全 文 ：第 33 卷 第 2 期 应 用 海 洋 学 学 报 Vol. 33，No. 2
2014 年 5 月 Journal of Applied Oceanography May，2014
一种绿色真江蓠的分子鉴定
钟晨辉，黄瑞芳，林 琪，郑雅友，李雷斌，刘 波
收稿日期:2013-09-23
基金项目:国家海洋局海洋公益性行业科研专项资助项目(201105008);福建省属公益类科研院所基本科研专项资助项目(2011Ｒ1003-1);
福建省水产研究所青年科学创新基金资助项目(014003)
作者简介:钟晨辉(1984 ～)，男，助理研究员，博士研究生;E-mail:zhongchenhui@ 126． com
(福建省水产研究所、福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)
摘要:应用 rDNA-ITS 和线粒体 cox1 片段扩增序列，分析了厦门杏林湾的 2 株绿色未知江蓠
(Gracilaria sp．;四分孢子体 GＲ-1 和雌配子体 GＲ-2)及 2 株紫褐色真江蓠(G． vermiculophylla;四分
孢子体 PU-1 和雌配子体 PU-2)．运用 MEGA5． 0 估算了 4 个供试样本与 GenBank 中相似度最高序
列的遗传距离并构建了系统发育树． ITS序列分析显示绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 都与真江蓠聚集
在一起，推断两者与真江蓠的亲缘关系非常近． cox1 片段序列分析表明，绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2
和紫褐色真江蓠 PU-1、PU-2 都与索引的真江蓠聚集在相同类群． 其中 GＲ-1、GＲ-2 与真江蓠
JQ619142、JQ619143 的相似度都为 100%，它们之间的遗传距离范围在 0． 000 ～ 0． 002，低于种群内
部的遗传距离范围 0． 000 ～ 0． 015，从分子水平上确定了绿色未知江蓠是真江蓠． 联合 ITS 和 cox1
片段序列的分子标记适用于真江蓠的种质鉴定．
关键词:海洋生物学;真江蓠;绿色;ITS;cox1;分子鉴定
DOI:10． 3969 /J． ISSN． 2095-4972． 2014． 02． 005
中图分类号:P735 文献标识码:A 文章编号:2095-4972(2014)02-0183-07
江蓠科(Gracilariaceae)海藻是我国沿海地区广
泛自然分布和栽培的大型经济红藻，包括真江蓠
(Gracilaria vermiculophylla)、细基江蓠(G． tenuistipi-
tata)、细基江蓠繁枝变种(G． tenuistipitata var． liui)、
龙须菜(G． lemaneiformis)等 20 多种江蓠［1-3］． 江蓠
科海藻种类多，由于缺乏充足的形态学和生殖器官
结构特征，加上种内藻体还存在自然生态变型，形态
变化复杂导致难以用传统的分类方法进行种质鉴
定［4-6］．随着现代分子生物学的快速发展，基于分子
水平的 18S rDNA［7-8］、SSU rDNA［7］、ITS［7，9-11］、ＲuBi-
sco［12］、rbcL［13-15］、cox1［16-18］等序列标记，已被运用到
江蓠科海藻的系统发育关系研究以及江蓠种质鉴定
和分类．
2012 年 12 月，笔者在福建省厦门市杏林湾开
展江蓠海藻资源调查时，发现了一些少量分布的绿
色未知江蓠(Gracilaria sp．)，在色泽上与藻场优势
种紫褐色真江蓠有着明显的差异． 绿色未知江蓠与
紫褐色真江蓠藻体都有四分孢子体和雌配子体上的
成熟果孢子体等有性繁殖基本特征，但是外部形态
特征有着一定的分化，未能单凭形态学数据进行确
切的种质鉴定． ITS 序列包括 ITS1 和 ITS2 两部分，
两者之间由高度保守的 5． 8S rDNA 相连，由于进化
相对迅速而具多态性，适合于等级水平较低的系统
学研究［19］． cox1 是线粒体基因中的细胞色素 c 氧化
酶第 1 亚基基因，比核基因组突变率更高，用以分析
物种间的进化关系［20］． 因此，本研究采用了 rDNA-
ITS和线粒体 cox1 基因片段的双分子标记 PCＲ 扩
增序列，与 GenBank 数据库内江蓠科海藻相关的
ITS和 cox1 片段序列进行 BLASTn 比对和系统发育
分析，对绿色未知江蓠和紫褐色真江蓠进行了分子
