全 文 ：第 32 卷第 6 期
2008 年 11月
水　产　学　报
JOURNAL OF FIS HERIES OF CHINA
Vol.32 , No.6
Nov., 2008
收稿日期:2008-05-07
资助项目:浙江省重点科研社会发展项目(2007C 23081)
作者简介:宋琍琍(1963-),女 ,浙江杭州人 ,高级工程师 ,从事水产品质量安全 、加工技术的研究。 E-m ail:songlili8168@163.com
文章编号:1000-0615(2008)06-0950-07
液相色谱-串联质谱法测定贝类毒素软骨藻酸的残留
宋琍琍1 , 　张海琪1 , 　侯镜德2 , 　何　欣1
(1.浙江省水产质量检测中心 ,浙江　杭州　310012;
2.浙江大学分析测试中心 ,浙江　杭州　310027)
摘要:建立了液相色谱-串联质谱测定贝类毒素软骨藻酸残留的检测方法 。样品经 50%甲
醇提取 , LC-SAX柱净化 ,然后选用电喷雾离子源(ESI),在正离子 、多反应监测方式(MRM)
模式下进行定性 ,以外标法进行定量 。该方法的定量限为 0.02μg·g-1 ,工作曲线的线性范围
为 0.02 ～ 8.00 μg·g-1 。在添加浓度为 0.02 ～ 4.00μg·g -1内 , 软骨藻酸的平均回收率为
80.2%～ 92.2%,相对标准偏差(RSD)为 4.42%～ 9.46%。
关键词:贝类;软骨藻酸;液相色谱串联质谱;多反应监测
中图分类号:O 657.7　　　　文献标识码:A
　　软骨藻酸(Domoic acid ,DA)是一种由硅藻
属中的 Pseudonitzschia 所产生的氨基酸型神经
类毒素[ 1] , 同时又是记忆缺失性贝类毒素
(amnesic shel lfish to xin ,简称 ASP)的主要成分。
其分子量为 311.4 u , 属氨基酸类化合物 ,呈现典
型的酸性氨基酸特征 ,易溶于水。当硅藻大量繁
殖时会产生毒素 ,并会在某些水产生物如贻贝 、扇
贝 、文蛤等中蓄积 ,再经过海洋食物链影响相关的
高等动物。于 1989年加拿大最先报道了首起因
食用受软骨藻酸污染的贻贝而导致 3人死亡的事
件 ,在此以后又发生多起因海洋受软骨藻酸污染
而导致群体性动物死亡[ 1-2] 。因此软骨藻酸也就
成为海洋环境污染监测和公共水产品安全监测的
一个重要指标 。美国食品药品监督管理局
(FDA)等将其作为主要监测的海洋生物毒素项
目 ,同时限定其在水产品中的安全限量为 20 μg·
g
-1 [ 3] 。有关软骨藻酸的测定方法主要为色谱测
定方法 ,如液相色谱法[ 3-5] 、液相色谱柱后衍生
法[ 2] 、液质联用法[ 6-8] 、毛细管电泳法[ 9] 等 ,目前
尚未有液相色谱-串联质谱方法的报道 。本研究
应用液相色谱-串联质谱技术建立了水产品中软
骨藻酸残留的测定方法 ,既可定量又可定性测定 ,
对提高我国水产品质量安全检测及海洋环境监测
技术具有重要意义。
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
API3000型液相色谱-串联四极杆质谱仪 ,配
有Agilent1100型液相色谱仪 、自动进样器 、电喷雾
离子源(美国应用生物系统公司);固相萃取装置
(美国Supelco公司);纯水器(法国 Milli-Q公司)。
标准物质软骨藻酸(纯度 90 %, Sigma
Chemical , Co.);甲醇 、乙腈为色谱纯;3 mL LC-
SAX柱(Supelco , USA);0.5 mol·L-1柠檬酸溶液
(pH 3.2):40.4 g 一水柠檬酸和 14.00 g 柠檬酸三
铵溶解于 400 mL 水中 , 调节 pH 成 3.2 , 加入
50mL 乙腈 ,完全混合溶解后 ,以水定容至 500 mL。
软骨藻酸样品添加溶液:称取固体软骨藻酸以乙
腈/水(1∶9 , v/ v)配成约 40 mg·L-1溶液。
1.2　样品
实验用贝类于 2007年 3月-11月采自浙江
沿海 ,由中心实验室提供 。鲜活样品运至实验室
后用水冲洗干净 ,撬开贝壳后取内脏团进行匀浆
处理 ,四分法制样后保存于-75 ℃低温冰箱中
