 I90和 D154替换成 lv中的 V 90和 E154 (见图 2)。
2者间的碱基替代见表 1。 2藻株总共发生了 19个核苷酸的转换 ,占 2株间不同核苷酸总
数的 79. 1% ;只有 4个核苷酸是颠换 ,占 20. 9% 。在总共 19个转换的核苷酸中有 13个发生在
β亚基 , 4个颠换中有 3个发生在α亚基。
3853期 隋正红 ,等:委内瑞拉产地龙须菜藻红蛋白基因的克隆及其系统学研究
　 lv　 AACCGTCGT ATGGCT GCTT GTCTACGCGATGGAGAAAT TAT TT TAAGATAT GTATCT TATGCTCT ACT TGCAGGCGATCCATCT GTT T TAGAAGATCGTT　　 100
　qd　 AACCGT CGTAT GGCTGCT TGT TT ACGCGATGGAGAAATT ATT T TAAGATATGT ATCTT ATGCT CT TCTT GCAGGCGATCCATCTGT TT T AGAAGACCGTT　　 100
* * *
　 lv　 GTT TAAATGGT TT AAAAGAAACTT AT AT CGCT CT TGGCGTACCAACAAAT TCT TCT GTAAGAGCTGTAAGCAT TAT GAAAGCAGCTGCTGTT GCATT CAT　　 200
　qd　 GT TT AAAT GGT T TAAAAGAGACT TAT ATT GCTCTT GGT GT GCCAACAAAT TCTT CTGT AAGAGCT GTAAGTAT TATGAAAGCAGCTGCT GTT GCATT T AT　　200
* * * * * *
　 lv　 TT CT AATACAGCT TCTCAAAGAAAAAT GGAT ACAACT AGT GGAGATT GCTCTGCACTATCTT CAGAAGT TGCTAGCT ACTGTGAT AGAGTGT GCTCTGCT　　 300
　qd　 T TCTAAT ACAGCTT CT CAAAGAAAAATGGATACAACAAGTGGAGAT TGT TCTGCACTATCTT CAGAAATT GCTAGCT ACTGT GAT AGAGT ATGCT CTGCT　　300
* * * *
　 lv　 ATT AGCTAAgctg aataccataaag tgtacatataagctacatatatct taataggagataaat tAT GAAAT CAGTT ATT ACT ACTGT AATT AGT GCAGC　　 400
　qd　 AT TAGTT AAgca- aatactataaagtatacatataagctacatatatct taataggagataaattATGAAATCAGT TAT TACTACT GTGATT AGT GCAGC　　 399
* * ^ * * *
　 lv　 TGATGCTGCT GGACGCT TT CCGACTAGTT CAGATCTT GAAT CTGT ACAAGGT AATATCCAACGTGCAGCT GCAAGACTAGAAGCTGCAGAAAAAT TAGCA　　500
　qd　 T GAT GCTGCTGGACGT T TT CCAACT AGTT CAGATCT TGAATCTGT ACAAGGT AAT AT ACAACGCGCTGCT GCAAGAT TAGAAGCTGCAGAAAAAT TAGCA　　499
* * * * * *
　 lv　 GACAAT CAT GAGGCAGTT GTAAAAGAGGCTGG　　 532
　qd　 GACAACCAT GATGCAGTT GTAAAAGAGGCTGG　　 531
* *
图 1　不同产地龙须菜 PE基因部分序列对比
(大写字母为结构基因 ,小写字母为基因间隔区 , lv为委内瑞拉株 , qd为青岛株。
* 示 2株中不同核苷酸 , ^ 示插入的核苷酸 )
Fig . 1 Alignment o f pa rtia l nucleo tide sequence o f phycoery thrin
genes o f Gracilaria lemaneiformis f rom diffe rent o rigins
( lv stands for Vene zuela st rain. qd stands for Qingdao strain. * designate differ ent nucleo tide between
the t wo strains. ^ designa tes inser tion site. Capita lized letter s are coding nucleo tide, while minuscule
ones ar e that within spacer r eg ion)
　 qd　 NRRMAACLRDGEIILRYVSYALLAGDPSVLEDRCLNGLKETYIALGVPTNSSVRAVSIM KAAAVAFISNTASQRKM DT TSGDCSALSSEIASYCDRVCSAIS(- )M KSVIT TVISAADAA　 120
　 lv　 NRRMAACLRDGEIILRYVSYALLAGDPSVLEDRCLNGLKETYIALGVPTNSSVRAVSIM KAAAVAFISNTASQRKM DT TSGDCSALSSEVASYCDRVC SAIS(- )M KSVITTVISAADAA　 120
*
　 qd　 GRF0PTSSDLESVQGNIQRAAARLEAAEKLADNHDAVVKEA　　 160
　 lv　 GRFPTSSDLESVQGNIQRAAARLEAAEKL ADNHEAVVKEA 160
*
图 2　不同产地龙须菜 PE氨基酸序列对比
( *示 2株中不同氨基酸 , ( -)示基因间隔 )
Fig . 2 Alignment of deduced amino acids sequence o f PE o f
Gracilaria lemaneif ormis fr om differ ent origins
( lv stands for Venezuela strain. Qd stands fo r Qingdao strain. * designa te differ ent residues between
them. ( - ) designa tes g ene spacer )
2. 2基于 PE序列的系统树　　龙须菜 PE基因序列与其它红藻 Rhodel la violacea ( RV ) [10 ]、
Poly siphonia boldii ( PB ) [15 ]、 Aglaothamnion neglectum ( AN ) [ 9]、 Gri f f ithsia monolis
( GM )

Porphyra tenera ( PT)
[ 16 ]和 Porphyra yezoensis ( PY) [ 17]的收录在 Genbank中的 PE基
因序列对齐后进行比较。该序列高度保守 ,在所分析的红藻中完全相同的核苷酸占 54. 2% ,每
2株间的遗传距离见表 2,该数值从 0. 279( RV与 GM )到 0. 008( PT与 PY)不等。由上述报告
序列及其它红藻 PE序所的得系统树见图 3,可得到 3个分支 ,以 lv与 qd, PY与 PT的亲源关
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Rit ter S, Hi ller R G, Sh arples F P, et al. Gri ff ithsia monolis R-ph ycoery th rin g ene, alph a and beta subuni t s.
