全 文 ：第 32 卷 第 4 期 应 用 海 洋 学 学 报 Vol. 32，No. 4
2013 年 11 月 Journal of Applied Oceanography Nov．，2013
深海细菌 Flammeovirga pacifica降解龙须菜
产寡糖反应条件的优化
万 玮1，高 超2，产竹华2，曾润颖2
收稿日期:2012-12-31
基金项目:国家海洋公益性行业科研专项资助项目(201105027) ;福建省农业科技重点资助项目(2011N0017) ;厦门市科技局资助项目
(3502Z20112012)
作者简介:万玮(1988 ～) ，女，硕士研究生;E-mail:biowanwei@ 163． com
通讯作者:产竹华(1982 ～) ，男，助理研究员;E-mail:chanzh@ 126． com
(1．厦门大学生命科学学院，福建 厦门 361005;2．国家海洋局第三海洋研究所、国家海洋局
海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门 361005)
摘要:利用单因素和正交试验对深海细菌太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)降解龙须菜产
海藻寡糖的发酵条件进行了优化．优化后的发酵条件:龙须菜含量为 3. 0%(m /m) ，龙须菜颗粒
大小为 60 目，NaCl含量为 1. 0%(m /m) ，接种量为 5. 0%(V /V) ，pH 值为 6. 5，温度为 37℃，培
养时间为42 h． 优化后发酵液寡糖含量达到 3. 83 g /dm3，提高了 52. 3%，优化效果显著． 采用优
化后的条件进一步进行 5 dm3 发酵罐分批发酵，寡糖的含量达到 3. 53 g /dm3 ．优化后的发酵条件
明显提高了寡糖的产量，由于此发酵条件只需在培养基中添加龙须菜和 NaCl等营养物，该条件
下生产寡糖比现有工艺具有明显的优势．本文利用深海菌株 Flammeovirga pacifica降解龙须菜的
机制，为龙须菜寡糖的生产提供了简单低廉的酶解工艺，为海藻寡糖的工业生产奠定了技术
基础．
关键词:海洋生物学;深海细菌;龙须菜;寡糖;降解;发酵条件优化
DOI:10. 3969 /J． ISSN． 2095-4972. 2013. 04. 018
中图分类号:Q178. 53 文献标识码:B 文章编号:2095-4972(2013)04-0584-07
琼胶、褐藻胶、卡拉胶等从海藻中提取的多糖在
食品、医药卫生等方面应用广泛．但由于这些多糖的
黏度高、水溶性低，不易被吸收，在应用方面受到较
大限制．为增加海藻多糖的应用范围，可利用酸解
法、酶解法将其降解，得到不同聚合度的海藻寡糖．
制备得到的海藻寡糖水溶性好，利于人体吸收，大大
提高了海藻的应用价值． 在医药方面，来自褐藻
(Echlonia kurome)OKAM的寡糖可以抑制 β-淀粉样
蛋白对皮质细胞和 SH-SY5Y 细胞的毒性，以及 SH-
SY5Y的细胞凋亡作用，并用于治疗阿尔茨海默氏
病(Alzheimer)［1-2］． 褐藻胶中的多聚寡糖可激活单
核细胞，使其产生肿瘤坏死因子 TNF-A、IL-1、IL-6．
其中 TNF-A有细胞毒性，可直接杀死肿瘤细胞，这 3
种细胞因子又与炎症反应相关，共同参与对细胞的
杀伤［3］．在保健品开发方面，多余的自由基会损伤
机体，许多疾病如血栓、动脉粥样硬化、白内障以及
老年性痴呆等均与体内自由基过多有关，而海藻寡
糖具有很强的清除自由基的能力［4-5］． 在农业方面，
海藻酸钠寡糖可以通过诱导 γ 干扰素、IL-10、IL-
1βmＲNA的表达从而显著提高肉用仔鸡对沙门氏菌
(Salmonella)感染的免疫能力，实现健康养殖［6］;
Iwasaki等(2000)对酶解褐藻胶寡糖促进莴苣根生
长活性研究表明，2 ～ 8 糖的混合物在浓度为 200 ～
3 000 μg /cm3 的范围内莴苣根生长长度为空白组的
2 倍［7］．在化妆品领域，新琼寡糖可直接作用于黑色
素细胞，具有抑制黑色素生成的功效，具有较好的应
用和开发前景［8］．