备用 。
1.3　样品前处理
提取　　称取均质样品 5.00 g 于 50 mL 具
塞离心管中 ,加入 10 mL 50%甲醇水溶液 ,旋涡
混匀 1 min ·L-1 ,超声提取 5 min ·L-1 ,以 4 000
r·min-1离心 15 min · L-1 , 使固液两相彻底分
离。移取上清液至 25 mL 容量瓶中 ,再用 5 mL
50%甲醇水溶液重复提取残渣 2次 ,上清液并入
容量瓶中 ,以水定容至刻度 ,混匀。
净化　　取上述粗提取液 5.0 mL 移入经
6 mL 甲醇 ,3mL 水和 3mL 50%甲醇水溶液处理
过的 LC-SAX柱上 ,以滴速流出后再依次用5 mL
10%乙腈水溶液 ,0.5 mL 柠檬酸洗脱液以每秒 1
滴的速度过柱 ,弃去流出液 ,最后用 2 mL 柠檬酸
洗脱液洗脱吸附在柱上的软骨藻酸 ,供 HPLC-
MS/MS测定。
1.4　液相色谱-串联质谱测定
色谱条件 　　色谱柱:Zo rbax XDB C18柱
(2.1 mm ×150 mm ×5 μm);进样量:20 μL;柱
温:30 ℃;流动相 A 相为为乙腈 , B相为 0.1%乙
酸水溶液 , Av∶B =20 +80 , 流速为 250 μL·
min-1 ,保持 6 minL。
质谱条件　　离子化模式为+ESI ,质谱分
辨率为单位分辨率 ,电喷雾电压(IS)为+5 250 V ,
辅助气流速(AUX)为 7 L·min-1 ,离子源温度
(T EM)为 475 ℃,去簇电压(DP)为 100 V ,聚焦
电压(FP)为 325 V ,雾化气(NEB)∶8 , 气帘气
(CUR)∶11 , EP∶8 , 碰撞气(CAD)∶10 , CXP∶17 ,
其它条件见表 1。
表 1　DA的参考保留时间和优化质谱条件
Tab.1　LC referrence retention time and optimized parameters of MS-MS conditions for DA
名称
nam e
参考保留时间
referrence reten tion t ime
(min)
母离子
parent ion
(m/ z)
子离子
daughter ion
(m/ z)
碰撞能量
CE(V)
相对丰度比＊
relative in tensity ratio
(%)
DA
2.56 312.1 161.4
266.4(定量用)
33
22
18.9
100
　　注:＊指定性离子对的峰面积与定量离子对的峰面积之比
Notes:＊means the rat io of area of qualit ative ion to area of quanti tive ion
2　结果与讨论
2.1　HPLC-MS/MS 测定参数的选择
用 DA 的标准溶液以流动注射的方式在正离
子模式下进行母离子全扫描 ,确定 DA 的 m +1
离子为 m/ z312.1 。然后以所得的 m/ z 数为母离
子 ,对其子离子进行全扫描(图 1)。从 DA 子离
子扫描图中选取两个特征性子离子 312.1/266.4
和 312.1/161.4 ,进行多反应监测(MRM),优化
去簇电压(DP)、聚焦电压(FP)、碰撞气(CAD)、
碰撞能量(CE)等质谱参数 ,其中以 CE 对离子对
的丰度影响最大(图 2)。接着用 FIA方式优化雾
化气(NEB)、气帘气(CUR)、电喷雾电压(IS)、辅
助气 温度 (TEM)等参 数 , 从 而获 得 上述
LCM SMS 测定条件 。
2.2　样品前处理方法的比较
在样品提取过程中 ,选择适合的提取溶液既
能提取出目标化合物 ,又能消除一些不必要的干
扰物 。根据软骨藻酸的结构特性 ,我们研究了不
同配比的甲醇水溶液对贝类中软骨藻酸的提取影
响 ,发现纯甲醇提取会导致样品中蛋白质的沉淀 ,
使软骨藻酸被沉淀包裹而不能释放到提取液中 ,
减低了回收率;而用纯水提取则导致大量水溶性
杂质 ,如组织纤维 、水溶蛋白等进行提取液中 ,给
净化工作带来很大难度。参考卫峰等[ 5] 的方法 ,
我们选用了 50%甲醇水溶液作为提取液 ,加标回
收率在 70%以上 。
由于贝类样品基体复杂 ,提取液中往往含有
