全 文 ：·研究简报 ·
珊瑚藻藻红蛋白 a亚基脱辅基蛋白基因克隆与序列分析 *
王 盛 钟伏弟 吴祖趁 林奇英 谢联辉.
( 福建农林大学植物病毒研究所 ,福州 35 (洲〕2 )
关. 切 : 珊瑚藻 ;藻红蛋白墓因 ; Q 亚基
C lo in g an d S
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藻胆体是红藻的光合作用捕光器官。 藻红蛋白位于藻胆
体的尖端 ,在能 t 传递体系中位于第一环节 ,是第一级捕光
色素 ,直接吸收和传递光能 ,对藻体的生理活动有重要影响
l] 。 藻红蛋白的光吸收区位于蓝绿光区 ( 498 一 5 65 nl ) ,可以
利用高等植物不能利用的光能 。 如能通过基因导人而将高等
植物的光合作用器加以改造 ,使其光吸收范围扩大 , 可大大
地促进高等植物的生长发育冈 。 此外 ,藻红蛋白是一类丰富的
天然蛋白质资源 ,在深入研究藻红蛋白基因结构和功能的基
础上 , 利用基因工程手段获得高效表达的基因工程菌株 ,可
以通过发醉生产藻红蛋白周 。 同时亦可利用藻红蛋白的基因
对大型经济海藻进行基因功能改良l] 。 本研究利用 T D 一 PC R
和 ne s et d P C R 技术克隆了珊瑚藻藻红蛋白 a 亚基基因全序
列 ,并进行了序列比较分析 。
CP R扩增仪为 w b a枉n an iB ~ atr T 3
. 反应体系 20 卜oL
条件为 95 ℃预变性 5 m in , 之后 95 ℃ 80 5 , 56 、 4 2 ℃ ( 每降
低 2 ,C作 2个循环 , 片段 G印2一 P S ) 或 62 ℃ ( 片段 P一PZ )
120 5
,
72 ℃ 8 0 5 ,循环 30 次后 72 ℃延伸 10 m in 。 CP R 扩增产
物经回收纯化 ,克隆到 GP EM 一 T e asy 载体上 ,经蓝白斑筛选 、
碱裂解法提取质粒 , 酶切鉴定 。 由上海生工生物工程有限公
司进行序列测定。
2 结果和分析
材料和方法
1
.
, 材料
珊瑚藻 ( 〔 b阴双白召创万面朋加 )采自福建省莆田海域 。
1
.
2 方法
根据已报道的藻红蛋白基因序列保守区设计 、 合成简并
引物 lP 、 2P 和 5P , 在 PI . P Z片段序列测定的基础上设计 、 合
成特异引物 G s p l 和 G即 2 。 价 p Z一5P 片断的扩增 ,首先用引物
G叩 1和 5P 作第一次扩增 ,然后用引物 G sPZ 和 5P 作第二次
嵌套扩增 。 将获得的 2 个片断进行序列拼接后 ,得到全长的
a 亚基基因序列。 D N A 提取采用隋正红等冈的方法 。
. 羞金项目 : 福建省科技厅 , 大项目侧。 . 2以” H侧” , 20 121 27 )资助 。
王 盛 :男 , 30 岁 .博士 。
. 通讯作者。 A u肠旧 r 助 c创钱网闪回加伪 。 -E ~ 卜众记出@巧a-u 曰u
.
.
》 .
收稿日期二2加 3一 1卜 17 接受日期 : 2加吟0 1-09
2
.
