全 文 ：第 32卷 第 4期 生 态 科 学 32(4): 447-452
2013年 7月 Ecological Science July. 2013
收稿日期：2012-12-15收稿；2013-06-12接受
基金项目：国家科技支撑计划课题(2012BAC07B05，2012BAD18B01)和暨南大学重点培育项目(21612106)资助
作者简介：钟钰（1988—），女，硕士研究生，Email：zhongyu96@hotmail.com
*通讯作者：杨宇峰，教授，Email：tyyf@jnu.edu.cn
钟钰，陈填烽，郑文杰, 杨宇峰. 裂片石莼水提物清除 ABTS和 DPPH自由基的光谱学研究[J]. 生态科学, 2013, 32(4): 447-452.
ZHONG Yu, CHEN Tian-feng, ZHENG Wen-jie, YANG Yu-feng. Spectrometric investigation of DPPH and ABTS free
radical-scavenging of Ulva lacyuca L. aqueous extracts[J]. Ecological Science, 2013, 32(4): 447-452.
裂片石莼水提物清除ABTS和DPPH自由基的光谱学研
究
钟钰 1,3，陈填烽 2，郑文杰 2, 杨宇峰 1,3*
1. 暨南大学水生生物中心, 广州 510632
2. 暨南大学化学系，广州 510632
3. 水体富营养化与赤潮防治广东省教育厅重点实验室，广州 510632
【摘要】 研究了大型海藻裂片石莼和富硒裂片石莼水提物清除 2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）及 1,1-
二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力及其光谱学特征。分光光度计法测定，水提物 ABTS 自由基体系测定波长为 734 nm,
体系稳定时间为 6 min；DPPH 自由基体系测定波长为 515 nm，体系稳定时间为 30 min。结果表明，裂片石莼水提物具有良
好的抗氧化活性，能有效、快速地抑制溶液中 ABTS 和 DPPH 自由基。在优化选择的反应体系中，裂片石莼、富硒裂片石莼
和标准抗氧化剂 VC 对 ABTS 自由基的半数抑制浓度（IC50）分别为 76.40 μg/ml、54.11 μg/ml 和 60.69 μg/ml，说明富硒裂
片石莼水提取的总抗氧化活性明显优于 VC，富硒培养可以显著提高裂片石莼的抗氧化活性。裂片石莼、高硒裂片石莼和标准
抗氧化剂 VC 对 DPPH 自由基的 IC50 值分别为 123.29 μg/ml、 76.825 μg/ml 和 24.787 μg/ml。综合上述，富硒培养裂片石
莼水提物具有优良的抗氧化活性，对水溶性自由基的抑制率明显高于脂溶性自由基，有广阔的开发前景。
关键词：石莼； 硒； 抗氧化活性； ABTS； DPPH
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2013.04.007 中图分类号：Q945.78 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2013)04-447-06
Spectrometric investigation of DPPH and ABTS free radical-scavenging of Ulva
lacyuca L. aqueous extracts
ZHONG Yu1,3, CHEN Tian-feng2, ZHENG Wen-jie2, YANG Yu-feng1,3*
1. Department of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2. Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China
3. Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful Algal Blooms of Guangdong Higher Education Institutes,
Guangzhou 510632, China
Abstract: The antioxidant activities of Ulva lacyuca L. aqueous extracts against DPPH and ABTS free radicals were evaluated using
spectrometric methods. The results showed that the detection wavelength and stable time for ABTS system were 734 nm and 6 min
respectively, while those for DPPH system were 515 nm and 30 min, respectively. The extracts effectively and rapidly removed ABTS
and DPPH free radicals, and showed a dose- and time-dependent manner, indicating the potent antioxidant activities under both
hydrophilic and hydrophobic conditions. Under the optimized systems, the IC50 values for Se-PPC, PPC and VC against ABTS free
radical were 76.40, 54.11 and 60.69 μg/ml, respectively. Se-PPC exhibited significantly higher activities than the VC. For DPPH free
radicals, the IC50 values of Se-PPC, PPC and VC were 123.29, 76.83 and 24.79 μg/ml, respectively. Our results suggest
selenium-enrichment cultured U. lacyuca L. has potential value of applications to be functional food with antioxidation.