水平的遗传分析和种质鉴定，旨在明确该绿色江蓠
的确切种质，为其种质发掘与利用提供基础资料．
1 材料和方法
1. 1 材料采集
实验使用的健康江蓠藻体为紫褐色真江蓠和绿
色未知江蓠．清洗藻体附生物之后，挑选单株紫褐色
真江蓠的四分孢子体和雌配子体分别标记为 PU-1、
PU-2;绿色未知江蓠的四分孢子体和雌配子体分别
标记为 GＲ-1、GＲ-2．以上材料全部采自福建省厦门
·184· 应 用 海 洋 学 学 报 33 卷
市杏林湾的潮间带海区．
1. 2 模板 DNA的制备
利用天根生化科技(北京)有限公司的植物基
因组快速提取试剂盒，分别提取了 4 个供试藻株材
料的总 DNA． 电泳检测合格后，将质量好的模板
DNA置于 － 20℃冰箱内保存备用．
1. 3 ITS和 cox1 的 PCＲ扩增及其产物检测
参照 Candia 等(1999)报道的 ITS 扩增引物序
列［21］:正向引物 5’-GGGATCCGTTTCCGGTAGGT-
GAACCTGC-3’，反向引物 5’-GGGATCCATATGCTTA-
AGTTCAGCGGGT-3’．反应体积:含 10 mmol /dm3 Tris-
HCl(pH = 8． 3)，50 mmol /dm3KCl，1． 5 mmol /dm3
MgCl2，正向和反向引物各 5 ～6 mmol /dm
3，4 种 dNTP
各 2 mmol /dm3，模板 DNA 40 ng，Taq DNA 聚合酶
1U，其余用双蒸水补满至 25 mm3． 反应参数设置为
95℃预变性 6 min;95℃ 1 min，45℃ 1 min，72℃ 2
min，35个循环;72℃保温 10 min． cox1 片段序列扩增
正向引物 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-
3’，反向引物 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT-
GG-3’． PCＲ反应体系含 10 mmol /dm3 Tris-HCl(pH =
8． 3)，50 mmol /dm3 KCl，1． 5 mmol /dm3 MgCl2，正向和
反向引物各 5 mmol /dm3，4 种 dNTP 各 1 mmol /dm3，
模板 DNA 20 ng，Taq DNA 聚合酶 1U，其余用双蒸
水补满至 25 mm3． 反应参数为 94℃预变性 6 min;
94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环，72℃
保温 10 min．所有 PCＲ反应产物在含有溴化乙锭的
1． 5%琼脂糖凝胶中电泳检测，用 2 000 bp 的 DNA
ladder作为分子量标记，凝胶成像系统下观察拍照．
1. 4 ITS和 cox1 的 PCＲ产物回收克隆、测序和数
据分析
将获得的目的扩增产物移交上海生物工程有限
公司进行回收、克隆和测序． 运用 GenBank 中的
BLASTn工具软件对测得的 ITS 和 cox1 基因片段序
列导入数据库中搜索同源 DNA 序列进行同源性比
对分析．将测得的 ITS序列用 CLUSTAL W软件进行
对位排列并进行适当的手工校正． 对位排列后的序
列用 MEGA5． 0 软件进行序列间的差异分析，选择
Kimura2-parameter和 Complete Deletion 计算遗传距
离，并用邻接法(Neigbor joining method)构建分子系
统发育树，自展检验(Bootstrap)估计系统发育树分
支节点的置信度，自举数据集为 1 000 次［22］．
2 结果
2. 1 绿色未知江蓠和紫褐色真江蓠的外部形态比较
绿色未知江蓠与紫褐色真江蓠在色泽上明显不
同，绿色未知江蓠藻体轻脆，分枝短小，成熟雌配子
体上的果孢子体稀疏，少数在分枝尖端长出囊果．而
紫褐色真江蓠藻体柔软，分枝较长，成熟雌配子体上
的果孢子体密集，呈球形(图 1)．
图 1 绿色未知江蓠和紫褐色真江蓠的外部形态
Fig． 1 Morphological observation of the green Gracilaria sp．
and the puce Gracilaria vermiculophylla
a．绿色未知江蓠四分孢子体;b．绿色未知江蓠雌配子体;
c．紫褐色真江蓠四分孢子体;d．紫褐色真江蓠雌配子体
2. 2 ITS序列分析
经过 ITS序列的 PCＲ 扩增，测序后切除冗余的
rDNA序列，紫褐色真江蓠 PU-1 的 ITS 长度为 1 418
