全 文 ：
第 36卷第 12期 水 产 学 报 Vol.36, No.12
2012年 12月 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Dec., 2012


收稿日期: 2012-04-19 修回日期: 2012-09-05
资助项目: 国家自然科学基金项目(41176151); 国家“八六三”高技术研究发展计划(2012AA100811); 公益性行业(农业)科研
专项(200903030); 海洋公益性行业科研专项(201105008,201105023); 福建省杰出青年基金项目(2010J06016); 福建
省教育厅新世纪优秀人才项目(JA10186); 福建省科技重大专项(2011NZ0001)
通讯作者: 谢潮添, E-mail: ctxie@jmu.edu.cn
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文章编号: 1000-0615(2012)12-1826-08 DOI:10.3724/SP.J.1231.2012. 28118
坛紫菜核糖体蛋白 S15a 基因的克隆及高温胁迫表达分析
梅高尚, 纪德华, 李 兵, 徐 燕, 陈昌生, 谢潮添*
(集美大学水产学院, 福建 厦门 361021)
摘要: 坛紫菜栽培中经常遭遇高温胁迫危害而产生烂菜现象，为研究坛紫菜在高温胁迫条件
下的分子应答机制, 分离并克隆高温胁迫应答的相关基因, 应用引物退火控制(ACP)技术对
耐高温型纯系 Z-61 叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时, 获得一条在高温
胁迫条件下表达水平显著降低的基因片段, 通过 5′-RACE 技术获得了它的全长, 命名为
Phrps15a(GenBank 登录号：JN991055.1)。该基因序列全长 676 bp, 包含一个 390 bp 的开放
阅读框编码 130 个氨基酸的核糖体 S15a 蛋白(PhRPS15a), 蛋白分子式为 C664H1066N188O180S7,
由 3 条螺旋、7 个片层及 8 个环状连接组成, 与多个物种的 RPS15a 蛋白具有较高的序列一
致性(78%~80%)。系统进化分析表明,动物、高等植物、绿藻和坛紫菜 PhRPS15a 蛋白均享有
独立的进化分支, 但坛紫菜 PhRPS15a 蛋白与团藻和莱茵衣藻的亲缘关系更近。实时荧光定
量 PCR 分析结果表明, Phrps15a 基因的表达水平与高温胁迫密切相关, 在高温胁迫条件下,
Phrps15a 基因的表达水平极显著下调。
关键词: 坛紫菜; 引物退火控制技术; 核糖体蛋白 S15a; 高温胁迫; 克隆; 表达
中图分类号: Q 785；S 917.3 文献标志码: A
坛紫菜( Porphyra haitanensis) 是我国特有的
暖温带性种类, 原产于福建沿海潮间带的岩礁上,
自 20世纪 60年代全人工栽培取得成功以来, 坛紫
菜栽培迅速发展, 目前已经成为我国南方沿海的
主要养殖品种之一, 其产量约占全国紫菜总产量
的 80%, 创造了可观的经济效益[1]。
坛紫菜生长的适宜水温为 15~26 ℃, 每年 9月
份海水水温降至 26 ℃以下时, 就可以采壳孢子上
网, 开始紫菜的栽培过程。网帘下海 10~15 d后, 紫
菜初见苗, 如果此时水温低于 25 ℃, 且逐渐下降,
就对幼苗的生长有利。如果小潮遇上持续南风、高
温、风平浪静的天气, 水温上升就很容易造成幼苗
烂苗和脱苗现象, 严重影响坛紫菜的后续生长。长
期以来, 由于对坛紫菜的良种选育工作相对滞后,
很多紫菜养殖户连续多年自养自留, 每年随意从
人工栽培海区取一些紫菜作为种菜, 没有经过严
格的筛选, 造成近亲繁殖, 种质严重退化; 再加上
养殖户为使紫菜提早上市, 壳孢子采苗的季节愈
来愈早, 而南方海区每年 9—10月份很容易出现持
续高温的闷热天气, 近年来, 已多次发生高温导致
坛紫菜幼苗烂苗或成菜烂菜、减产的事件, 严重威
胁着坛紫菜栽培业的持续发展[2]。因此, 研究坛紫
菜高温胁迫应答的分子机制, 分离并克隆高温胁
迫应答相关基因, 对于指导后续耐高温品种的选
育, 保证坛紫菜栽培业的可持续健康发展具有重
要意义。
