全 文 ：园　艺　学　报　2006, 33 (2):349 ～ 355
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2005 - 06 - 16;修回日期:2005 - 10 -24
基金项目:长江学者和创新团队发展计划项目 (IRT0453);高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金项目 (200357)
*通讯作者 Au thor for correspondence (E-m ail:grm b@ s icau. edu. cn)
应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR-RFLP技术
研究大花蕙兰的遗传多样性
甘　娜 1, 2　谭向红 1　陈其兵 1　魏育明2　郑有良 2*
(1四川农业大学林学园艺学院 , 雅安 625014;2四川农业大学小麦研究所 , 成都 611830;3四川师范大学地理与资源
科学学院 , 成都 610066)
摘　要:利用 RAPD、 叶绿体和线粒体基因组 PCR-RFLP标记系统评价了大花蕙兰 20个品种的遗传多
样性。在 50个 RAPD引物分析中 , 有 36个引物 (72.0%) 能揭示材料间的多态性 , 材料间遗传相似系数
为 0. 503 ～ 0. 765, 平均 0. 598, 根据遗传相似系数进行聚类分析表明 , RAPD标记能将所有材料区分开 。在
7个叶绿体基因组 (cpDNA) 的 PCR-RFLP分析中 , 6个标记 (87.5%) 可扩增出 1至多条清晰的谱带;扩
增产物经 7种限制性内切酶消化后 , 6个标记的 19种引物 /酶组合共检测到 53条 DNA片段 , 其中多态性片
段有 37条 , 占 69.8%;材料间遗传相似系数变化范围为 0. 571 ～ 0.949, 平均值为 0.766。在 8个线粒体基
因组 (m tDNA) 的 PCR-RFLP标记分析中 , 只有 3个 (37.5%)标记能得到 1条清晰的谱带;利用 7种限制
性内切酶对 3个标记的扩增产物消化后 , 在 10种标记 /酶组合中 , 共检测到 33条酶切片段 , 其中 21条
(63. 6%) 具有多态性;遗传相似系数为 0. 634 ～ 1.000, 平均 0.829。这些结果表明 , RAPD标记揭示的大花
蕙兰遗传多样性最高 , 其次为 cpDNA PCR-RFLP标记 , 而 m tDNA PCR-RFLP标记揭示的遗传多样性最低。
关键词:大花蕙兰;RAPD;PCR-RFLP; cpDNA;m tDNA
中图分类号:S 682.31　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2006) 02-0349-07
Genetic D iversity in Cymb idium Based on RAPD M arkers and PCR-RFLP
Analyses ofO rganellar DNAs
G an Na
1, 2 , Tan X ianghong1 , Chen Q ibing1 , W ei Yum ing2 , and Zheng You liang2*
(1College of Forestry and Horticulture, S ichuan Agricu ltural University, Yaan 625014, China;2Triticeae R esearch Institute,
S ichuan Agricultura l University, Chengdu 611830, China; 3Faculty of Geography and Resources Science, S ichuan Norm al
Un iversity, Chengdu 610066, China)
Abstract:The gene tic d iversity among 20Cymbidium accessionsw as inve stiga ted by RAPDm arkers and
PCR-RFLP analyses o f organe llar DNA s. In RAPD analyses, the amplified p roduc ts of 36 primers (72.0%)
were po lymorphic. The RAPD-based gene tic sim ilarity (GS) among 20 Cymbidium accessions ranged from
0.503 to 0.765, w ith themean of 0.598. Based on gene tic sim ilarity matrix resu lting from RAPDmakers, the
gene tic re lationships among 20 Cymbidium accessions w ere estim ated by UPGMA (unw eigh ted pair group
me thod w ith arithme tic means) clustering analy sis. It w as found tha t a ll 20 Cymbid ium accessions cou ld be
distinguished by RAPD markers. In cpDNA PCR-RFLP ana lyses, 6 ou t of 7markers (87.5%) cou ld produce
one ormore than one distinct bands by direct electropho resis in 2% ag ro se gels. A fte r the amplified products
w ere dige sted by 7 restriction enzymes, a to tal of 53 bandsw ere detected in 19 cpDNA PCR-RFLP marker /en-
zyme combinations, among wh ich 37 bands (69.8%)were po lymo rphic. The cpDNA PCR-RFLP-based ge-
netic sim ilarity (GS) among 20Cymbidium accessions ranged from 0.571 to 0.949, w ith themean o f0.766.