Key words: Ulva lacyuca L.; aqueous extracts; antioxidant activity; ABTS; DPPH
生 态 科 学 Ecological Science 32卷 448
1 引言 (Introduction)
硒（Se）是一种非常重要的微量元素，从生态毒
理学的角度来看，其在狭窄的浓度范围之间存在着对
人类和动物健康的必要性和毒性双重作用[1,2]。硒缺
乏和毒性在全球范围发生，取决于环境中硒的背景值
和可利用性[3]。一般认为，有机硒比无机硒更利于人
体吸收，在硒缺乏地区，富硒生物制品如大蒜、酵母
和乳酸菌等已被广泛生产与使用[4]。已有研究表明，
硒具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗高血压、降血糖等
生物活性 [5,6]。生物体内的谷胱甘肽过氧化物酶
（GPX）是体内的重要抗氧化物酶[7]，它能阻止自由
基和氧化物的形成，而硒是 GPX 的必须成分和活性
中心。
海洋是天然药物的重要来源，由于特殊的生态
环境，海藻含有特殊的作用和生物活性物质，海藻活
性物质的研究已成为现代海洋生物学研究的重要部
分[8]。裂片石莼(Ulva lacyuca L.)，属绿藻门、绿藻纲、
石莼目、石莼科、石莼属。据《本草纲目》记载，石
莼具有软坚散结、清热解毒、利水降脂等功效[9]。藻
类是富集转化硒的理想载体，通过藻细胞对无机硒的
吸收和转化，可获得富含有机硒的大型海藻[10]，并
显示出硒与藻类活性组分的协同作用[11-14]。一些大型
海藻如石莼等，可以作为人类和动物的食物补充，并
被认为是一种富含天然抗氧化剂的重要来源[15-18] 。
自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类具
有强氧化活性的带负电的物质,由于具有未配对的电
子,其化学性质相当活跃,易对机体组织细胞产生迅速
而强烈的损伤,与机体的许多功能障碍、疾病和衰老
密切相关[19]。本文以人体内常见自由基 2,2’-连氮基-
双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）及 1,1-
二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为对象，研究了石莼
及高硒石莼水提物对两种自由基的清除作用及抗氧
化功能，为石莼活性物质进一步开发利用提供科学依
据。
2 材料与方法 (Materials and methods)
2.1 仪器和试剂
UV-3600 紫 外 - 可 见 分 光 光 度 计 , 日 本
SHIMADZU 公司； BP301S 电子天平 , 德 国
Sartorious 公 司 ： VC 化 合 物 ； ABTS(2,
2 ’2-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid) 与
DPPH（1,1-dipheny1-2-picryhydr）均购自 Sigma 公司。
石莼采自南澳海域，由汕头大学丁兰平教授鉴定。
2.2 石莼活性物质的提取
取裂片石莼样品洗净、晾干至恒重。准确称取 5
g 样品，碾碎后加入 100 mL去离子水，超声破碎后，
水浴提取 12 h，透析 24 h 后冷冻干燥后得到粉末备
用。所得样品用红外光谱在 500-4 000 cm-1 范围内进
行扫描。
2.3 ABTS自由基清除实验
配制ABTS 储液：用 pH 7.4 的 PBS 溶解
ABTS 配制成 5 mmol/L 的 ABTS 储液，与 MnO2
反应后用 0.2 μm 的PVDF 膜过滤，用 PBS（pH 7.4）
稀释，使其吸光值在 734 nm 处为 0.70±0.02，-20 ℃
保存备用。测定：在 10 mL比色管中加入 50 μL 不
同浓度的样品待测液，再加入 3 ml 的ABTS 反应溶
液，振荡 30 s，于室温下避光静置 6 min，测定反应
溶液在 734 nm 波长处的吸光值，并扫描 UV-Vis
光谱[20]。
2.4 DPPH 自由基清除实验
配制 DPPH 储液：用甲醇溶解 DPPH 粉末，
配制成 6 mmol /L 储备液，- 20 ℃保存备用，使用液
用甲醇稀释至 60 μmol /L，现用现配 。测定：在 10
mL比色管中加入 50 μL 不同浓度的样品，再加入 3