引物退火控制(annealling control primer, ACP)
技术是一种在 DDRT-PCR(mRNA 差异显示技术)
基础上发展起来的筛选差异表达基因的新方法[3],
该方法能够很好地消除起始反应的非特异性, 具
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有假阳性低、重复性好、PCR产物分布范围广泛、
速度快且成本低廉等优点[3-4], 已在哺乳动物和水
生动物发育和抗病相关差异表达基因的克隆中得
到了广泛应用[5-8], 谢潮添等[9]也采用该技术在坛
紫菜中克隆得到了一条高温胁迫应答相关的基因
Phrps7。因此, 本实验拟采用 ACP技术继续对坛紫
菜高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选, 并
进行差异表达基因的全长克隆和应答高温胁迫不
同时间水平的表达定量分析, 以期丰富坛紫菜高
温胁迫应答相关的基因资源, 为进一步分析坛紫
菜的高温胁迫应答机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 坛紫菜样品及高温胁迫处理
供试材料为人工杂交选育获得的耐高温品系
Z-61 的 F4 叶状体[6], 取自福建省坛紫菜种质资源
库。
将坛紫菜藻体在正常条件下[温度(21±0.5) ℃,
光照 2 000~3 000 lx, 昼夜光周期 12 h : 12 h, 每 3
天更换一次培养液]培养至(15±2) cm 时, 选取叶面
平滑、色深有光泽、无斑点烂洞的完整藻体置于
(30±0.5) ℃的恒温光照培养箱中进行高温胁迫处
理(其余培养条件同正常条件)6 h 后作为实验组,
以正常温度下培养的藻体为对照组分别提取总
RNA, 并逆转录为 cDNA 后用于高温胁迫差异表
达基因的筛选。
同时 , 另取一组(15±2) cm 的完整藻体置于
(30±0.5) ℃的恒温光照培养箱中分别进行高温胁
迫处理(其余培养条件同正常条件)0、3、6、9、12
和 24 h 后, 提取总 RNA, 用于基因表达水平的实
时荧光定量 PCR分析。每个处理组设置 3个平行。
1.2 引物及其序列
ACP筛选差异表达基因片段、5′-RACE扩增、
全长基因 head to toe 验证和基因表达水平定量分
析所用引物序列如表 1所示, 由上海生工生物工程
有限公司合成。

表 1 实验中所用引物的名称和序列
Tab. 1 Name and sequence of primers in this experiment
引物名称
primer
引物序列(5′-3′)
primer sequence
dT-RSL AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
ACP
RSL2 AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTIIIIIAGGCGATGCC
UPM-L CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
UPM-S CTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
GSP CCCAGTTCTCCACCTGTCCTACC
RACE
NGSP GCCAATGTAGCCGTGCTTCTG
rsp15F TCCCTCGTCCCGCTCTTCCT
head to toe
rsp15R GAGGGAGCCGAATGTGGGTAT
rsp15qF TGCAGAAGCACGGCTACATT
rsp15qR AGTTCTCCACCTGTCCTACCTTG
18SF AATGTCGACAGGGCAAGTCTGGTGAA
qPCR
18SR AACCCGGGCTCCATTAGAGTCTCTGAAG

1.3 总 RNA的分离纯化
收集坛紫菜藻体 0.1 g, 经滤纸吸干和液氮研
磨后, 采用 EASYspin 植物 RNA 快速提取试剂盒
(艾德莱生物技术有限公司, 北京)提取各样品的总
RNA。
1.4 差异表达基因筛选与克隆
逆转录合成cDNA第一条链 分别在两个0.5
mL 的 PCR 管中加入如下反应组分：1~3 μg 总