O f the 8m tDNA PCR-RFLP markers, 3markers(37.5%) could p roduce one distinct band w ith no polymor-
phism detected by direct e lectrophoresis in 2% ag ro se ge ls. A fte r the amplified productsw ere digested by 7 re-
striction enzymes, a to tal of 33 bands w ere detected in 10m tDNA PCR-RFLP marke r /enzyme comb inations,
DOI牶牨牥牣牨牰牬牪牥牤j牣issn牣牥牭牨牫牠牫牭牫x牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牪牬
园　　艺　　学　　报 33卷
among which 21 bands (63.6%)were po lymorphic. The m tDNA PCR-RFLP-based gene tic sim ilarity (GS)
among 20 Cymbidium accessions ranged from 0.634 to 1.000, w ith themean of 0.829. These results sugges-
ted tha t relatively h ighe r level o f gene tic polymorphism in Cymbid ium cou ld be de tec ted by RAPD m arkers,
whe reas re latively low er level gene tic polymorphism could be estima ted by m tDNA PCR-RFLP marke rs.
Key words:Cymbid ium;RAPD;PCR-RFLP;cpDNA;m tDNA
大花蕙兰是兰科兰属 (Cymbidium)多年生附生性兰草本植物。关于大花蕙兰的栽培技术 、 繁殖
方法等方面已有较多研究 〔1, 2〕 , 但兰属植物变异性大 , 中间类型多 , 且至今未能解决其分类和系统学
的问题 , 给进一步杂交培育新品种带来不便。近年来 , RAPD技术已被应用于兰花等观赏植物的分类
及进化等方面的研究 〔3 ～ 7〕。植物细胞质基因组包括叶绿体基因组 (cpDNA)和线粒体基因组 (m tD-
NA)〔8〕。相对于核基因组来说 , 其遗传模式为简单的单亲遗传 , 较少发生重组 , 偶尔发生突变 , 序列
和结构进化速度较慢 , 可作为物种鉴定和研究种间分子进化以及系统发育的理想工具〔9, 10〕。本研究采
用 RAPD和细胞质基因组 PCR-RFLP技术 , 对大花蕙兰 20个不同的品种的品种鉴定和遗传多样性进
行系统评价 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
试验材料为 20个大花蕙兰品种 (图 2), 其中 1 ～ 3号由四川省农业科学院园艺研究所提供 , 4 ～
20号由绵阳鲜绿果蔬有限责任公司从日本向山兰园株式会社引进的 17个品种 。
1.2　DNA的提取
取新鲜叶片约 3 g, 在液氮中研磨成粉末 , 转入 50 mL离心管中 , 加入 15 mL预热至 65℃的 2×
CTAB提取缓冲液 (100 mmo l /L Tris-HC l, pH 8.0 , 2%CTAB , 2%PVP, 10 mmo l /L EDTA , 0.2% β -
巯基乙醇), 65℃水浴保温 1 ～ 2 h, 其间倒转离心管数次 , 取出离心管冷却至室温。加入等体积氯仿
/异戊醇 (24 /1)混匀 , 3 500 r /m in离心 12 m in。取上清液加入 1 /10体积的 10%的 CTAB, 轻摇混
匀 , 加等体积氯仿 /异戊醇 (24 /1)混匀 , 3 500 r /m in离心 12 m in, 取上清液加 0.6倍体积的异丙
醇 , 沉淀 DNA , 用针头勾出 DNA沉淀 , 用 70%乙醇冲洗 2 ～ 3次。空气中干燥后用 TE溶解备用〔11〕。
1.3　RAPD扩增反应
利用上海生工生物工程公司生产的 50个 10聚体随机引物对材料进行扩增筛选 , 共筛选出谱带清
晰的引物 36个。反应在 PTC-220型 PCR仪上进行 。反应总体积 25 μL, 含 20 ～ 30 ng模板 DNA , 0.2