迄今为止，海藻寡糖的这些活性仍然停留在实
验室研究阶段，尚未实现大规模应用．影响海藻寡糖
应用开发的瓶颈因素主要包括生产工艺和成本两方
面．目前海藻寡糖的制备主要包括酸水解法和酶解
法:酸水解法的工艺条件不易控制，并且裂解的产物
4 期 万 玮，等:深海细菌 Flammeovirga pacifica降解龙须菜产寡糖反应条件的优化 ·585·
分子量不均一，难以实现寡糖的规模化制备;酶解法
的工艺易于控制，有利于寡糖的规模化制备，属于绿
色环保的生产技术，因而得到越来越多的重视．但目
前的酶解法都需先从海藻中提取出海藻多糖，再利
用制备好的降解酶进行酶解，从而得到分子量更小
的寡糖．该方法最主要的问题在于步骤较多和成本
高，限制了海藻寡糖的应用范围，且在提取海藻多糖
的过程中必须使用的酸、碱等化学试剂也造成了严
重的环境污染．在前期工作中，本实验室从太平洋深
海沉积物中获得了 1 株具有直接降解龙须菜产生寡
糖能力的菌株 Flammeovirga pacifica［9］． 丁志新等
(2010)对该菌株的发酵条件进行了初步优化，结果
为接种量 5. 0%(V /V) ，龙须菜含量 5. 0%(m/m) ，
37℃，200 r /min摇培时产糖量为 2. 51 mg /cm3，其产
糖量较低，龙须菜的用量大、转化率低，因此需要进
一步优化反应条件，降低成本［10］． 本研究主要对该
菌株以龙须菜为底物进行发酵产生寡糖的反应条件
进行优化，为实现海藻寡糖的大规模制备和应用奠
定技术基础．
1 材料与方法
1. 1 菌株与培养基
太平洋火色杆菌 Flammeovirga pacifica 菌株由
本实验室分离获得［9］．
种子培养基组成:羧甲基纤维素钠(CMC)含量
1. 0%(m/m) ，酵母膏含量 0. 5%(m/m) ，用原位海
水配制，pH 值为 6. 5，添加 1. 5% ～ 2. 0%(m/m)的
琼脂即为固体培养基，121℃灭菌 20 min后备用．
发酵培养基组成:龙须菜含量 3. 0%(m/m) ，
NaCl含量 1. 0% (m/m) ，用无菌水配制，pH 值为
6. 5，121℃灭菌 20 min后备用．
1. 2 培养方法
1． 2. 1 种子制备方法 取 － 80℃保存菌种划线接
种于种子培养基平板活化，接种于 250 cm3 摇瓶培
养基中，在 30℃条件下以 200 r /min 的转速振荡培
养 36 ～ 40 h［9］．
1． 2. 2 摇瓶发酵培养 按实验所需接种量接入装
有 50 cm3 发酵培养基的 250 cm3 三角瓶中，在 37℃
条件下以 200 r /min的转速振荡培养 42 h．
1． 2. 3 发酵罐培养 采用贝朗发酵罐 5 dm3 发酵
罐，可以调控温度、pH、DO 含量、搅拌速度、通气量
等．发酵罐中装液量 3 dm3，接种量为 5. 0%(V /V) ，
发酵温度为 37℃，通过调节搅拌转速和通气量使溶
解氧的相对百分数保持不低于 20%(V /V)．
1. 3 分析方法
1． 3. 1 菌体量的测定 实验中菌体密度采用浊度
法间接测量，发酵液适当稀释后，使用可见分光光度
计在波长为 600 nm下测定发酵液光密度(OD600)．
1． 3. 2 寡糖含量测定 采用 DNS 法测定寡糖含
量．将 1. 0 g 3，5-二硝基水杨酸、0. 2 g 苯酚、0. 03 g
亚硫酸钠、1. 0 g氢氧化钠、20. 0 g 酒石酸钾钠加热
溶解于蒸馏水中，冷却后定容到 100 cm3，贮于棕色
瓶内，制成 DNS溶液备用． 测定时将 500 mm3 待测
溶液与 500 mm3 DNS 试剂完全混合，加热煮沸
5 min，冷却后加入 4 cm3 蒸馏水，混匀后在波长为
540 nm 处测定其光密度(OD540)． 以葡萄糖含量、
OD540值绘制标准曲线，通过标准曲线获得待测溶液
中寡糖的含量．
2 结果与分析
2. 1 单因素优化菌株 Flammeovirga pacifica摇瓶
发酵条件
从太平洋深海沉积物中得到的 Flammeovirga
pacifica 菌株具有直接降解龙须菜生成寡糖的活
性［9］，在 15 ～ 40℃和 pH值为 6 ～ 8 的条件下均可发