一些蛋白质 、颗粒 、组织纤维等 ,这对色谱柱 、分离
等会产生一定的影响 ,因此需要选择进行合适的
净化方式 。固相萃取净化方式是目前最为常用的
净化方式之一 ,本实验根据以往的经验 ,选用 LC-
SAX柱进行净化方式的优化 ,结果表明 0.5 mL
柠檬酸洗脱液没有将软骨藻酸洗脱下来 , 而用
1 mL 柠檬酸洗脱液则有软骨藻酸洗脱下来 ,增加
柠檬酸洗脱液的体积至 2.5 mL 后也未见结果有
951　6 期 宋琍琍 , 等:液相色谱-串联质谱法测定贝类毒素软骨藻酸的残留
图 1　软骨藻酸 DA 的子离子扫描图
Fig.1　Daughte r ion scan spectrum of DA
图 2　碰撞能量 CE 对 DA 子离子峰强度的影响
Fig.2　Effect of CE on the intensity of DA daughter ions
增多现象 ,因此弃去最先的 0.5 mL 柠檬酸洗脱
液后 ,接 2 mL洗脱液就可 。
2.3　液相色谱-串联质谱图
在上述测定条件下 ,软骨藻酸 DA 标准品 、空
白贝类样品及空白贝类样品添加标准品后测定的
典型色谱图见图 3 ～ 5。将空白水产样品质谱图
与空白样品加入 DA 得到的质谱图进行比较 ,表
明 LC-SAX柱能有效去除基体的干扰 , 贝类样品
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图 3　DA 标准溶液(0.8mg·L-1)的质谱图
Fig.3　M RM chromato gr am of standard sample(0.8 mg·L-1)
图 4　空白文蛤样品质谱图
Fig.4　M RM chromatog r am o f blank sample
953　6 期 宋琍琍 , 等:液相色谱-串联质谱法测定贝类毒素软骨藻酸的残留
图 5　空白文蛤添加 DA 成 5μg·g-1后得到的质谱图
Fig.5　MRM chromatog ram o f spiked sample(5μg·g-1)
基体不干扰测定 。
2.4　定性和定量测定
在相同试验条件下 ,样品中待测物与同时检
测的标准物质具有相同的保留时间 ,并且相对丰
度比值也一致 ,则可判定为样品中存在该残留。
采用外标法对定量离子对进行定量计算 , 以
312.1/266.4计算 DA的浓度。以待测物浓度为横
坐标 ,以待测物峰面积为纵坐标 ,建立线性关系(图
6)。在10 ～ 4 000μg·L-1浓度内 (相当于样品浓度
0.02 ～ 8.0μg·g-1),面积与浓度关系线性良好 。
图 6　软骨藻酸浓度与峰面积的线性关系图
Fig.6　Linear cur ve of DA concent ration and a rea
954 水　产　学　报 32 卷　
2.5　回收率 、精密度和灵敏度
称取文蛤空白样品 30份作为方法回收率与
精密度试验材料 ,向空白样品中添加标准品 ,添加
浓度水平分别为 0.02 μg·g -1 、0.1μg·g-1 、0.2
μg·g-1 、2.0μg·g-1和 4.0 μg·g-1 ,每个水平设 6
个重复 ,混匀静置 30 minL 后按照上述方法进行
提取 、净化 、测定 ,以外标法计算来验证方法的回
收率 。方法的回收率和精密度列于表 2。从表 2
可以看出 , 方法的回收率为 80.5% ～ 92.2%,
RSD为 4.42%～ 9.46%。
理论上规定 3 倍信噪比(S/N=3)为方法的
检出限 , 10 倍信噪比(S/N =10)为方法的定量
限。在0.02μg·g-1的浓度下 ,软骨藻酸的信噪比
S/N远大于 10 ,由于尚未对更低的浓度进行测
定 ,考虑到 0.02μg·g -1的浓度远低于国内外的
20μg·g -1的限量要求 ,因此本方法以 0.02 μg·
g
-1为定量限。
表 2　方法的回收率与相对标准偏差
Tab.2　Recoveries and relative standard deviations
of DA in blank shellfish samples(n=6)
添加物质
nam e
加标浓度
added conc.