mmo l /L dNTPs, 1.5mmo l /L M gC l2 , 0.2 μmol /L引物 , 1 U Taq DNA聚合酶 (上海 Promega), 1 ×
PCR buffe r (10mmo l /L Tris-HC l , pH 8.3 , 5 mmo l /L KC l)。扩增程序是 94℃预变性 3 m in后进行 50
个循环扩增反应 , 每循环为 94℃变性 1 m in, 36℃复性 1m in, 72℃延伸 2m in;最后 1次为 72℃延伸
10 m in。取 20 μL扩增产物 , 与 5 μL溴酚蓝 (0.25%溴酚蓝 , 40%蔗糖水溶液 )混匀 , 点入含 0.5
μg /mL EB的 1%琼脂糖凝胶中 , 以 1×TAE缓冲液为介质在 5V /cm电场强度下电泳 1 ～ 2 h。取出凝
胶在 Amersham Phamacia B io tech公司 ImageM asterVDS凝胶成象仪上观察照相并记录。
1.4　PCR-RFLP反应
利用 7个叶绿体和 8个线粒体基因组通用引物对材料进行扩增筛选 , 结果仅 6个叶绿体引物和 3
个线粒体引物可扩增出稳定而明显的产物 , 其名称 、序列 、 扩增区域与片段大小及参考文献出处列于
表 1。引物由上海生工生物工程公司合成 。反应总体积 25 μL, 含 100 ng模板 DNA , 0.2 mmo l /L
dNTPs, 1.5 mmo l /LM gC l2 , 65 ng引物 , 1 U Taq DNA聚合酶 (上海 Promega), 1×PCR buffe r (10
mmo l /L Tris-HC l, pH 8.3, 5 mmo l /L KC l)。扩增程序是 94℃预变性 3m in;94℃变性 1 m in, 55℃复
性 1 m in, 72℃延伸 3m in, 40个循环;最后延伸温度 72℃, 10m in。
350
　2期 甘　娜等:应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR-RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性　
表 1　叶绿体和线粒体 PCR-RFLP标记引物序列及来源
Tab le 1　The prim er sequences and source for cpDNA and m tDNA PCR-RFLP markers
引物
Prim er
序列
Sequen ce
类型
Type
扩增区域
Am plif ied area
长度
Length(kb)
文献
Reference
trnL-trnR
　
5-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3
5-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3
cpDNA
　
基因及基因间区
Gen e and inter-gene region
1.0
　
〔12〕
　
trnT-trnL
　
5-CATTACAAATGCGATGCTCT-3
5-TCTACCGATTTCGCCATATC-3
cpDNA
　
基因及基因间区
Gen e and inter-gene region
0.8
　
〔12〕
　
trnD-trnT
　
5-ACCAATTGAACTACAATCCC-3
5-CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3
cpDNA
　
基因及基因间区 ,含 trnE和 trnY基因
Gen e and inter-gene region, includ ing trnE and trnY
1.2
　
〔13〕
　
trnH-trnK
　
5-ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3
5-CCGACTAGTTCCGGGTTCGA
cpDNA
　
基因及基因间区 ,含 psbA基因
Gen e and inter-gene region, includ ing psbA
1.8
　
〔13〕
　
trnS-trn Mf
　
5-GAGAGAGAGGGATTCGAACC-3
5-CATAACCTTGAGGTCACGGG-3
cpDNA
　
基因及基因间区 ,含 ycf 9和 trnG基因