生降解作用．在本实验中，首先对摇瓶发酵过程中的
温度、接种量、装液量等条件进行了优化，使菌体生
长和产糖达到较佳水平．
2． 1. 1 温度对产糖的影响 挑取单菌落接种于液
体种子培养基中培养至 OD600值约为 1. 0，按 5. 0%
的接种量接种于含 2. 0%龙须菜粉末的发酵培养基
中，分别在 15、25、30、37、40℃等温度条件下进行
培养，间隔一定时间取样，测量发酵液中还原糖的
含量．结果表明，菌株 Flammeovirga pacifica在 15 ～
40℃范围内均能降解龙须菜产生寡糖，且产糖量随
发酵温度的升高而升高，当温度到达 37℃时产糖效
果最佳．但温度为 40℃时该菌株生长较慢［9］，产糖
能力下降． 而产糖量最高的培养时间均为 42 h，在
42 h后产糖量均开始下降(图 1) ，因此确定培养周
期为 42 h．
从 37℃时的产糖周期可以发现，在 0 ～ 18 h 内
随着培养时间的延长，产糖量快速的增加;18 ～ 42 h
内随着时间的延长，产糖量较平稳地增长;而超过
42 h后产糖量开始下降．这说明培养初期菌体快速
生长，快速消耗龙须菜琼胶多糖，所以此时产糖速度
较快;18 h 后菌体生长逐渐进入稳定期，产糖速率
也随之下降，产糖量平稳增加，并且菌体细胞已经消
耗了绝大部分的琼胶多糖;42 h 后，菌体细胞将代
谢产生的还原糖作为自身生长所需碳源类营养物
质，故而还原糖含量开始下降．
2． 1. 2 接种量对产糖的影响 挑取单菌落接种于
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液体种子培养基中培养至 OD600值约为 1. 0，按
0. 5%、1. 0%、2. 0%、5. 0%、10. 0%的接种量分别接
入含 2. 0%龙须菜粉末的发酵培养基中，培养温度
采用最适的 37℃ ． 200 r /min 转速下振荡培养 42 h
后测定寡糖含量．实验结果表明，产糖量随接种量的
增加而增高，在接种量为 5. 0%时产糖效果最佳，达
到 2. 53 mg /cm3;接种量为 2. 0%时次之，当接种量
为 10. 0%时，产糖量反而下降(图 2)． 因此采用
5. 0%的接种量进行后续实验．
图 1 发酵温度对产糖量的影响
Fig． 1 Effect of fermentation temperature on oligosaccharide production
图 2 接种量对产糖量的影响
Fig． 2 Effect of inoculum on the oligosaccharide production
2． 1. 3 龙须菜含量对产糖的影响 挑取单菌落
接种于液体种子培养基中培养至 OD600值约为
1. 0，按 5. 0% 接种量接入龙须菜含量分别为
1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0% 的发酵培养基
中，在 37℃和 200 r /min 的转速下振荡培养 42 h，
取样测定其中的寡糖含量． 该菌在不同的龙须菜
浓度中均能产糖，但含量为 1. 0%时产糖量相对较
低，含量为 3. 0%时产糖量最高(图 3)． 而在培养
基中龙须菜浓度大于 3. 0%时，产糖量反而下降．
其原因是因为龙须菜浓度越高，经灭菌后分泌的
琼胶就越多，培养体系的粘度就越大，从而不利于
体系传质传氧，菌体生长和代谢都受到一定程度
的影响，使得产糖量下降．
图 3 龙须菜含量对产糖量的影响
Fig． 3 Effect of Gracilaria lemaneiformis concentration
on the oligosaccharide production
2． 1. 4 龙须菜颗粒大小对产糖的影响 挑取单
菌落接种于液体种子培养基中培养至 OD600值约
为 1. 0，按 5. 0%接种量接种于含 3. 0%龙须菜的
发酵培养基中，其中龙须菜粉末颗粒大小分别为
40、60、80、100 目． 在 37℃和 200 r /min 的条件下
振荡培养 42 h后，取样测定其中的寡糖含量． 结果
表明当龙须菜颗粒大小为 60 目时，产糖浓度最