RNA, 10 μmol/L dT-RSL引物 2 μL, 加无 RNA酶
双蒸水至总体积12 μL, 混合均匀后70 ℃孵育2 min,
再在冰上冷却 2 min。接着向两个 PCR管中分别继
续加入如下反应组分：5×RT Buffer 4 μL, 10 mmol/L
dNTP 1 μL, 20 mmol/L DTT 2 μL, 200 U/μL 逆转
录酶 1 μL, 混合均匀后 42 ℃孵育 90 min, 再 94 ℃
变性 2 min。合成的对照组和实验组的 cDNA第一
条链分别用无 DNA 酶双蒸水稀释相应倍数后, 放
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置于−20 ℃冰箱中备用。
ACP 技术筛选差异表达基因 分别在两个
0.5 mL的 PCR管中, 加入 20 μL如下反应体系：
10 × PCR Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL, 10
μmol/L dT-RSL 1 μL, 10 μmol/L RSL2随机引物 1
μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.1 μL, cDNA(对照组
或实验组)1 μL, 加双蒸水至总体积 20 μL。PCR扩
增程序为 94 ℃ 预变性 5 min, 50 ℃ 3 min, 72 ℃
2 min, 1个循环; 94 ℃ 40 s, 65 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s,
35个循环; 72 ℃ 5 min。PCR扩增后, 分别取对照
组或实验组扩增产物 7 μL, 采用 1.2%的琼脂糖凝
胶电泳检测 PCR扩增产物。
目的片段切胶回收、转化及测序 采用琼脂
糖凝胶 DNA 回收试剂盒(中科瑞泰生物科技有限
公司 , 北京)回收差异表达片段。将回收产物同
PMD-18T 载体(TaKaRa)连接后转化至感受态细胞
E. coli DH5α中, 经蓝白斑筛选和M13引物阳性克
隆验证后, 将阳性克隆扩大培养, 并采用MiniBEST
Plasmid Purification试剂盒提取质粒DNA(TaKaRa,
大连)后送往大连宝生物工程有限公司测序。
1.5 差异表达基因的全长克隆
由于 ACP 技术筛选获得的差异表达基因片段
均含完整的3′-polyA结构, 因此只需根据测序获得
的差异表达基因片段序列设计 5′ 端引物进行
5′-RACE 扩增, 即可获得该差异表达基因的全长
序列。
采用 Primer Premier 5.0 软件设计获得差异表
达基因 5′-RACE特异性扩增引物(GSP)和巢式引物
(NGSP)。首先按照 SMART RACE cDNA Amplifi-
cation Kit (clontech)的操作说明取 1 μg总 RNA用
于5′-RACE cDNA第一链的合成, 然后将合成后获
得的 10 μL体系用 Tricine-EDTA Buffer稀释至 100
μL备用。
5′-RACE反应体系为 5′-RACE cDNA 2.5 μL,
10×advantage PCR Buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 1
μL, 50× advantage polymerase mix 1 μL, 引物 GSP
(10 μmol/L)1 μL, UPM (10×, 试剂盒自带引物) 5
μL, 最后补充 PCR-grade water至总体积为 50 µL。
PCR扩增程序为 94 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 5个循环;
94 ℃ 30 s, 70 ℃ 3 min, 5个循环; 94 ℃ 30 s, 68 ℃
3 min, 72 ℃ 3 min, 27个循环; 4 ℃ 10 min。将首
轮 PCR产物稀释 50倍后取 5 µL进行第二轮扩增,
第二轮扩增反应体系为首轮 PCR扩增产物稀释 50
倍的产物 5 µL, 10×advantage PCR Buffer 5 μL, 10