mL的 60 μmol/L 的 DPPH 使用液, 振荡 30s，于室
温下避光静置 30 min，测定反应溶液在 515 nm 波
长处的吸光值, 并扫描 UV-Vis 光谱[21]。
ABTS 自由基清除率( I %) = (1 - AS/ A0 ) ×100 %
（1）
DPPH 自由基清除率( I %) = (1 - AS/ A0 ) ×100 %
（2）
其中 AS 为样品管的吸光值；A0 为对照管的吸
光值。
实验重复操作3 次，取平均值并计算标注误差。
2.5 半数抑制率( IC50 ) 的计算
以样品的浓度对自由基清除率作图并进行线性
拟合，并计算 IC50 值，其中， IC50 值定义为清除
率为50 %时石莼水提物的浓度。
2.6 统计分析
采用SPSS 13.0 软件进行统计学处理, P < 0.05
4期 钟钰，等. 裂片石莼水提物清除 ABTS 和 DPPH 自由基的光谱学研究 449
为显著水平；Origin 8.0 作图。
3 结果与分析 (Result and Analyse)
3.1 DPPH 和 ABTS 反应体系吸收光谱及测定波长
的确定
用红外光谱将石莼水提物在500-4 000 cm-1范围
内进行扫描，结果如图1所示。石莼水提物的红外光
谱的主要吸收峰在3 420-3 500 cm-1之间（O-H伸缩振
动）和1 210-1 260 cm-1（S=O伸缩振动）。富硒石莼
水提物羟基峰从3 462 cm-1移至 3 427 cm-1并且在
750 cm-1 形成新的振动峰。由此推断无机硒可能通过
与巯基或磺酸基作用在石莼体内实现无机硒到有机
硒的转换[20]。
图 1 普通石莼（a）和富硒石莼（b）的 FT-IR 分析
Fig. 1 FT-IR analysis of PPC (a) and Se-PPC (b)
由Miller等建立的ABTS自由基清除法因具有快
速、简单、灵敏和直接等优点，被广泛应用于生物样
品的总抗氧化能力测定［20］。ABTS经氧化后生成相
对稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基。抗氧化剂与
ABTS自由基反应后使其溶液褪色, 特征吸光值降
低。溶液褪色越明显则表明所检测物质的总抗氧化能
力越强。对ABTS溶液进行UV-Vis光谱扫描，发现
ABTS溶液在415和734 nm处出现特征吸收峰（图2a）。
加入石莼水提物后，415 nm处的吸收峰受到石莼水提
物吸收峰的干扰，而 734 nm处的吸收峰则呈剂量效
应降低，线性关系良好(图3),由此可推断，734 nm
处吸收峰的变化归功于石莼水提物对自由基的清除，
因此，本研究选择734 nm作为判断ABTS自由基清除的
检测波长。
在有机溶剂中DPPH是一种稳定的自由基，其醇
溶液呈紫色，因其具有单一电子，故能接受一个电子
或氢离子。对DPPH 溶液进行 UV-Vis 光谱扫描,在
波长为 515 nm 下具有最大吸收。有自由基清除剂存
在时，DPPH 的单电子被捕捉而使其颜色变浅形成无
色产物，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降
程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性增
加，从而可评价试验样品的抗氧化能力[23]。抗氧化
能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。
本研究对 DPPH 自由基溶液和石莼水提物甲醇溶液
进行 UV-Vis 光谱扫描。结果如图 2 所示, DPPH
溶液在 515 nm 处出现特征吸收峰, 而石莼水提物
在 450 nm 以上范围没有吸收峰, 说明石莼水提物
自身不会对反应测定造成干扰。加入石莼水提物后，
DPPH 在 515 nm 处的吸收峰呈剂量效应的降低,
且线性关系良好（图4）,因此本研究选择 515 nm 作
DPPH 自由基清除实验的检测波长。
图 2 DPPH和ABTS的吸收光谱（a），普通石莼和富硒石莼
水提物的吸收光谱（b）
Fig. 2 Absorbance spectra of DPPH and ABTS (a), and
aqueous extracts of PPC and Se-PPC( b )
图 3 添加普通石莼和富硒石莼水提物后 ABTS 吸收光谱的