4 期 万 玮，等:深海细菌 Flammeovirga pacifica降解龙须菜产寡糖反应条件的优化 ·587·
高，达到 3. 41 mg /cm3;40 目大小和粉碎不过筛
(对照)也有较高的产糖量;颗粒大小为 100 目时
产糖相对较低;龙须菜不粉碎(对照)的产糖则更
低，只有 1. 35 mg /cm3(图 4)． 说明龙须菜粉末颗
粒过小或过大都不利于产糖． 其原因可能是没有
粉碎的龙须菜颗粒太大，不利于琼胶的释放，导致
降解效率降低;而颗粒越小时，由于高温蒸煮后琼
胶释放彻底，粘度就越大，不利于培养基传质传
氧，故在这两种情况下产糖均较低． 因此，选择 60
目大小的龙须菜粉末颗粒作为产糖的培养基
组成．
图 4 龙须菜颗粒大小对产糖量的影响
Fig． 4 Effect of Gracilaria lemaneiformis size on the
oligosaccharide production
2． 1. 5 NaCl浓度对产糖的影响 由于海水中含有
大量的无机盐成分，对发酵液后期处理不利，为此
尝试在蒸馏水中添加不同浓度 NaCl 的方法来优
化发酵培养基． 按上述实验中得到的优化条件进
行培养，测定不同 NaCl浓度对产糖的影响．结果表
明，利用 1. 0%、2. 0%、3. 0%、4. 0%的 NaCl 溶液
对菌株 Flammeovirga pacifica 的发酵产糖没有太大
的影响，而不添加 NaCl 则会降低该菌株产糖量
(图 5)． 基于这个实验结果后期发酵使用的培养
基都用 1. 0%的 NaCl和单蒸水替代海水来进行发
酵．采用低浓度的 NaCl 溶液将大大降低后续对寡
糖的浓缩纯化处理的成本，同时减少对设备的腐
蚀损坏．
图 5 NaCl含量对产糖量的影响
Fig． 5 Effect of NaCl concentration on the
oligosaccharide production
2. 2 正交试验优化产糖发酵培养条件
采用正交优化对发酵培养基进行进一步优化．
通过比较单因素的实验结果，发现龙须菜含量、接种
量、温度和龙须菜颗粒大小是影响产糖的主要因素，
因此需进一步优化．以这 4 个因素作为自变量，培养
条件按上述优化结果，寡糖含量为响应值，设计了四
因素三水平实验设计(表 1)．
表 1 正交实验设计的因素和水平
Tab． 1 Factors and levels for orthogonal experimental design
因素
水平 A:龙须菜含量 /% B:接种量 /% C:温度 /℃ D:龙须菜颗粒大小 /目
1 3 3 35 40
2 4 5 37 60
3 5 7 39 80
由极差分析(表 2)和方差分析(表 3)可以看
出，龙须菜含量对产糖能力影响最大，其次是 NaCl
浓度和龙须菜颗粒大小．根据实验的结果，选择最佳
因素水平为 A1B2C2D2，即龙须菜浓度含量 3. 0%、
接种量 5. 0%、温度 37℃、龙须菜颗粒大小 60 目为
最佳培养基组成，其他条件:pH 值为 6. 5，转速为
200 r /min，NaCl 浓度为 1. 0%，装液量为 50 cm3
(250 cm3 三角瓶)．
以此配方重复试验，设 3 个对照，所得产糖量为
3. 83 mg /cm3，达到优化最大值的 97. 9%，与正交优
化结果基本一致，比单因素优化之后的产糖量提高
了 20. 1%，比优化之前提高了 52. 3% ．
·588· 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷
表 2 正交实验产糖结果
Tab． 2 Ｒesults of oligosaccharide production by the orthotropic experiment
序号、项目 A B C D 寡糖产量 /mg·cm －3
1 1 1 1 3. 17 2. 85
2 1 2 2 3. 83 2. 56
3 1 3 3 2. 85 2. 75
4 2 1 2 3. 08 3. 91
5 2 2 3 2. 56 3. 37
6 2 3 1 3. 63 3. 50