mmol/L dNTP 1 μL, 50× advantage polymerase mix
1 μL, 引物NGSP(10 μmol/L)1 μL, 引物NUP (10×,
试剂盒自带引物) 5 μL, 最后补充 PCR-grade water
至总体积为 50 µL。PCR扩增程序同第一轮, 只将
最后一步 27 个循环改成 15 个循环。扩增产物用
1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离后, 回收并纯化目的
条带。
目的片段克隆和测序方法同“1.4”, 将测序获
得的序列同“1.4”中的序列通过软件 MEGA 5.03
进行拼接, 获得一条差异表达基因的完整序列。进
一步根据拼接成的完整序列设计 head to toe引物,
再次以逆转录获得的 cDNA为模板进行 PCR扩增,
以验证拼接序列的正确性和完整性。
1.6 差异表达基因 Phrps15a的生物信息学分析
使用 ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)软件分析拼接完成后序列的开放阅
读框(ORF)和编码氨基酸序列, 采用在线软件进行
蛋白质同源性比对、多重序列分析和基因编码蛋白
的一、二和三级结构预测分析。并从 GenBank 数
据库中选取模式生物人(Homo sapiens, NP_001010.2),
小鼠(Mus musculus, P62245.2), 斑马鱼(Danio rerio,
NP_997927.1), 果 蝇 (Drosophila melanogaster,
NP_524709.1), 油菜 (Brassica napus, Q00332.3),
拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_172256.1), 小麦
(Triticum aestivum, HM055513.1), 莱 茵 衣 藻
(Chlamydomonas reinhardtii, XP_001700656.1), 团
藻(Volvox carteri f.Nagariensis, XP_002947188.1)9
个物种的核糖体蛋白 S15a序列, 采用 MEGA 5.03
软件根据除权配对法(unweighted pair group method
with arithmetic mean, UPGMAM)构建了 PhRPS15a
蛋白的系统发育树。
1.7 坛紫菜 Phrps15a 基因表达水平的定量 RT-
PCR分析
根据 Phrps15a基因序列设计定量 PCR正反向
引物 Rsp15qF和 Rsp15qR, 并以 18S rRNA引物作
为内参, 进行 Phrps15a 基因在高温胁迫不同时间
水平下相对表达量的实时荧光定量 PCR分析。
提取的各样品(高温胁迫条件下分别培养 0, 3,
6, 9, 12和 24 h的叶状体)总 RNA按 TaKaRa公司
的 PrimeScript○R RT reagent kit说明书进行操作, 以
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Random 6 mers为引物进行反转录反应。25 μL的
反应体系包含：12.5 μL 2×SYBR○R Premix Ex TaqTM
Ⅱ(TaKaRa), 0.2 μmol/L引物和 2 μL反转录产物。
扩增程序为 95 ℃变性 1 min; 95 ℃ 10 s, 62 ℃ 30 s,
40个循环。循环结束后从 55 ℃缓慢升温至 95 ℃,
绘制溶解曲线。荧光定量 PCR扩增在 ABI7300型
定量 PCR仪上进行。
以10×梯度稀释的 cDNA为模板进行定量PCR
扩增, 制作 Phrps15a 基因和内参的标准曲线。每
次反应都设置阴性对照和无模板对照, 每个反应
设 3个平行复孔。应用 Excel和 SPSS 13.0软件对
试验数据进行统计分析, 并采用单因素方差分析
(One-Way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较
不同数据组间的差异 , P < 0.05 表示差异显著 ,
P < 0.01表示极显著差异。
2 结果
2.1 差异表达基因筛选和全长克隆