Gen e and inter-gene region, includ ing ycf 9 and trnG
1.3
　
〔13〕
　
trnS-psbC
　
5-GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3’
5-GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3’
cpDNA
　
基因及基因间区
Gen e and inter-gene region
1.5
　
〔14〕
　
nad 1B-
nad 1C
5-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3
5-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3
m tDNA
　
基因及基因间区
Gen e and inter-gene region
1.2
　
〔13〕
　
18S-5S
rRNA
5-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3
5-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3
m tDNA
　
基因及基因间区
Gen e and inter-gene region
1.2
　
〔13〕
　
cox1
　
5-CTAACCACAAGGATATTGGGAC-3
5-AGTTCTCCAAAAGTATGAAAGGC-3
m tDNA
　
基因
Gen e
1.5 〔15〕
　
在扩增产物中加入 1 U的限制性内切酶 Hin fⅠ 、 EcoRⅠ 、 Hind Ⅲ 、 BamHⅠ 、 EcoR321、 B suR1、
EcoR881和 Hpa ll, 37℃酶解 1 h。然后在含有 0.5% EB的 2%琼脂糖凝胶电泳分离中以 1×TAE缓冲
液为介质电泳。以 5V /cm的电压电泳 2 ～ 3 h后 , 用 Am ersham Pham aciaB io tech公司 ImageM asterVDS
凝胶成像仪上观察 、 成像并记录。
1.5　数据分析
扩增产物按有带记为 1, 无带记为 0, 计算材料间遗传相似系数 (GS)〔16〕。根据 GS值或遗传距
离 (1-GS)按不加权成对群算术平均法 (UPGMA , unw eigh ted pair group me thod w ith arithme ticmeans
cluster analysis)进行遗传相似性聚类 。统计分析在 NTSYS-PC软件系统下进行 。
2　结果与分析
2.1　RAPD结果与分析
2.1.1　扩增片段多态性　RAPD扩增结果表明 , 36个引物的扩增产物均能揭示材料间多态性 , 其中
图 1为引物 OPB-8的扩增结果 。 36个引物共得到 214条扩增 DNA片段 (表 2), 平均每个引物能产生
5.9条 , 其中 199条 (93.0%)具多态性。不同引物的扩增带数变幅从 2条到 10条不等 , 长度大小
为 200 ～ 3 000 bp。
图 1　RAPD引物 OPB-8对 20份大花蕙兰材料基因组 DNA的扩增图谱
1 ～ 20:材料序号同图 2, M:PUC19 M/ SP DNA m ark er。下同。
F ig. 1　The genom ic fing erprints of 20 Cymbidium accessions am plified w ith prim erOPB-8 in RAPD ana ly sis
1 - 20:The accession num ber as in F ig. 2, M:PUC19 M/ SP DNA marker. The sam e below.
351
园　　艺　　学　　报 33卷
表 2　RAPD随机引物序列及其扩增结果
Table 2　The sequences o f 36 random prim ers and their amp lifica tion results
引物
Prim ers
序列(5-3)
S equences(5-3)
条带总数
Tota lb ands
多态性条带
Polym orphic bands
引物
P rimers
序列(5-3)
S equences(5-3)
条带总数
Total band s
多态性条带
Po lym orph ic bands
OPB1 GTTTCGCTCC 6 6 OPH 18 GAATCGGCCA 　 7 　 7