7 3 1 3 2. 75 2. 97
8 3 2 1 2. 97 3. 04
9 3 3 2 3. 47 2. 85
均值 1 3. 283 3. 000 3. 257 3. 067 影响大小 C ＞ D ＞ B ＞ A
均值 2 3. 090 3. 120 3. 460 3. 403
均值 3 3. 063 3. 317 2. 720 2. 967 较佳水平 A1B2C2D2
全距 0. 220 0. 317 0. 740 0. 436
表 3 产糖结果方差分析表
Tab． 3 Analysis of variance for the results of oligosaccharide production
因素 龙须菜含量 /% 接种量 /% 温度 /℃ 龙须菜颗粒大小 /目 误差
离差平方和 0. 086 0. 153 0. 877 0. 314 1. 430
自由度 2 2 2 2 8
F值 0. 241 0. 428 2. 453 0. 878
注:“”表示无数据
2. 3 5 dm3 发酵罐培养
由于受 pH值、溶解氧含量等因素的影响，摇瓶
实验的培养环境往往与实际发酵罐的培养环境相差
很大，因此发酵罐培养不能简单套用摇瓶的实验结
果．为进一步了解菌株 Flammeovirga pacifica 降解龙
须菜产糖的性能，我们采用 5 dm3 发酵罐分批发酵
的方式进行培养，培养基组成按照摇瓶优化结果，并
在发酵过程中对糖浓度和 pH值的变化进行监测．
利用 5 dm3 发酵罐进行发酵，通过改变搅拌速
度和通气量控制溶解氧含量 20%以上，能够很好地
解决摇瓶发酵过程中的溶氧问题．由图 6 的可见，采
用 5 dm3 发酵罐发酵和摇瓶发酵的结果基本一致，
产糖量达到 3. 53 mg /cm3 ．根据发酵过程中 pH值的
变化可以看出在发酵初期 pH 值为 6. 12 呈偏酸性，
随着发酵进行，pH值首先下降至 5. 93，此时菌株产
糖达到一个稳定期，随着进一步的发酵，pH 值又逐
步上升，并在收罐时最终达到 8. 0，呈碱性状态． pH
值的不断变化说明在菌株培养过程中，其先不断生
长达到稳定期，在此之前产生的代谢产物偏酸性，随
着生长不断进行，到了稳定期后期时，产生的代谢产
物偏碱性或者分解发酵底物导致整个发酵液偏碱
性．根据这一特性可以考虑在实际生产中根据 pH
值的变化来判断其中还原糖的产量．
图 6 5 dm3 罐发酵产糖实验结果
Fig． 6 Experimental results of the oligosaccharide
production by 5 dm3 batch fermentation
3 结论
本文对深海菌株 Flammeovirga pacifica 降解龙
须菜产寡糖的反应条件进行了优化． 通过单因素和
4 期 万 玮，等:深海细菌 Flammeovirga pacifica降解龙须菜产寡糖反应条件的优化 ·589·
正交试验确定了培养条件为:龙须菜含量 3. 0%、接
种量 5. 0%、龙须菜颗粒大小 60 目、pH值 6. 5、转速
200 r /min、温度 37℃、NaCl 含量 1. 0%、装液量
50 cm3(250 cm3 三角瓶) ，在此条件下还原糖的含
量达到 3. 83 mg /cm3 ． 此优化的反应条件产糖量增
加，同时由于培养基只添加了龙须菜和 NaCl，成本
比同类产品具有明显的优势，这也是本研究的创新
点．同时通过我们试验发现，发酵结束的菌体和龙须
菜藻渣是优良的植物基肥，因此整个生产工艺没有
污染．
通过 5 dm3 发酵罐放大进行分批发酵，寡糖的
含量也达到 3. 53 mg /cm3 ．实验中我们也比较了其
他的培养方式，包括利用分阶段补料和恒速补料
的方法进行发酵． 但由于龙须菜培养基经灭菌后
粘度太大，采用补料培养方式不仅增加了发酵工
艺的难度和成本，而且寡糖的产量也没有得到明
显提高．因此分批发酵仍然是最好的培养方式． 本
研究为龙须菜海藻寡糖进一步放大到中试规模提
供了实验数据，有利于海藻寡糖的大规模制备与
应用开发．