采用 ACP技术, 在通用引物 dT-RSL与 20条
RSL随机引物组成的 20对引物组合对坛紫菜叶状
体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,
引物 dT-RSL与 RSL2组合在对照组中扩增出了一
条长度约为 550 bp的差异表达基因片段(图 1-a)。
该基因片段经切胶回收和转化克隆后测序, 序列
长度为 512 bp, 3′端含有 29 bp的 polyA序列。
以此为基础, 采用 5′-RACE 技术进行该基因
序列 5′ 端的扩增, 得到一条长度约为 420 bp 的特
异性片段(图 1-b), 经过克隆、测序并与 3′端序列拼
接后得到一条 676 bp的完整序列。使用 head to toe
引物进行 PCR扩增, 电泳结果如图 1-c所示, 割胶
回收后再次测序, 结果与拼接获得的完整序列完
全一致, 说明拼接的目的片段是差异表达基因的
全长序列。
采用 ORF Finder软件分析发现该全长基因序
列从第 148个碱基开始至第 540个碱基为完整的开
放阅读框(ORF), 其余为非编码序列, 可编码 130
个氨基酸(图 2)。进一步通过 BlastX软件进行氨基
酸序列同源性比对发现该基因编码的蛋白质属于
核糖体 S8 蛋白超家族, 与人、小鼠、斑马鱼、果
蝇、油菜、拟南芥、小麦、莱茵衣藻和团藻的序列
同源性为 78%~80%。图 3 为该基因编码氨基酸序
列与其他物种相应蛋白氨基酸序列的多重序列比
对结果。由此可以推断所克隆的差异表达基因片段
为坛紫菜核糖体蛋白 S15a 基因序列 , 命名为
Phrps15a。将序列提交至 GenBank数据库中, 登录
号为 JN991055。



图 1 基因差异表达片段筛选及全长克隆电泳图
(a) 引物 dT-RSL与 RSL2组合扩增产物电泳图; (b) 5′RACE产物电泳图; (c) 全长序列检测电泳图; M1. 50 bp DNA marker; M2.
DL2000 DNA Marker; N. 对照组 , H. 实验组; 箭头 .差异表达基因片段; 1. 5′-RACE 第一轮扩增结果; 2.5′-RACE第二轮扩增结
果; 3,4.2个平行实验。
Fig. 1 Agarose electrophoresis of different expressed gene screening and gene full-length cloning
(a) Agarose electrophoresis of different expressed gene screening; (b) Agarose electrophoresis of gene full-length cloning by 5′RACE;
(c) Agarose electrophoresis of validating of full-length gene; M1. 50 bp DNA marker; M2. DL2000 DNA Marker; N. thalli was cultured
under normal temperature; H. thalli was cultured under high temperature for 6 days; Arrow. fragment of differential expression gene; 1. the
amplified result of first cycle of 5′-RACE; 2. the amplified result of second cycle of 5′-RACE; 3, 4. two parallel results).
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图 2 坛紫菜核糖体蛋白 S15a 基因核苷酸序列及预测的氨基酸序列
atg.起始密码子, tag.终止密码子。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of ribosomal protein S15a of P.haitanensis
atg is the initiation codon, tag is the termination codon.