OPB3 CATCCCCCTG 5 5 OPH 19 CTGACCAGCC 　 4 　 4
OPB4 GGACTGGAGT 4 4 OPH 20 GGGAGACATC 11 11
OPB5 TGCTCTGCCC 2 1 OPP1 GTAGCACTCC 　 6 　 6
OPB7 GGTGACGCAG 8 8 OPP2 TCGGCACGCA 　 6 　 5
OPB8 GTCCACACGG 5 4 OPP3 CTGATACGCC 　 8 　 8
OPH 3 AGACGTCCAC 8 8 OPP4 GTGTCTCAGG 10 　 9
OPH 4 GGAAGTCGCC 9 9 OPP5 CCCCGGTAAC 　 7 　 7
OPH 5 AGTCGTCCCC 5 5 OPP6 GTGGGCTGAC 　 5 　 5
OPH 7 CTGCATCGTG 10 10 OPP7 GTCCATGCCA 　 3 　 2
OPH 9 TGTAGCTGGG 4 4 OPP8 ACATCGCCCA 　 3 　 3
OPH 10 CCTACGTCAG 6 6 OPP9 GTGGTCCGCA 　 6 　 5
OPH 11 CTTCCGCAGT 8 8 OPP14 CCAGCCGAAC 　 4 　 4
OPH 12 ACGCGCATGT 6 5 OPP15 GGAAGCCAAC 　 4 　 3
OPH 14 ACCAGGTTGG 2 2 OPP16 CCAAGCTGCC 　 7 　 7
OPH 15 AATGGCGCAG 6 5 OPP17 TGACCCGCCT 10 10
OPH 16 TCTCAGCTGG 5 4 OPP18 GGCTTGGCCT 　 4 　 2
OPH 17 CACTCTCCTC 3 1 OPP19 GGGAAGGACA 　 6 　 5
合计 Total 214 199
2.1.2　遗传相似系数　36条 RAPD引物所扩增出的 214条 DNA条带均用于计算大花蕙兰 20个品种
间的遗传相似系数 (GS)。结果表明 , GS值变化范围为 0.503 ～ 0.765, 平均值为 0.598。其中 ‘幸
运彩虹 ’ 和 ‘幸运霞光 ’ 遗传相似性最高 , 而 ‘璀璨 ’ 与其余 19个品种间的遗传相似性相对较低。
图 2　20份大花蕙兰材料基于 RAPD遗传相似系数聚类图
F ig. 2　The dendrog ram resu lting from RAPD based-genetic sim ilaritym atr ix in 20 Cymbid ium access ions
2.1.3　聚类分析　根据 RAPD遗传相似系数按 UPGMA法聚类生成 20个材料间的亲缘关系树状图
(图 2)。以平均遗传相似系数 0.598为阈值 , 可将其划分为 4类 。从图 2可以看出 , RAPD标记能将
所有供试的 20份材料相互区分开。其中 , ‘璀璨 ’ 与其它材料间差异较大 , 单独聚为 1类。 ‘火红天
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　2期 甘　娜等:应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR-RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性　
鹅绒 ’ 、 ‘新月 ’ 、 ‘大花维纳斯 ’ 、 ‘幸运彩虹 ’ 、 ‘幸运霞光 ’ 、 ‘杰灵 ’ 、 ‘舞蹈家 ’ 和 ‘俄尔甫斯 ’
很明显地聚为 1类。 ‘黄金小神童 ’ 、 ‘红色蜜酒 ’ 、 ‘钢琴家 ’ 、 ‘莎拉 ’ 、 ‘金色梦幻 ’ 、 ‘明月 ’ 、 ‘黄
色妖姬 ’ 和 ‘微笑鸡尾 ’ 也明显聚为 1类;而 ‘台北小姐 ’ 和 ‘月光维纳斯 ’ 则聚为另 1类。
2.2　叶绿体基因组 (cpDNA) PCR-RFLP分析
2.2.1　多态性　利用 7个叶绿体基因组 (cpDNA)的 PCR-RFLP标记对 20份大花蕙兰进行了分析 ,
其结果列于表 3。 6个引物 (占 85.7%)可扩增出 1至多条清晰谱带 (图 3, A), 利用 Hin fⅠ 、
EcoRⅠ 、 Hin dⅢ、 BamHⅠ 、 EcoR321、 B suR1、 EcoR881等 7种限制性内切酶消化后 , 6个标记的 19
种引物 /酶组合共检测到 53条 DNA片段。其中 , 多态性片段有 37条 , 占 69.8%。图 3, B为