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Fermentation condition optimization for oligosaccharide production
of Gracilaria lemaneiformis by deep-sea bacteria Flammeovirga pacifica
WAN Wei1，GAO Chao2，CHAN Zhu-hua2，ZENG Ｒun-ying2
(1． School of Life Science，Xiamen University，Xiamen 361005，China;2． Key Laboratory of Marine Biogenetic
Ｒesources，Third Institute of Oceanography，SOA，Xiamen 361005，China)
Abstract:The conditions for producing oligosaccharides from Gracilaria lemaneiformis by deep-sea bacteria Flam-
meovirga pacifica were optimized via orthogonal tests and single factor methodology． The optimal fermentation condi-
tions were set as follows，3. 0%(m/m)of Gracilaria lemaneiformis particles with the size of 60 meshs，NaCl 1. 0%
(m/m) ，inoculation quantity 5. 0%(V /V) ，temperature 37℃，pH 6. 5 and incubation period 42 h． After optimiza-
tion，the oligosaccharide concentration reached 3. 83 g /dm3 and increased by 52. 3% in the supernatant． In the
study with optimal conditions of 5 dm3 fermentor，the oligosaccharide concentration reached 3. 53 g /dm3 ． The oligo-
saccharide production was obviously increased using the optimal fermentation． Meanwhile，the cost of producing oli-
gosaccharides was sharply deceased，because only Gracilaria lemaneiformis and NaCl need to be added in medium．
·590· 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷
The process of degrading Gracilaria lemaneiformis by Flammeovirga pacifica provides a simple and low cost enzymol-
ysis technology for alga oligosaccharide production． This job laid the technique foundation for industrial production
and application of alga oligosaccharides．
Key words:marine biology;deep-sea bacteria;Gracilaria lemaneiformis;oligosaccharides;degradation;fermen-
tation optimization
DOI:10. 3969 /J． ISSN． 2095-4972. 2013. 04. 018
(责任编辑:郭水伙、肖 静)