bp(GenBank 获取号为 KF789519)，PU-2 的 ITS 长度
为 1 412 bp(GenBank获取号为 KF789520)，绿色未知
江蓠GＲ-1的 ITS长度为1 422 bp(GenBank获取号为
KF789521)，GＲ-2的 ITS长度为1 412 bp(GenBank获
取号为 KF789522)． 4 个江蓠样本的 5． 8S rDNA基因
长度都是 161 bp，其中 PU-1、PU-2、GＲ-1 的核苷酸序
列和 GeneBank 内的真江蓠 AY465829 的 5． 8S rDNA
完全一致，GC含量为 48． 45%，而 GＲ-2的 5． 8S rDNA
序列在 541 bp 处由 C 替换了 T，GC 含量为 49． 07%
(表 1)．所有 ITS序列通过 BLASTn搜索，发现得分最
高的 ITS有 3条索引记录，其中 PU-1、PU-2 和 2 条未
定种江蓠(Gracilaria sp． Mexico AF468906和 Gracilar-
ia sp． U21344)的相似度为 96%，与 1 条已知真江蓠
AY465829的相似度是 93%，遗传距离分别为 0． 019
和 0． 020，与绿色未知江蓠 GＲ-1 的遗传距离都为
2 期 钟晨辉，等:一种绿色真江蓠的分子鉴定 ·185·
0． 005(表 2)，结果初步推断绿色未知江蓠 GＲ-1 可能
是真江蓠．绿色未知江蓠与搜索到的 3 条 ITS 的相
似度也在 93% ～96%，其中 GＲ-1、GＲ-2 和已知的真
江蓠 AY465829 的相似度为 93%，遗传距离分别为
0． 019 和 0． 043(表 2)．由于得分最高的信息数据量
较少且存在未确定种的索引号，难以确定绿色江蓠
的确切种，但结果提示着绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2
均与真江蓠的亲缘关系较近．
表 1 4 个实验样本和真江蓠 AY465829 的 ITS序列分析
Tab． 1 ITS region sequences analyses of 4 experimental samples and G． vermiculophylla AY465829
江蓠样本
ITS1 5． 8S ITS2
长度 /bp GC含量 /% 长度 /bp GC含量 /% 长度 /bp GC含量 /%
PU-1 519 34． 10 161 48． 45 738 36． 99
PU-2 524 33． 78 161 48． 45 727 37． 41
GＲ-1 522 34． 10 161 48． 45 739 36． 40
GＲ-2 513 33． 72 161 49． 07 738 36． 86
AY465829 524 36． 26 161 48． 45 740 37． 30
表 2 基于 ITS序列的实验样本与真江蓠的遗传距离
Tab． 2 Genetic distances calculated from experimental samples
and G． vermiculophylla based on ITS sequences
样本 1 2 3 4 5
1
2 0． 005
3 0． 005 0． 005
4 0． 035 0． 036 0． 035
5 0． 019 0． 020 0． 019 0． 043
注:1． G． vermiculophylla PU-1;2． G． vermiculophylla PU-2;3． Gracilaria sp．
GＲ-1;4． Gracilaria sp． GＲ-2;5． G． vermiculophylla AY465829;“”表示无数据
2. 3 cox1 基因片段序列分析
相继地，进行了 cox1 基因的 PCＲ 扩增，测序结
果表明实验样本 PU-1 的扩增序列长度为 655 bp
(GenBank 获取号为 KF789526)、PU-2 的扩增序列
长度为 653 bp(GenBank 获取号为 KF789527)，GＲ-
1 的扩增序列长度为 655 bp(GenBank 获取号为
KF789528)、GＲ-2 的扩增序列长度为 658 bp(Gen-
Bank获取号为 KF789529)．将 4 条实验获得的 cox1
片段序列，通过 BLASTn搜索到得分最高的 49 条记
录全部为真江蓠，相似度在 99% ～ 100% ． PU-1、PU-
2 与搜索序列的相似度均为 99%，遗传距离范围在