( Genbank Acces sion No. Z98528) in High res olut ion st ructu re of a ph ycourobilin-containing R-ph ycoery th rin
系分别最近 ,其中 PT与 PY的遗传距离要小于 lv与 qd间的。
表 1　不同产地龙须菜 ( qd和 lv ) PE基因部分序列间碱基替代
Table 1　 Base substitution of PE genes be tween qd and lv
替代类型 β亚基 (核苷酸 ) α亚基 (核苷酸 ) 总数 (核苷酸 )
T ype of W ithin β Withinα Total( nucleo tide
substitution subunit( nucleo tide acid) subunit( nucleo tide acid) acid)
( qd→ lv )
转换
T ransition
T→ C 7 2 9
T→ A 1 0 1
C→ T 1 2 3
G→ A 2 1 3
A→ G 2 1 3
总数 13 6 19
To tal
颠换
T ransver sion
A→ T 1 0 1
A→ C 0 1 1
T→ A 0 1 1
T→ G 0 1 1
总数 1 3 4
To tal
总计 14 9 23
Summation
注: qd-龙须菜青岛株 , lv-龙须菜委内瑞拉株 , PE是藻红蛋白。
3　讨论
图 3　基于 PE基因的红藻系统树 .
Fig. 3　 Phylogenetic tr ee of som e red a lg ae species
based on the PE sequence.
lv与 qd按传统分类方法为同
一物种 Gracilaria lemaneiform is ,
是该种的不同种群。 而本文的一
些研究结构显示 lv可能不属于
龙须菜种 , 1个原因是 2者的距
离 ( 0. 049)比紫菜属的 PT、 PY
种间的大 (表 2) ,而从构建的红
藻种系发生图来看 (图 3) ,紫菜 2
个种的进化速度要快于江蓠的 ,
另 1个是因为 2株相距遥远 ( 1
个在亚洲 , 1个在南美洲 ) ,在形
3873期 隋正红 ,等:委内瑞拉产地龙须菜藻红蛋白基因的克隆及其系统学研究
态上也有差异 ,青岛株的枝条粗大 ,较硬 ,而委内瑞拉株的枝条细软 ,颜色偏红 ,而且 2者不能
杂交 (未发表结果 ) ,因此它们可能为同属不同种。当然 , 2者分类地位的最终确定还需要更多的研
究数据。
PE的 3个特性使之在生物进化研究中具有重要作用。 第 1,其核苷酸及氨基酸序列在不
同种间的比较中显示了很高的保守性。青岛产地与委内瑞拉产地种间的碱基替代多为 T-C间
的 ,这种转换对于维持氨基酸的恒定很重要 ,从而保证蛋白质生化性质的稳定。第 2,αβ亚基间
的间隔区在种、属水平上是保守的 ,同一属的间隔区从序列一级结构到碱基个数非常相似 ,如
lv的间隔区有 56个核苷酸 , qd有 55个核苷酸 ,在紫菜属中的 2个种 -PT与 PY均有 74个碱
基 ,而在同一科的不同属中 ,则有了很大的变异 ,如 AN和 GM同属仙菜科 ,而它们的间隔区
则分别有 108和 54个 ,因此该间隔序列在分类研究中具有重要意义。 第 3,β亚基相比 α亚基
更加保守 ,由表 1看出 ,在 β亚基亚基上发生的多为转换 ,而非颠换 ,这对维持氨基酸的恒定非
常重要 ,另有报道在螺旋藻 ( Spi rulina)中也存在这种情况 [ 18]。
一些 rRN A基因或基因间隔区被采用用于系统研究 [19-20] ,从本文的结果来看 , PE也具有
用于系统研究的内在本质。 作为光合器官的重要组成部分 , PE维持其稳定性很有必要。 lv与
qd的氨基酸序列几乎一样 ,仅有 2个属同一极性群的氨基酸的替代 ,同一属不同种间的相似
性 (如在紫菜属内 ) ,比属间的高 ,如紫菜的 2个种间的变异是 2% ,而所有紫菜种与仙菜科
( AN、 GM和 PB)和紫球藻科种 ( RV )的差异是大约 22. 4% ～ 26. 3% (表 2) ,该序列在同一属
和不同科和目的属间可对准 ,因此可用于种及更高地位的系统比较。
表 2　基于 PE基因的红藻间遗传距离
Table 2　 Genetic distance betw een red alg ae based on PE
qd lv PB GM AN PT PY
lv 0. 049
PB 0. 224 0. 215
GM 0. 229 0. 243 0. 235
AN 0. 231 0. 233 0. 242 0. 214
PT 0. 218 0. 215 0. 263 0. 258 0. 241
PY 0. 215 0. 210 0. 257 0. 256 0. 237 0. 008
RV 0. 231 0. 245 0. 278 0. 279 0. 276 0. 225 0. 224
注: qd-龙须菜青岛株 , lv-龙须菜委内瑞拉株 , RV (Rhodella violacea ) , PB( Polysiphon ia bold ii ) , GM (Gr if f ithsia monolis ) ,
PT (Porph yra tenera ) , PY( Porphyra yezoensis ) , AN( Aglaothamn ion neglectum )。
