全 文 ：第 35 卷 第 2 期 应 用 海 洋 学 学 报 Vol. 35，No. 2
2016 年 5 月 Journal of Applied Oceanography May，2016
深海沉积物中龙须菜降解菌群的筛选与
鉴定及多样性分析
丁志新1，陈兴麟2，周治东3，金 敏2，曾润颖2，4
收稿日期:2015-05-07
基金项目:海洋公益性行业科研专项资助项目(201505026) ;厦门南方海洋中心资助项目(13GZP003NF09) ;福建省科技计划重点资助项目
(2012Y0071)
作者简介:丁志新(1984 ～) ，硕士研究生;E-mail:154389918 @ qq． com
通讯作者:曾润颖(1972 ～) ，男，研究员;E-mail:zeng@ tio． org． cn
(1． 浙江理工大学，浙江 杭州 310018;2． 国家海洋局第三海洋研究所、海洋生物遗传资源省部
共建国家重点实验室培育基地，福建 厦门 361005;3． 福建海洋研究所，福建 厦门 361005;
4． 南海生物资源开发与利用协同创新中心，广东 广州 510300)
摘要:以龙须菜为唯一的营养源对深海沉积物进行富集和筛选，获得一个可降解龙须菜(Gracilaria
lemaneiformis)、紫菜(Porphyra umbilicalis)和海带(Laminaria japonica)产生还原性寡糖的菌群．通过
16S rＲNA序列及 16S rＲNA-ＲFLP分析对该菌群中的细菌多样性进行了研究．结果表明，降解菌群
中的细菌组成主要为弧菌属(Vibrio，8 株)、火色杆菌属(Flammeovirga，7 株)和希瓦氏菌属(She-
wanella，5 株) ，其中希瓦氏菌属和火色杆菌属的细菌在菌群中的丰度较高．采用龙须菜为唯一营养
源的筛选培养基对菌群中的细菌进行分离，获得 4 株具有琼胶酶活力的细菌，包括 2 株火色杆菌属
和 2 株希瓦氏菌属细菌．培养和未培养的结果均表明火色杆菌和希瓦氏菌这 2 个属为所研究的深
海沉积物主要的龙须菜降解菌．对原始降解菌群和所分离的关键菌株进行了龙须菜酶解产糖能力
的比较，结果发现菌群中的弧菌属菌株虽然自身没有酶解龙须菜的能力，但可能可以协助关键菌
株，提高菌群对龙须菜的降解效率．因此本研究中所获得的菌群和菌株有望在琼胶寡糖的绿色生产
中得到广泛应用．
关键词:海洋生物学;深海;龙须菜;降解;菌群;多样性;火色杆菌;希瓦氏菌
DOI:10． 3969 /J． ISSN． 2095-4972． 2016． 02． 001
中图分类号:P735 文献标识码:A 文章编号:2095-4972 (2016)02-0151-06
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)又名江蓠、鹿
角菜、凤菜等，是红藻门江蓠属(Gracilaria)海藻的
典型代表，是产琼胶的优良种，亦用作鲍鱼饵料或者
加工成海洋蔬菜等，它富含多糖，含量可达到其干重
的 30%左右．目前龙须菜主要用于生产琼脂，而近
年来利用海藻多糖水解酶酶解海藻琼脂产生的琼脂
寡糖分子量更小，应用更广泛，经济价值更高，引起
了人们研究的兴趣［1-3］． 海藻寡糖的抗肿瘤、抗病
毒、增强免疫等药理作用［4］和抑菌［5］、清除羟基自
由基［6］的生物活性正在被用于医药食品农业等诸
多领域，发展前景巨大． 有研究表明，琼胶低聚糖的
生理活性功能与其还原端结构密切相关［7］．
虽然琼胶寡糖在食品工业、医药工业、日用化
工、生物工程等许多方面有广阔应用前景，但琼胶寡
糖至今还没有进行产业化的生产，其中一个重要的
原因就是未能找到大规模有效降解琼脂的途径，因
此分离出更多的高产琼胶酶的菌株用于工业生产，
大力开发琼胶寡糖的活性功能，成为今后海藻深加
工及琼脂工业重点努力的方向［8-10］．
本研究通过对西太平洋深海沉积物泥样中的微
生物进行富集筛选，寻找高效降解龙须菜多糖(或
降解酶高产)的菌群和菌株，为龙须菜多糖的高值
化利用和寡糖应用的产业化发展奠定基础．
1 材料与方法
1． 1 样品采集与处理
于 2007 年 7 月搭载大洋 1 号 DY-115-19 航次
·152· 应 用 海 洋 学 学 报 35 卷
第五、六航段，采集位于西太平洋“暖池”区(具体
经纬度为 21°53″08N，160°41″24E;19°30″30N，
157°24″31E)的深海沉积物泥样． 采用多管采样
器采集 10 g泥样，并接入 30 cm3 富集培养基中进
行 50 d的富集培养．
1． 2 培养基
本研究中采用的培养基配方如下:
富集培养基:1. 0%龙须菜粉末(质量占比，下
同) ，原位海水，121℃高温高压灭菌．
酶解培养基:酵母膏 0． 2%，另外根据实验需
要添加 1. 0%的酶解底物，包括龙须菜、紫菜、海
带、麒麟菜，用陈海水配制，pH 值 7． 0，121℃高温
高压灭菌．
筛选培养基:龙须菜 1. 0%，酵母膏 0． 2%，琼脂
1． 5%，陈海水，pH值 7． 0，121℃高温高压灭菌．
1． 3 16S rＲNA扩增和 ＲFLP分析
取 500 mm3 富集后的深海沉积物样品均匀涂