0． 002 ～ 0． 015，并且 NCBI 中搜索到的已知真江蓠
之间的遗传距离范围在 0． 000 ～ 0． 010(表 3)．绿色
未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 都与 2 条索引号(真江蓠
JQ619142 和真江蓠 JQ619143)的相似度为 100%，
其中 GＲ-1 和 GＲ-2 与这 2 条索引序列的遗传距离
分别为 0． 002 和 0． 000，说明这 2 株绿色未知江蓠
全部为真江蓠．
表 3 基于 cox1 基因片段序列的实验样本与真江蓠的遗传距离
Tab． 3 Genetic distances calculated from experimental samples and G． vermiculophylla based on partial cox1 gene sequences
样本 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2 0． 000
3 0． 002 0． 002
4 0． 002 0． 002 0． 000
5 0． 002 0． 002 0． 002 0． 000
6 0． 002 0． 002 0． 002 0． 000 0． 000
7 0． 005 0． 005 0． 003 0． 003 0． 003 0． 000
8 0． 005 0． 005 0． 003 0． 003 0． 003 0． 003 0． 000
9 0． 005 0． 005 0． 003 0． 003 0． 003 0． 003 0． 000 0． 000
10 0． 015 0． 015 0． 013 0． 013 0． 013 0． 010 0． 010 0． 010 0． 010
注:1． G． vermiculophylla PU-1;2． G． vermiculophylla PU-2;3． Gracilaria sp． GＲ-1;4． Gracilaria sp． GＲ-2;5． G． vermiculophylla JQ619143;6． G． vermiculophylla
JQ619142;7． G． vermiculophylla JQ794754;8． G． vermiculophylla FJ499594;9． G． vermiculophylla GQ292872;10． G． vermiculophylla JQ794757;“”表示无数据
·186· 应 用 海 洋 学 学 报 33 卷
2. 4 系统学分析
采用 NCBI网站上的 BLASTn 软件进行同源性
比对分析的基础上，选取 GenBank 中已有的得分较
高的索引号，分别构建了 ITS 和 cox1 基因片段序列
的系统发育树．基于 ITS 序列的发育树(图 2)，显示
绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 及紫褐色真江蓠 PU-1、
PU-2 全部与真江蓠 AY465829 聚集在同一个大分
支，自展支持率 100%，明显不同于龙须菜属的龙须
菜 EU561239 和其他江蓠属海藻． 这就提示着绿色
未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 都是真江蓠． 其次，基于 cox1
基因片段序列构建的发育树(图 3)显示，4 个供试
样本与已报道的真江蓠被聚类成一个姊妹类群，自
展支持率是 100%，不同于其他江蓠科海藻．绿色未
知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 及紫褐色真江蓠 PU-1、PU-2 都
与真江蓠 JQ619142、JQ619143 聚类在相同类群，特
别是绿色未知江蓠 GＲ-1 和真江蓠 JQ619142、
JQ619143 序列完全一致，因此可以从分子水平确定
绿色未知江蓠是真江蓠．
图 2 基于 NJ法构建的 ITS序列的系统发育树(Kappaphycus alvarezii为外类群)
Fig． 2 Phylogenetic tree of ITS sequences constructed by NJ method，using Kappaphycus alvarezii as outgroup
3 讨论
本研究中采集的绿色未知江蓠是有性繁殖江蓠
种，藻体包括四分孢子体和配子体．该类型江蓠来自