变化
Fig. 3 Changes in absorbance spectra of ABTS with addition
of aqueous extracts of PPC and Se-PPC
3.2 ABTS 和 DPPH 体系的反应动力学研究
在 ABTS 和 DPPH 自由基清除实验中，对于
不同的待测抗氧化剂，体系反应稳定时间的确定是一
个关键影响因素[22]。为了解所采用的ABTS和DPPH
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
ppc
Se-ppc
3462
3427
520
1250
a
b
Wave number ( cm-1 )
Ab
so
rb
an
ce
200 400 600 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
ABTS
DPPH
200 400 600 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
PPC
Se-PPC
a b
Wavelength/nm Wavelength/nm
A
bs
or
ba
nc
e
A
bs
or
ba
nc
e
400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
control
1ug/ml
2ug/ml
4ug/ml
400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
control
1ug/ml
2ug/ml
4ug/ml
PPC Se-PPC
Wavelength/nm Wavelength/nm
A
bs
or
ba
nc
e
A
bs
or
ba
nc
e
生 态 科 学 Ecological Science 32卷 450
图 4 添加普通石莼和富硒石莼水提物后 DPPH 吸收光谱的
变化
Fig. 4 Changes in absorbance spectra of DPPH with addition
of aqueous extracts of PPC and Se-PPC
体系的反应动力学特性，本文研究了ABTS和DPPH
自由基溶液在加入不同抗氧化剂（包括石莼水提取和
VC）后吸光值随时间变化的规律。在ABTS自由基溶
液中分别加入4种不同浓度石莼水提物样品(终质量
浓度为3.125，6.25，12.5，25，50和100 μg·mL- 1)和
VC(终质量浓度为3.125，6.25，12.5，25，50和100
μg·mL- 1)后, 体系的特征吸收峰A734在60 s内显著下
降，6 min后，体系基本趋于平衡，达到稳定状态（图
5），表明6 min适用于ABST与抗氧化之间剂量效应
的表征。对于DPPH体系，在60 μmol·L–1DPPH甲醇溶
液中分别加入4种不同浓度石莼水提物样品(终质量
浓度为3.125，6.25，12.5，25，50和100 μg·mL-1)和
VC(终质量浓度3.125，6.25，12.5，25，50和100 μg· mL-
1)后, 体系的特征吸收峰A515在 5 min内显著下降，5
min后，体系基本趋于平衡，至30 min时，A515达到
稳定状态（图6），表明30 min适用于DPPH与抗氧化
之间剂量效应的表征。
3.3 抗氧化剂清除ABTS和DPPH自由基的剂量效应
及其评价
根据上实验确定的测定波长和反应时间，测定一
系列浓度(倍比稀释)的石莼、高硒石莼水提物和VC
对ABTS和DPPH自由基的清除率，计算不同抗氧化
剂的IC50值，并对其抗氧化活性进行对比评价。对于
ABTS(图7）和DPPH（图8）反应体系，在0-100 μg/ml
的质量浓度范围内，石莼水提取和VC对自由基清除
率有良好的线性关系, 据此可计算其IC50值。
如图7、8所示，在确定的反应体系中，裂片石莼、
高硒裂片石莼和标准抗氧化剂VC对ABTS自由基的
图 5 添加 VC、普通石莼和富硒石莼水提物后， ABTS 体
系在 A734 特征吸收峰的吸光率变化
Fig. 5 Changes in absorbance of ABTS (A734) with addition of
aqueous extracts of PPC, Se-PPC and VC.