图 3 核糖体蛋白 S15a 氨基酸序列的多重序列比对
Fig. 3 Multiple sequence alignment of ribosomal protein S15a based on amino acid sequences

2.2 坛紫菜 Phrps15a基因编码蛋白分析
采用 ExPASy ProtParam 软件分析坛紫菜
Phrps15a基因的编码产物, 该基因编码 130个氨基
酸的蛋白质, 分子式为 C664H1066N188O180S7, 分子
量为 14787.3, 理论等电点为 9.90, 负电荷氨基酸
残基 (Asp+Glu)总数为 11, 正电荷氨基酸残基
(Arg+Lys)总数为 20, 不稳定系数为 28.97, 脂肪系
数为 92.85, 总平均疏水度为-0.172, 表明该蛋白质
稳定 , 亲水性较强 , 易溶于水溶液中。利用
PredictProtein 程序预测该蛋白的二级结构中构成
螺旋(H)、片层(E)和环状(L)的氨基酸残基占总氨基
酸比例分别为 26.92%、33.85%与 39.23%。利用在
线软件 Swiss-Model对坛紫菜 PhRPS15a氨基酸序
列的三级空间结构进行预测（图 4）, 该蛋白由 3
条螺旋, 7个片层及 8个环状连接组成。
2.3 坛紫菜 Phrps15a蛋白的系统进化分析
采用 UPGMAM 法构建了坛紫菜及其它生物
进化阶元的部分代表物种 RPS15a蛋白氨基酸序列
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的系统进化树(图 5)。由图可知, 所有的 RPS15a起
源于一个共同的祖先蛋白, 首先进化出 2个原始分
支, 动物和植物分别聚合成一个独立的进化分支。
在所选用的植物界物种中, 高等植物、绿藻和坛紫
菜分别享有独立的进化分支, 但坛紫菜 RPS15a 蛋
白与团藻和莱茵衣藻RPS15a蛋白的亲缘关系更近。



图 4 坛紫菜核糖体蛋白 S15a 的三级结构
Fig. 4 Three-dimension structure of ribosomal protein
S15a of P. haitanensis



图 5 基于氨基酸序列构建的核糖体蛋白 S15a
系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic tree of ribosomal protein S15a
based on amino acid sequence

2.4 坛紫菜 Phrps15a基因表达水平的实时荧光定
量 PCR分析
坛紫菜 Phrps15a 基因和内参的实时荧光定量
PCR 扩增曲线基线平整, 指数增长区明显, 斜率大
且固定, 溶解曲线显示扩增产物均为单一的特异峰,
阴性对照和无模板对照均无扩增, 3 个平行复孔扩
增结果重复性良好，说明扩增体系和反应条件良好,
无非特异性扩增 , 定量结果准确可靠 (图 6),
Phrps15a基因在高温胁迫各时间水平下的表达水平
均要显著低于常温对照。高温胁迫 3 h时, 即可检测
到 Phrps15a 基因的表达水平发生极显著的下降
(P<0.01), 胁迫 9 h时达到最低点, 12 h以后表达量
又有一定的回升 , 但仍显著低于胁迫开始前
(P<0.05)。定量分析结果与前面 ACP筛选实验结果
一致, 由此推断, Phrps15a 基因的表达受到了高温
胁迫的抑制。


图 6 Phrps15a 基因在高温胁迫
不同时间水平下的相对表达情况
Fig. 6 Relative expression level of Phrps15a gene
under high temperature stress with different time

3 讨论
植物在长期的生命进化过程中, 通过不断发
生的遗传变异和自然选择, 发展出了各种各样的
应对环境的适应机制, 当遭受逆境胁迫时, 就会启
动一系列的生理响应过程以抵抗环境的胁迫作用,
这一过程是一个庞大且复杂的系统, 包括了无数
的调节和反馈机制, 不但涉及大量基因的上调表
达, 同时也包含一大批基因的下调表达[10]。作为低
等植物的藻类也不例外, 王孟强[11]利用基因芯片
技术研究了条斑紫菜在不同失水水平下的基因表
达谱变化, 结果发现在条斑紫菜配子体的失水过
程中, 大约有 8.74%~11.09%的基因上调, 而下调
表达基因的数量则在各个阶段变化较大。本研究通
过 ACP 技术在高温胁迫培养条件下的坛紫菜耐高
温型纯系 Z-61 叶状体中筛选出了一条下调表达的
基因片段, 经全长克隆和同源性比对确认其为核
糖体蛋白 S15a基因。
核糖体是生物细胞内最重要的细胞器之一 ,
主要执行解码 mRNAs, 并与 tRNA 一起合成相应
蛋白质的功能。在真核细胞中, 核糖体是由 40S的
小亚基和 80S大亚基组成, 主要包括 4种 rRNA和
大约 80 种蛋白质[12]。越来越多的证据表明, 核糖
体蛋白除组装成核糖体、参与蛋白质生物合成之外,
还具有其他的功能, 如参与 DNA复制、修复, RNA
的加工以及发育调控等, 核糖体蛋白基因表达异
常 将 影 响 核 糖 体 的 功 能 [13] 。 核 糖 体 蛋白
S15a(ribosomal protein s15a, RPS15a)是 40S小亚基
的组成成分之一, 它位于细胞质中, 归属于核糖体
蛋白 S8P家族。目前关于 RPS15a的功能和它与其
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他核糖体蛋白或 rRNA的相互作用还知之甚少。
在动物中, 有研究表明 RPS15a基因参与了肝
癌的发生和发展[14-15], Uechi 等[16]在斑马鱼的研究
中进一步证实了 RPS15a 基因就是斑马鱼的癌基
因。在植物中, 已有的研究结果均表明, RPS15a基