1 序列侧定与分析
序列长 9 05 bp ,包括日亚基编码区的 309 bP ( 编码 102
个氨基酸 ) , 10l bP 的间隔区以及 。 亚基编码区的 4 95 bP
(编码 164 个氨基酸 ) , 基因排列顺序为日亚基 一 间隔区 一a
亚基 。 与红藻门红藻已报道的基因序列相比 ,它们在基因排
列顺序和编码区碱基数目上基本一致 ,在间隔区长度上差异
较大 。 例如龙须菜 ( U抽司田角 刀改切口 e而mr is )藻红蛋白基因
间隔区只有 54 bP l’], A gaI 。功 . 团旧北川 刀州比恤 的间隔区长度
为 10 8 bp 阎 。不但间隔区长度的变异大 , 而且彼此之间的碱基
组成差别也比较大。 由于间隔区序列很短 ,不足以起始新的
转录 ,所以推测与其它红藻藻胆蛋白的基因转录相似 , 珊瑚
藻藻红蛋白 p 和 a 亚基也是同时转录的 , 以维持细胞中两亚
基的等 t 存在 。 在墓因排列方式上 ,此序列与已报道的红藻
bR od
e J」a vio lac “ 的基因排列方式不同。 在 hR 叼e la 助aI c ea
中 , 除两亚基间的非编码间隔区外 ,日和 a 亚基编码区中还
3 4 7农 业 生 物 技 术 学 报2 创 )4 年
含有不同数t 和长度的内含子 , 呈不连续的排列方式 l0o
序列的 G lc 含 t 较低 , 珊瑚藻藻红蛋白 Q 亚基的 侧C
含量为 40 % ( 其中 T = 31 % > A = 29 % > G = 2 % > C =
18% )
。 同时该序列还表现出很强的密码子偏倚性 , a 亚基三
联体密码子第 3位碱基 A汀偏倚性为 84 .2 % 。 序列 e C 含量
低和偏倚性现象也出现在其它已知的红藻藻红蛋白基因中。
.2 2 a 亚甚与已知 p E 甚因序列比较分析
将珊瑚藻 (C o伍 c加司招 , AF 51 的 86 )藻红蛋白 a 亚基编码
区的氮基酸序列与红藻门红藻 R . vio lac ea (功 2 18 ) 、
凡甲句怕 p u pr u几润 ( U 38 804 ) 、 .P 如娜 ( D 89 87 7 ) 、 .P
押刀洲沮 5 15 ( D 89 878 ) 、 oP 加 ibP ~ bo 蹦 ( 2 140 94 ) 、
6竹币比isa m on ils ( 2 98 52 8 ) 、 A . n egJ 比untz ( 2 1190 7 ) 和 .G
J口山 an e j fo nZ 山 (人F 2 75 6 85 ) 的基因序列进行同源性比较 。 从
中可以看出 ,在不同红藻中 。 亚基序列保守性较高。 相互间
的同源性比较结果表明 , a 亚基核酸序列间同源性为 71 %一
9 %
,氮基酸序列同源性为 75 %一 990/ 。 其中以 A . n egj eC恤
· 与 R . 吻妇` “ 之间的同源性最低 , .P 如的和 .P ” 思笼出 1` 的
同源性最高 ,氮基酸序列的保守性高于核昔酸序列 。 蛋白质
序列的高度保守对维持光合作用器结构和功能上的稳定性
是必要的。 幻。忱 和 lG姗尹确定了红藻 G “ 尔笼朋万mIJ co ul 把 ir
中藻红蛋白各亚基色基结合部位氛基酸序列网 。 分析结果表
明 .氛基酸序列在色基结合位点区域上极为保守 ,这对维持
其稳定的光谱特性有重要愈义。
.2 3 进化树与传统分类学
从 。 亚基氛基酸序列 ( 图 l) 进化树与传统分类地位的
对照来看 ,两者墓本相吻合 。 说明 。 亚基可以作为红藻分子
生物学分类的标准之一 。
的间隔区以及 a 亚基编码 区的 4 95 bP ( 编码 164 个氮基
酸 ) ,基因排列顺序为 p 亚基 · 间隔区 。 亚基 ,编码区连续
排列 ,无内含子 。 与已报道的红藻门 9种红藻基因序列相比 ,
它们在基因排列顺序和编码区碱基数目上基本一致 ,在间隔
区长度和碱基组成上差异较大 ,推测间隔区可能不具有实际
功能 。 序列表现出很强的密码子偏倚性 ,这种偏倚性也体现
在其它已知序列的藻红蛋白基因中 ,可见在红藻中这种现象
极为普遍 , 同时这种偏倚性也表现出典型的原核基因性质。
在不同红藻中序列保守性较高 ,而且蛋白质序列的保守性高
于核昔酸序列的保守性 ,这可能对维持光合作用器结构和功
能上的稳定性是必要的 。
从国内外的资料来看 ,原核蓝藻和蓝细菌的藻红蛋白基
因结构及其功能已有了比较多的研究 ,而对真核藻类藻红蛋
白的研究仅限于为数不多的几种红藻 ,尤其有关分子生物学
研究报道很少 。 本研究通过克隆珊瑚藻藻红蛋白 a 亚基全基
因序列 , 并对其进行序列比较分析 ,有助于进一步了解藻红
蛋白的基因结构 ,对藻红蛋白的功能研究及其应用具有重要
意义 。
参 考 文 献
2 1 19 0 7
图 1. 9 种红旅燕红蛋白 。 亚基的系统进化树
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本研究报道了珊瑚藻的藻红蛋白 a 亚基的基因全序列
( G e妞B an k ac e cs s i o n N o .灯 5 109 8 6 ) 。 测定序列长为 9() 5 bP ,
包括 p 亚基编码区的 309 bp ( 编码 102 个氨基酸 ) , 10 1帅
l 骊 乙H (隋正红 ) , 刀比口g x ￡H (张学成 ) . 丸州 . 脚 on p妙。奶由血
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