图 6 添加 VC、普通石莼和富硒石莼水提物后， DPPH 体
系在 A515 特征吸收峰的吸光率变化
Fig. 6 Changes in absorbance of DPPH (A515) with addition of
aqueous extracts of PPC, Se-PPC and VC
半数抑制浓度（IC50）分别为 76.40 μg/mL，54.11
μg/mL和 60.69 μg/mL，说明石莼水提物具有良好的
总抗氧化活性，且富硒培养后显著提高了石莼水提物
的活性（P<0.05）。对于 DPPH自由基，石莼、富硒
培养石莼和VC的 IC50值分别为123.98 μg/mL、77.102
μg/mL和 24.64 μg/mL，说明石莼水提物对脂溶性自
由基也有一定作用。植物有机硒作为安全有效的硒补
200 300 400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
control
1ug/ml
2ug/ml
4ug/ml
200 300 400 500 600 700 800
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
control
1ug/ml
2ug/ml
4ug/ml
PPC Se-PPC
Wavelength/nm Wavelength/nm
A
b
so
rb
an
ce
A
b
so
rb
an
ce
0 1 2 3 4 5 6
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30 PPC
0 1 2 3 4 5 6
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Se-PPC
0 1 2 3 4 5 6
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30 VC
Time/min
A
73
4
Time/min
Time/min
A
73
4
A
73
4
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5 PPC
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5 Se-PPC
0 5 10 15 20 25 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5 VC
Time/min
Time/min Time/min
A
51
5
A
51
5
A
51
5
4期 钟钰，等. 裂片石莼水提物清除 ABTS 和 DPPH 自由基的光谱学研究 451
充剂，由于在天然生长的植物体中含量低，且硒化合
物不稳定等因素，天然的植物有机硒补充剂很少。裂
片石莼能够有效富集硒元素，且高硒裂片石莼水提物
具有优良的抗氧化活性，作为功能食品有广阔的开发
和应用前景。
图 7 普通石莼、富硒石莼水提物和 VC 对 ABTS 自由基清
除能力的线性关系
Fig. 7 Dose-dependent inhibitions of PPC, Se-PPC and VC on
ABTS free radicals and their linearity correlation
图 8普通石莼、富硒石莼水提物和 VC对 DPPH 自由基清除
能力的线性关系
Fig. 8 Dose-dependent inhibitions of PPC, Se-PPC and VC on
DPPH free radicals and their linearity correlation
5 结论 (Conclusions)
1、采用分光光度法测定石莼水提物清除ABTS
自由基的测定波长为734 nm，体系稳定时间为6 min；
清除DPPH自由基的测定波长为515 nm，体系稳定时
间为30 min。
2、裂片石莼、富硒裂片石莼和VC对ABTS自由
基的IC50分别为76.40 μg/mL，54.11 μg/mL和60.69
μg/mL；对DPPH自由基的IC50分别为123.29 μg/mL，
76.825 μg/mL和24.787 μg/mL。石莼水提物具有良好
的抗氧化活性,富硒培养后显著提高了石莼水提物的
活性，且对水溶性自由基(ABTS)的抑制率明显高于
脂溶性自由基(DPPH)。
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0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
PPC Se-PPC VC
y = 0.6749x – 1.565
R2 = 0.9964
y = 0.821x + 5.5745
R2 = 0.9881
y = 0.8524x – 1.737
R2 = 0.9985
Concentration/(μmol·L-1)
In
h
ib
it
io
n
/%
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
PPC Se-PPC VC
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
y = 0.4017x + 0.4964
R2 = 0.994
y = 0.6669x – 1.2842
R2 = 0.9984
y = 1.9652x + 2.3845
R2 = 0.9938
Concentration/(μmol·L-1)
In
h
ib
it
io
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生 态 科 学 Ecological Science 32卷 452
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