基于 PE的系统树将这些红藻分成 3个分支 ,紫菜与红毛菜亚纲的 RV接近 ,而与真红藻
亚纲的另 2支 ( PB、 GM和 AN)远离 ,这与建立在形态标准上的遗传分类是一致的。
lv的 GC含量是 38. 1% ,比 qd和其它红藻的稍高。PE基因密码子的 3′显示了高 A T含量
的倾向 ,这一性质与其它质体基因的特性是一致的 [21 ]。
其它的藻胆蛋白基因 ,如藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白基因也被应用于生物进化研究 ,用藻胆蛋
白氨基酸序列的演化研究揭示了藻胆蛋白的高度保守性 ,所有的藻胆蛋白可能起源于 1个共
同的祖先 ,而真核生物藻胆蛋白基因均从一原核生物演化而来 [22 ]。一些比较保守 ,并且广泛在
的蛋白基因也为生物进化研究提供了重要的资料 和数据 [23-24]。
PE序列分析在系统学研究中可以区别不同的种 ,对于分类地位不清的种 ,可以初步加以
判定 ,除了系统学研究外 , PE序列分析提供了 1种可用于确定目前被大规模培养生产藻胶的
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重要经济种的方法 ,对精确定位野生种以应用于未来的水产养殖也是非常有价值的。
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Cloning of Phycoerythrin Genes of Gracilar ia lemaneiformis
(Rhodophyceae ) from Venezuela and Its Phylogenic Studies
Sui Zhenghong　 Zhang Xuecheng
(College of Marine li fe Sciences , Ocean University
of China , Qingdao 266003, China )
Abstract　 Partial nucleo tide sequences o f phycoerythrin ( PE) of Venezuelan strain ( lv )
of Gracila ria lemaneifo rmis ( GL) a re documented in the present paper. By aligning the
nucleo tide wi th that of o ther red alg a, Rhodel la v iolacea ( RV ) , Polysiphonia boldii
( PB) , Gri f f ithsia monolis ( GM ) , Porphyra tenera ( PT) , Porphy ra yezoensis ( PY) ,
Aglaothamnion neglectum ( AN ) and Qingdao st rain o f GL ( qd ) , the molecular
sy stematic rela tionship of them were surveyed. The simi lari ty of both the spacer leng th
and the nucleo tide sequence of alfa and beta subuni ts of PE wi thin a genus w ere
exhibited, w hi le there w as g rea t va riety in dif ferent genera w ithin the same family or
interfami ly o f the same o rder. There w ere mo re t ransi tio ns than transversions in the
beta subuni t o f PE gene betw een th e tw o Gracilaria st rains, indicating that beta subuni t
i s more conserv ed than alfa subunit. It is suggested tha t lv and qd may no t belong to the
same species. They may be dif ferent species of the same genus. The phylog enic t ree
deriv ed by PE divides the tax a into three clades tha t co rrela te wi th the generic
assignment based on morpho logical criteria. The sequence of PE genes is a useful to ol
fo r molecular phylog enic studies among dif ferent species and a t higher tax onomic lev els.
Key words　 Gracilaria lemanei formis; phycoerythrin gene; phylo geny
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