因的表达与细胞的活跃分裂有关 , 如 Bonham-
Smith等[17-18]、Schaap等[19]、窦红等[20]在油菜、双
孢菇和连翘中的研究结果均表明,该基因在分裂组
织中的表达水平要显著高于其它组织中的表达水
平。此外, 栗现芳等[21]对小麦 RPS15a基因的研究
发现,该基因的表达上调可能与小麦多子房性状的
发生有关。本实验中 , 高温胁迫条件下坛紫菜
RPS15a 基因的表达水平显著下降, 可能与坛紫菜
对高温胁迫的应答机制相关。高温胁迫条件下, 坛
紫菜藻体为了减少高温胁迫对自身的伤害, 抑制
RPS15a 基因的合成, 以减缓细胞的分裂速度, 从
而减少自身的能量消耗, 以渡过高温胁迫期。这与
坛紫菜在高温胁迫条件下培养, 生长速度明显下
降的表型变化现象相符, 因为紫菜藻体的生长属
于“散生长”, 其个体的生长速度完全取决于细胞
的分裂速度。

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Molecular cloning and expression analysis under high temperature
stress of ribosomal protein S15a gene from Porphyra haitanensis
MEI Gao-shang, JI De-hua, LI Bing, XU Yan, CHEN Chang-sheng, XIE Chao-tian*
(College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China)
Abstract: Porphyra haitanensis is an economically important marine crop in southern China. A major
problem in Porphyra farming is thallus decay in response to high temperature stress. Molecular studies of
temperature stress can help to resolve the issue of thallus decay. In this study, to study the molecular
mechanism of high temperature tolerance in P. haitanensis, the technology of annealling control primer
(ACP) was used to screen the differential expressed genes in gametophytic blades of an F4 high tempera-
ture tolerance line Z-61. By the primers combination of dT-RSL and RSL2, one differential expressed gene
fragment was cloned. And the full length sequence of this gene fragment was cloned by 5’RACE technol-
ogy and named as Phrps15a(acceession number JN991055.1). The Phrps15a gene with a 676bp sequences
contains an open reading frame of 390 bp encoding a PhRPS15a protein of 130 amino acid residues. The
PhRPS15a protein which was assembled by 3 helices, 7 sheets and 8 cycles shared high amino acid sequence
identity with RPS15 from other organisms (78%-80%), and its molecular formula was C664H1066N188O180S7.
Phylogenetic analysis showed that the evolution of PhRPS15a of animal, higher plant, green algae and
P.haitanensis has unattached evolutional groups, and the PhRPS15a protein of P.haitanensis has closer re-
lation with RPS15a proteins from green alga than ones from other organisms. The results of real-time
quantitative PCR indicated that the expressed level of Phrps15a has close relation with high temperature
stress. Under high temperature stress, the expression of Phrps15a gene was down-regulated significantly.
Key words: Porphyra haitanensis; technology of ACP; ribosomal protein S15a; high temperature stress;
cloning; expression
Corresponding author: XIE Chao-tian. E-mail: ctxie@jmu.edu.cn