布于筛选培养基平板上，20℃下培养 3 ～ 5 d，挑取在
培养基上产生明显凹陷圈的原始降解菌群，悬浮于
无菌水中，并用细菌基因组提取试剂盒提取该菌群
的总 DNA． 然后以获得的菌群总 DNA 为模板进行
16S rＲNA 基因的扩增，扩增所用引物为 27F:5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 和 1492Ｒ:5-GGT-
TACCTTGTTACGACTT-3［11-12］．
1． 4 关键菌株的分离与鉴定
将富集筛选得到的原始降解菌群重悬于无菌海
水中，并按不同稀释梯度均匀涂布于筛选培养基平
板上，于 20℃中培养，待菌落长出后，挑取在培养基
上产生明显凹陷圈的单菌落进行保种和 16S rＲNA
序列分析．
1． 5 海藻降解试验
将原始降解菌群或分离的关键菌株分别接入用
不同海藻［龙须菜、紫菜(Porphyra umbilicalis)、海带
(Laminaria japonica)或麒麟菜(Eucheuma serra) ］配
制的酶解培养基中，25℃、200 r /min 条件下震荡培
养，测定不同时间段还原糖的产生量，检验菌群或菌
株对海藻的降解能力．还原性寡糖含量采用 DNS 法
［13］来测定．
1． 6 薄层色谱分析
将龙须菜降解上清和琼胶寡糖标准品分别点样
于薄层层析硅胶板上，将硅胶板放入层析缸中进行
展层，展层剂为正丁醇 ∶ 冰乙酸 ∶ 水 = 1 ∶ 2 ∶ 1
(V∶ V∶ V) ，待展层结束后将硅胶板置于通风厨中干
燥，而后用硫酸-乙醇(1∶ 9，V∶ V)均匀喷洒于硅胶板
上，并放入 90℃烘箱中进行显色．
2 结果和讨论
2． 1 龙须菜降解菌群富集筛选和降解效果分析
从西太平洋深海沉积物中采集泥样样品，并以
龙须菜为唯一的营养源对该样品进行富集． 富集后
的深海沉积物样品经梯度稀释后，均匀涂布于筛选
培养基平板上进行培养和筛选． 结果显示其中一个
菌群能够液化并降解琼脂，在培养基上形成明显的
凹陷圈．挑取该菌群分别接入用不同海藻(龙须菜、
紫菜、海带和麒麟菜)配制的酶解培养基中进行海
藻降解效果分析．如图 1 所示，该菌群能够降解龙须
菜、紫菜和海带产生还原性寡糖，但无法降解麒麟
菜．由于龙须菜和紫菜属于红藻，降解后产物为琼
胶;海带属于褐藻，降解后产物为褐藻酸，因此推测
该菌群所产生的主要降解酶为琼胶酶和褐藻酸酶．
图 1 深海沉积物富集菌群降解海藻的效果分析
Fig． 1 Degradation of alga by enriched bacterial flora
from deep-sea sediments
2． 2 降解菌群的多样性分析
通过提取降解菌群总 DNA 作为模板扩增
16S rＲNA，并通过 ＲFLP和 16S rＲNA序列分析来研
究该菌群的细菌多样性．根据 ＲFLP和 16S rＲNA序
列分析结果，我们一共获得 21 种 16S rＲNA基因型，
将获得的基因型序列提交 NCBI 数据库比对，整理
与它们同源性较高的细菌 16S rＲNA 序列进行遗传
距离计算，并根据遗传距离计算结果绘制系统发育
树(图 2)．
结果表明，降解菌群中的细菌组成主要为弧菌
属(Vibrio，8 株)、火色杆菌属(Flammeovirga，7 株)
和希瓦氏菌属(Shewanella，5 株) ，其中希瓦氏菌属
和火色杆菌属的细菌在菌群中的丰度较高． 降解菌
群中丰度最高的 2 株细菌为 H11 菌株和 H1 菌株，
它们占菌群总丰度 75% 左右，其中 H11 菌株与
2 期 丁志新，等:深海沉积物中龙须菜降解菌群的筛选与鉴定及多样性分析 ·153·
Flammeovirga yaeyamensis 同源性最高，达 97. 73%，
命名为 Flammeovirga sp． wpaga001，菌株 H1 与 She-
wanella pacifica KMM3597 同源性最高，达 99． 73%，
命名为 Shewanella sp． wpaga003．此外，由于 H7 菌株
的 16S rＲNA序列与数据库已知菌株的16S rＲNA同
源性均较低而未得到有效鉴定，其与弧菌属的细菌
同源性最高(95%) ，但在系统发育树上却处在独立
的分支，可能具有不同的进化地位．
图 2 深海沉积物降解菌群基于 16S rＲNA序列的系统进化分析
Fig． 2 Phylogenetic analysis of enriched bacterial flora from deep-sea sediments based on 16S rＲNA sequences
发育树采用邻接法构建，虚线代表遗传距离为 0． 2
2． 3 龙须菜降解菌群中关键菌株筛选与降解活力
分析
为了筛选菌群中起主要降解作用的菌株，我们
在筛选培养基上将菌群进行进一步的稀释涂布和划
线纯化，获得 4 个在筛选培养基平板上产生凹陷圈
的单一菌落，经 16S rＲNA 序列鉴定，其中 2 株为火
色杆菌属细菌(Flammeovirga sp． wpaga001 及 Flam-
meovirga sp． wpaga002) ，另 2 株为希瓦氏菌属细菌