历史上记载的真江蓠海藻分布海区［3］，因此与相同
地点的真江蓠进行了形态比较．据《中国海藻志》第
二卷红藻门第三册江蓠属［3］记载真江蓠的颜色呈
现紫褐色，有时略带绿或黄色，然而 2 种江蓠的外形
分枝和囊果分布上存在差异，再加上江蓠科海藻常
常由于生长环境因素变化而存在生态变型，藻体色
泽容易发生变化，未能仅以传统的形态特征和表观
色泽鉴定该绿色江蓠．
利用单个或多个 DNA分子标记技术，已经成为
研究江蓠科海藻的物种分类和系统进化的有效手
段［5-18］．李婷婷等(2012)利用 ITS 分子标记对江蓠
属和龙须菜属海藻进行了系统发育学分析，认为
ITS作为一种成熟的核基因组 DNA 分子标记，无论
在序列长度和碱基组成上都能较好地区分江蓠科海
藻，高度保守的 5． 8S rDNA 序列在江蓠属海藻种内
变化较小［11］． 本研究中 5． 8S rDNA 序列分析显示
PU-1、PU-2、GＲ-1 和真江蓠 AY465829 的 5． 8S rDNA
核苷酸序列完全一致，GＲ-2 仅有 1 个碱基发生转
换，这就提示绿色未知江蓠很可能是真江蓠．邻接法
构建的 ITS 系统发育树表明紫褐色真江蓠 PU-1、
PU-2 和绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 聚集在一起，也
提示着未知江蓠可能是真江蓠．然而，4 个供试材料
只与 BLASTn 搜索到的唯一的索引号真江蓠
AY465829 进行了遗传距离计算和系统发育分析，
GenBank中没有相应的其他可利用序列，根据已有
的资料不能鉴定绿色未知江蓠的确切种质，因此只
能初步判断两者与真江蓠的遗传关系非常相近． 此
外，本研究还发现绿色未知江蓠 GＲ-1 与 GＲ-2 之间
2 期 钟晨辉，等:一种绿色真江蓠的分子鉴定 ·187·
图 3 基于 NJ法构建的 cox1 基因片段序列的系统发育树(Kappaphycus alvarezii为外类群)
Fig． 3 Phylogenetic tree of partial cox1 gene sequences constructed by NJ method，using Kappaphycus alvarezii as outgroup
的遗传距离为 0． 35，大于 GＲ-1 与 PU-2 之间的遗传
距离 0． 05，这可能是双倍四分孢子体 GＲ-1 相比单
倍配子体 GＲ-2 获得频繁的基因交流，出现了不同
倍性藻体间的遗传距离大于群体内部间的遗传距
离．绿色未知江蓠 GＲ-2 与藻场优势种 PU-1 和 PU-2
间遗传距离大于后两者之间的遗传距离，推测后两
者可能参与了前者的物种形成，前者在渐变演化过
程中缺少种群内部基因流渗入和 ITS 序列的杂合．
Saunders等(2005)研究也表明海洋红藻的 ITS 序列
具有一定的杂合性和多态性［23］． 尤其是，真江蓠的
ITS序列是多拷贝的，不同拷贝 ITS序列之间存在差
异［24］，因而单一利用 ITS分子标记进行种水平的分
类还应考虑其适用性．
线粒体 cox1 基因是一种较好的分子标记，相比
于核基因组，突变率更高，在除近缘种群外的所有种
群中都可能发生遗传变异［20］，包含高分类阶元系统
演化的信息［25-26］． 目前，cox1 基因是鉴定海洋红藻
较理想的 DNA 条形码片段，Saunders 等(2005)［23］
和 Ｒobba 等(2006)［27］发现大多数红藻种内基因核
苷酸差异范围在 0 ～ 2 bp，变异率为 0． 3% ． Yang 等
·188· 应 用 海 洋 学 学 报 33 卷
(2008)研究表明真江蓠种内线粒体 cox1 基因片段
的核苷酸差异最高达到了 11 bp，种内的变异率为
0． 9%，可以作为真江蓠遗传分析的有效分子标
记［16］．本研究中绿色未知江蓠 GＲ-1、GＲ-2 的 cox1
基因片段与序列高度同源的真江蓠间的遗传距离小
于真江蓠群体内部间的遗传距离，这说明供试的 2
株绿色未知江蓠都是真江蓠． 再次，绿色未知江蓠
GＲ-1、GＲ-2 都与 2 条 GenBank 索引号(真江蓠
JQ619142 和真江蓠 JQ619143)序列完全一致，系统
分类发育树完全聚集为一支，也证实了 2 株绿色未
知江蓠是真江蓠．
本文结果表明，ITS 和 cox1 基因片段序列分子
标记都可以对江蓠海藻进行分类，线粒体 cox1 基因
片段序列较优于核内 rDNA 基因内部的 ITS 序列标
记，可以在种的分类阶元上得到较好的应用． 但是，