(μg·g -1)
测定浓度
detected conc.
(μg·g -1)
回收率
recovery
(%)
RSD
(%)
DA
0.02 0.0182 91.0 4.42
0.1 0.0922 92.2 4.90
0.2 0.160 80.0 9.46
2.0 1.61 80.5 8.50
4.0 3.40 85.0 5.76
2.6　方法的应用
对浙江沿海的 34批次的文蛤 、贻贝 、泥蚶等
贝类按上述方法进行软骨藻酸残留的测定 ,结果
有 1个样品检出有软骨藻酸残留(0.02μg·g-1),
但含量远低于安全卫生标准值 。
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955　6 期 宋琍琍 , 等:液相色谱-串联质谱法测定贝类毒素软骨藻酸的残留
High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
for the determination of residue of domoic acid in shellfish
SONG Li-li1 , 　ZHANG Hai-qi1 , 　HOU Jing-de2 , 　HE Xin1
(1.Zhej iang F ishery Products Quality Testing Center , Hangzhou　310012 , China;
2.Center o f Analysis and Measurement , Zhej iang University , Hangz hou　310027 , China)
Abstract:Contamination o f shellf ish products by dif ferent biotoxins is one o f the most impo rtant
issues leading to the conce rn of food safety , which directly related to the health of seafood consumers.
Even miniscule do ses of some alg al to xins , such as domoic acid (DA)o r saxi tox in , can cause severe
i llness o r death in humans.T herefo re , its important to car ry on the reseaches on biotox ins
contaminat ion in shellf ish , especially in China , where the shellf ish mariculture indust ry has become
mo re and more impo rtant.Detection method targeted on domoci acid bio to xin has been developed
using liquid chroma tog raphy in China but li tt le info rmation is available on its Conf irming Me thod.In
this study , a high-performance liquid chromatog raphy-tandem mass spect rometric me thod w as
established fo r the determination of residue of domoic acid in shel lfish.Shellfish samples w ere co llected
f rom Zhejiang Province f rom M arch to N overmber in 2007.DA were ext racted f rom homogenized
samples w ith 50%methano l solut ion , fo llow ed by clean-up of the ex t racts w ith LC-MAX column , and
eluted by cit rate so lution.Tw o daughter ions(m/ z 803.5/255.1 , m/ z 803.5/563.1)were scanned ,
analy te identification w ere perfo rmed by elect rospray ionization(ESI)in posi tive mode using MRM and
the quantif icat ion w ere performed using ex ternal standard method.The conditions of high-
performance liquid chromatog raphy-tandem mass spectrometry w ere as fo llow s:posit ive ion
elect ro spray ionizat ion (+ESI)mode , IS +5250V , T EM 475 ℃, DP100V , FP325V , N EB8 , CUR11 ,
EP8 , CAD10 ,CXP17 ,CE23(m/ z 312.1/266.4),CE34(m/ z 312.1/161.4).The mobile phase of HPLC
was the acetoni t rile:0.1% acetic acid w ater solution (vo l/vol:20:80)and the chromatog raphic
column w as Zorbax XDB-C18(2.1 mm×150 mm ×5μm).The result show ed tha t the limi t o f detection
was 0.02μg·g-1 , and the linear range w as 0.02μg·g-1 -8.00μg·g-1 .At spiked level of 0.02μg·g-1 -
4.00μg ·g -1 , the average recove ries of DA were 80.2%-92.2%, RSD were 4.42%-9.46%,
respectively .A batch of main aquaculture shellf ishes collocted along the Zhejiang coast w as evaluated
using the above method.The results showed that the LCMSM S method is sensitive , reliable ,
selective and specif ic fo r the dete rmination of domoic acid.
Key words: shellf ish; domoic acid; high-pe rfo rmance liquid chromatog raphy-tandem mass
spect rometry;mult iple reaction moni to ring(MRM)
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