(Shewanella sp． wpaga003 及 Shewanella sp．
wpaga004)．
薄层色谱分析结果表明筛选到的 4 株菌株都具
有降解龙须菜产生寡糖的能力． 它们的水解产物主
要为新琼二糖、四糖、六糖和八糖，而作为对照的大
肠杆菌 E． coli．则无降解龙须菜的能力(图 3)．
为了比较关键菌株与原始降解菌群的龙须菜降
解活力，培养 Flammeovirga sp． wpaga001、Shewanella
sp． wpaga003 和原始的降解菌群至相同的细菌生长
期和细菌浓度，并按 10%的接种量分别接入含龙须
菜的酶解培养基中． 如图 4 所示，Flammeovirga sp．
wpaga001、Shewanella sp． wpaga003 单独或者混合培
养，其降解龙须菜的活性都显著低于原始菌群，说明
原始菌群中的其他菌株如弧菌属可能能够协助关键
菌株，提高对龙须菜的降解效率．
2． 4 讨论
深海环境中的微生物资源十分丰富，且由于其
环境条件的特殊性，我们可以从深海中分离得到具
有多种活性的特殊微生物［14-16］． 本研究从西太平洋
深海沉积物中筛选得到一个海藻降解菌群，该菌群
·154· 应 用 海 洋 学 学 报 35 卷
图 3 深海沉积物关键菌株降解龙须菜产物的薄层
色谱分析
Fig． 3 TLC analysis of oligosaccharide production
from Gracilaria lemaneiformis by key strains isolated
from deepsea sediments
泳道 M为琼脂寡糖标准品，其中 GC、DP2、DP4、DP6、DP8 分别
为葡萄糖、新琼二糖、四糖、六糖和八糖． 泳道 1 ～ 5 分别为
Flammeovirga sp． wpaga001、Flammeovirga sp． wpaga002、E． coli、
Shewanella sp． wpaga003 和 Shewanella sp． wpaga004 的龙须菜
降解产物
图 4 深海沉积物降解菌群与关键菌株的龙须菜降解
活力比较
Fig． 4 Comparison of Gracilaria lemaneiformis-degrading
activities between original flora and key strains
from deep-sea sediments
F1 和 S3 分别代表 Flammeovirga sp． wpaga001 和 Shewanella sp．
wpaga003 菌株
可以有效地降解龙须菜、紫菜和海带等多种海藻产
生高达 1． 6 mg /cm3的低聚寡糖，且该降解工艺简
单，成本低廉，对海藻寡糖的大规模产业化生产有着
很好的参考意义．
系统进化分析表明该菌群主要由火色杆菌属、
希瓦氏菌属和弧菌属 3 个属组成，其中起降解作用
的菌株来源于火色杆菌属和希瓦氏菌属，目前这 2
个属都有琼胶酶［17-18］的报道．我们的试验结果发现
该菌群中的弧菌属细菌并没有直接降解龙须菜的能
力，但是含有弧菌的菌群降解龙须菜的效率要显著
高于关键降解菌株，这说明原始菌群中的弧菌可能
可以协助关键菌株降解龙须菜，提高对龙须菜的降
解效率．但是以上的推论还需要试验来进一步地验
证．
Flammeovirga sp． wpaga001 的单独培养也能表
现出较强的琼胶分解能力，它可以在琼胶培养基平
板上形成大而深的凹陷圈，且随着菌株的生长凹陷
圈会持续扩大． 火色杆菌属是 1997 年建立的新
属［19］，属于 Bacteroidetes 门，目前仅包括 4 个种
Flammeovirga aprica、Flammeovirga arenaria、Flam-
meovirga kamogawensis 和 Flammeovirga yaeyamensis．
我们分离得到的 Flammeovirga sp． wpaga001 菌株的
16S rＲNA序列与 NCBI数据库上已知物种的相似度
较低，其中最高相似物种为 Flammeovirga yaeyamen-
sis(97. 73%) ，说明该菌株可能为火色杆菌属下的
新种．目前我们已对该菌株进行菌种鉴定和全基因
组测序，并鉴定为 Flammeovirga pacifica［20］．
海藻寡糖的应用目前仍停留在实验室阶段，其
瓶颈因素之一是缺乏高效的海藻多糖降解酶． 本研
究获得了可直接高效降解龙须菜产生寡糖的菌群，
不需要先从龙须菜中提取琼胶再进行降解，工艺较
为简单，并且本研究还获得了 2 种琼胶降解效果显
著的菌株．通过进一步研究并结合生物发酵工艺以
及基因工程方法，有望将其应用于海藻寡糖的大规
模生产，实现较好的经济和社会效益．
3 结论
从深海沉积物中获得一个可降解龙须菜、紫
菜和海带产生还原性寡糖的菌群． 16S rＲNA 序列
及 16S rＲNA-ＲFLP 分析表明，降解菌群中的细菌
组成主要为弧菌属(8 株)、火色杆菌属(7 株)和希
瓦氏菌属(5 株)． 培养和未培养的结果均表明火
色杆菌和希瓦氏菌这 2 个属为所研究的深海沉积