trnL-trnR扩增产物的 EcoRⅠ酶切结果 。
图 3　引物 trnL-trnR (A) 和引物 /酶组合 trnL-trnR /EcoRⅠ (B)对 20份大花蕙兰材料基因组 DNA的扩增图谱
F ig. 3　The g enom ic fingerprints of 20 Cymb id ium access ions resul ting from trnL-trnR (A) and trnL-trnR /EcoRⅠ (B)
marker /enzym e com bination
2.2.2　遗传相似系数　利用 6个叶绿体基因组的 PCR-RFLP标记扩增产物按 Ne i的方法计算
相似系数 (GS), 20份大花蕙兰间 GS值变化范围为 0.571 ～ 0.949 , 平均值为 0. 766。其中 ‘幸运
彩虹 ’ 和 ‘金色梦幻 ’ 遗传相似性最高 , ‘舞蹈家 ’ 、 ‘杰灵 ’ 、 ‘微笑鸡尾 ’ 、 03-024与其余 16个
品种的遗传相似性相对较低 。由于叶绿体基因组 (cpDNA) PCR-RFLP分析中谱带较少 , 提供的信
息量有限 , 所以不做进一步的分析 。
353
园　　艺　　学　　报 33卷
2.3　线粒体基因组 (m tDNA) PCR-RFLP分析
2.3.1　多态性　利用 8个线粒体基因组 (m tDNA)的 PCR标记对 20份大花蕙兰进行分析 , 其结果
列于表 4。其中 , 3个引物 (占 37.5%)可扩增出 1条清晰谱带 (图 4, A)。利用 Hin fⅠ 、 EcoRⅠ 、
Hin dⅢ、 BamHⅠ 、 Hpa ll、 B suR1和 EcoR881等 7种限制性内切酶消化后 , 3个标记的 10种引物 /酶
组合共检测到 33条 DNA片段 , 其中多态性片段有 21条 (占 63.6%)。图 4, B为 18S-5S rRNA /Hpa ll
的扩增和酶切结果。
图 4　引物 18S-5S rRNA (A)和 18S-5SrRNA /Hpa ll (B) 引物 /酶组合对 20份大花蕙兰材料基因组 DNA的扩增图谱
F ig. 4　The genom ic fingerprints of 20 Cymb id ium access ions resulted from 18S-5SrRNA (A) and 18S-5SrRNA /Hpa ll
(B) m arker /enzym e comb ina tion
2.3.2　遗传相似系数　利用 3个线粒体基因组的 PCR-RFLP标记扩增产物按 Ne i (1979)的方
法计算相似系数 (GS), 20份大花蕙兰间 GS值变化范围为 0.634 ～ 1.000, 平均值为 0.829。其中
‘火红天鹅绒 ’ 和 ‘新月 ’ 间遗传相似性最高 , 而 ‘璀璨 ’ 与其它 19个材料的遗传相似性相对较
低 。由于线粒体基因组 (m tDNA) PCR-RFLP分析中谱带较少 , 提供的信息量有限 , 所以不做进一
步的分析。
3　讨论
从遗传距离来看 , RAPD标记揭示的材料间的多态性高于叶绿体基因组 (cpDNA) PCR-RFLP
标记 , 而叶绿体基因组 (cpDNA) PCR-RFLP标记又高于线粒体基因组 (m tDNA) PCR-RFLP标
记 。这说明大花蕙兰的叶绿体和线粒体基因组比较保守 , 遗传多样性较低 , 不能作为聚类分析的
依据 。
RAPD遗传相似系数划分的类群将 ‘璀璨 ’ 单独聚为 1类 。 ‘璀璨 ’ 花深绿红心 , 属于绿花系品
种 。 RAPD遗传相似系数划分的类群也将 ‘舞蹈家 ’ 、 ‘幸运霞光 ’ 、 ‘俄尔甫斯 ’ 、 03-024和 ‘火红天
鹅绒 ’ 聚为 1类 。它们都是红花系品种 , 且除 ‘火红天鹅绒 ’ 外都是 12月至翌年 2月 (早花型)的
354
　2期 甘　娜等:应用 RAPD标记和细胞质基因组 PCR-RFLP技术研究大花蕙兰的遗传多样性　
粉红色大花型品种。这些结果说明此标记划分的类群同花色 、 花期和花朵类型有一定的关系。但是 ,
RAPD标记都没有将 ‘莎拉 ’ 和 ‘璀璨 ’ 这两个垂吊品种单独聚为 1类。同时 , RAPD标记也没有将
芳香的品种 ‘黄金小神童 ’ 、 ‘台北小姐 ’ 、 ‘红色蜜酒 ’ 和 ‘璀璨 ’ 单独聚为 1类。这表明根据遗传
相似系数划分的类群与大花惠兰的直立型和垂吊型没有直接联系 , 与其是否具有花香也没有直接联
系 。
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