结合 ITS 和 cox1 基因片段序列信息，能充分且完整
地对绿色未知江蓠 GＲ-1 和 GＲ-2 进行种质鉴定，为
真江蓠的种质鉴定建立了分子鉴定基础．此外，鉴定
的绿色真江蓠与紫褐色真江蓠的 ITS 和 cox1 基因
片段序列存在着差异，这提示着绿色真江蓠可能不
是生态变型种，是否是天然色彩突变体还有待进一
步研究．
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Molecular identification of a green type of Gracilaria vermiculophylla
ZHONG Chen-hui，HUANG Ｒui-fang，LIN Qi，ZHENG Ya-you，LI Lei-bing，LIU Bo
(Fisheries Ｒesearch Institute of Fujian Province，Key Laboratory of Cultivation and High-value
Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，Xiamen 361013，China)
Abstract:In this paper，genetic analyses of ITS region and mitochondrial cox1 partial sequences were employed for
identifying 2 green Gracilaria sp． (Tetrasporophyte GＲ-1，Female gametophyte GＲ-2)and 2 puce Gracilaria ver-
miculophylla(Tetrasporophyte PU-1，Female gametophyte PU-2)from Xinglin Bay of Xiamen． These sequences to-
gether with related highest similar sequences downloaded from the GenBank were applied to calculate genetic dis-
tances and construct phylogenetic trees using MEGA5． 0 software． The ITS region sequences analyses showed that
both green Gracilaria sp． GＲ-1 and GＲ-2 were highly related to G． vermiculophylla． Whats more，the phylogenesis of
cox1 partial sequences revealed that GＲ-1，GＲ-2，PU-1 and PU-2 were synonymously clustered with G． vermiculo-
phylla． Both GＲ-1 and GＲ-2 were completely identical to the reported G． vermiculophylla JQ619142 and JQ619143，
and the genetic distances among them ranged from 0． 000 to 0． 002，which were lower than the value of distances
within population ranged from 0． 000 to 0． 015． It was indicated that the type of green Gracilaria sp． was G． vermicu-
lophylla． These results also suggested that the combination of ITS and cox1 were suitable for the molecular identifica-
tion of G． vermiculophylla Germplasm．
Key words:marine biology;Gracilaria vermiculophylla;green color;ITS;cox1;molecular identification
DOI:10． 3969 /J． ISSN． 2095-4972． 2014． 02． 005
(责任编辑:肖 静)