物主要的龙须菜降解菌，而菌群中的弧菌属菌株
虽然自身没有酶解龙须菜的能力，但可能可以协
助关键菌株，提高菌群对龙须菜的降解效率． 因此
本研究中所获得的菌群和菌株有望在琼胶寡糖的
绿色生产中得到广泛应用．
2 期 丁志新，等:深海沉积物中龙须菜降解菌群的筛选与鉴定及多样性分析 ·155·
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Screening，identification and diversity analysis of Gracilaria
lemaneiformis-degrading flora from deep-sea sediments
DING Zhi-xin1，CHEN Xing-lin2，ZHOU Zhi-dong3，JIN Min2，ZENG Ｒun-ying2，4
(1． Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China;2． State Key Laboratory Breeding Base of Marine Genetic Ｒesources，
Third Institute of Oceanograpiy，SOA，Xiamen 361005，China;3． Fujian Institute of Oceanography，Xiamen 361005，China;
4． South China Sea Bio-Ｒesource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center，Guangzhou 510300，China)
Abstract:A bacteria flora that could directly degrade several algas including Gracilaria lemaneiformis，laver and
kelp was isolated from deep-sea sediments of the west Pacific Ocean using Gracilaria lemaneiformis as solo nutrition
for enrichment． 16S rＲNA sequencing and 16S rＲNA-ＲFLP analysis were carried out to investigate the bacterial di-
versity of Gracilaria lemaneiformis-degrading flora． The results showed that flora was mainly comprised of Vibrio (8
strains) ，Flammeovirga(7 strains)and Shewanella(5 strains)． After the separation of original flora，4 strains in-
cluding 2 Flammeovirga and 2 Shewanella strains were found to possess the ability of Gracilaria lemaneiformis deg-
radation． Thus，both uncultured and cultured analysis performed in our study suggested that Flammeovirga and Sh-
ewanella were the key strains responsible for algal degradation． Furthermore，comparison of Gracilaria lemaneifor-
·156· 应 用 海 洋 学 学 报 35 卷
mis-degrading activity between original flora and isolated key strains showed that the Vibrio may help to improve the
activity of flora despite of the lack of alga-degrading ability． Therefore，the present novel Gracilaria lemaneiformis-
degrading flora and strains may be widely applied in production of oligosaccharide from Gracilaria lemaneiformis in
the future．
Key words:marine biology;deep-sea;Gracilaria lemaneiformis;degradation;flora;diversity;Flammeovirga;She-
wanella
DOI:10． 3969 /J． ISSN． 2095-4972． 2016． 02． 001
(责任编辑:杜俊民)