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珊瑚藻提取物对食用菌病菌及杂菌的抗菌活性



全 文 :云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University,2011,26 (4) :583 - 587 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 - 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2010 - 03 - 02 修回日期:2010 - 10 - 28 网络出版时间:2011 - 07 - 11 10:59
* 基金项目:福建省科技厅重点项目 (2005N036)。
作者简介:欧阳桐娇 (1963 -) ,女,福建平潭人,副研究员,主要从事活性天然产物研究。E-mail:lforesty@ so-
hu. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20110711. 1059. 201104. 583_053. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 - 390X (n). 2011. 04. 028
珊瑚藻提取物对食用菌病菌及杂菌的抗菌活性*
欧阳桐娇1,林 勇2,刘艳如3,郑 怡3,张 迪2
(1. 福建省农业科学院 生物技术研究所,福建 福州 350003;
2. 福建省农业科学院 食用菌研究所,福建 福州 350014;3. 福建师范大学 生命科学学院,福建 福州 350108)
摘要:对珊瑚藻乙醇提取物的抗菌活性进行初步研究,测定了其对圆弧青霉、绿色木霉、黑曲霉菌丝生长的
抑制作用。结果表明,浓度为 0. 001 g /mL的珊瑚藻乙酸乙酯相 Rf 0. 00 条带 48 h 的抑制率最低,为 11. 4%;
浓度为 0. 01 g /mL的珊瑚藻 Rf 0. 92 条带部分对圆弧青霉 96 h抑制率最高,达到了 86. 0%。GC-MS分析表明,
珊瑚藻乙醇提取物成分以酯类为主。
关键词:珊瑚藻;抗菌活性;食用菌;病菌及杂菌
中图分类号:S 767. 16 文献标识码:A 文章编号:1004 - 390X (2011)04 - 0583 - 05
Inhibition Effect of Extract from Corallina officinalis
on Competitive Fungi in Edible Mushroom
OUYANG Tong-jiao1,LIN Yong2,LIU Yan-ru3 ZHENG Yi3,ZHANG Di2
(1. Biotechnological Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350003,China;
2. Institute of Edible Fungi,Fujian Academy of Agricutural Sciences,Fuzhou 350014,China;
3. College of life sciences,Fujian normal university,Fuzhou 350108,China)
Abstract:The preliminary research focus on the antibiotic active of extracts from Corallina officinalis,
the hypha growth inhibitions on competive fungi,Penicillium cyclopium,Trichoderma viride and,As-
pergillus niger were evaluated. The results indicated that ethanol extract of Corallina officinalis con-
tained antimicrobial active substances. Specifically,the highest inhibition rate to Penicillium cyclopi-
um achieved 86. 0% (Rf 0. 92 0. 010g /mL)in 96 h. Further,result of GC-MS analysis showed that
ethanol extract of Corallina officinalis is dominated by esters.
Key words:Corallina officinalis;antibiotic active;edible fungi;competitive fungi
目前有关珊瑚藻提取物活性的研究较少,主
要在微藻抑制方面,例如王仁君和唐学玺等人对
珊瑚藻的水提取物和甲醇提取物抑制东海原甲藻
(Prorocentrum donghaiense)的活性进行了研究,
具体研究了珊瑚藻对赤潮异弯藻的化感效应,并
初步提取、分离了对赤潮异弯藻具有抑制作用的
化感物质[1]。有关珊瑚藻的抗食用菌病菌的研究
少见报道,本文对珊瑚藻的乙醇提取物抗食用菌
病菌及杂菌的抑菌活性进行了初步研究。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 海藻种类
珊瑚藻 (Corallina officinalis) ,采自福建省平
潭县海岩滩上,海藻鉴定由福建师范大学郑怡教
授负责。
1. 1. 2 受试菌
圆弧青霉 (Penicillium cyclopium)、绿色木霉
(Trichoderma viride)、黑曲霉 (Aspergillus niger)
由福建农林大学植保学院许文耀教授分离纯化,
荧光假单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescent)由中
国科学院微生物研究所提供。Tr. ,As.,Pe.,
Ps. 分别表示绿色木霉、黑曲霉、圆弧青霉菌、
荧光假单胞杆菌。
1. 1. 3 试剂仪器
细菌培养基:牛肉膏 3 g,蛋白胨 10 g,氯化
钠 5 g,琼脂 15 ~ 20 g,水 1 000 mL pH 7. 2 ~ 7. 4;
真菌培养基:马铃薯 200 g,蔗糖 (葡萄糖)20
g,琼脂 20 g,水,1 000 mL,pH自然。
试剂:无水乙醇,95%乙醇,乙酸乙酯,乙
醚,石油醚,苯,石油醚 ∶丙酮 (3 ∶ 1)混合液,
氯仿∶甲醇 (2∶1)混合液,2%碘溶液,以上试剂
均为分析纯 AR。薄层层析硅胶 G60 型 (化学
纯)。
仪器:高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器
有限公司;ZF-Ⅰ型三用紫外分析仪 上海顾村电
光仪器厂;安捷伦 6890 /5973n 色谱一质谱联用
仪:英国安捷伦公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 海藻样品的处理
珊瑚藻采回后,经分类鉴定后编号,挑去杂
藻,用自来水洗去样品表面的附生物、盐分等杂
质。于通风处阴干,用植物粉碎机粉碎至 40 目,
保存于干燥器中备用[1 - 9]。
1. 2. 2 提取海藻粗脂及海藻有机溶剂粗提物的
制备
准确称取真空干燥后珊瑚藻藻粉各 500 g,
分别用索氏抽提器于黑暗中用乙醚回流抽提 (50
℃水浴)72 h。蒸干溶剂,获得粗脂。计算粗脂
含量,再用乙醚溶解,配制成 0. 1 g /mL用于抗菌
实验。称取分别海藻粉末 500 g,用 2 000 mL乙酸
乙酯在 50 ℃温浴浸提 3 d,过滤,滤渣再重复提
取 3 d,合并两次的提取液,真空旋转蒸干得到黑
褐色的固体浸膏,即海藻有机溶剂粗提物,
称重[1 - 9]。
1. 2. 3 粗提物的萃取
将海藻提取物加入 10 倍体积的蒸馏水,充分
溶解悬浮后,用乙酸乙酯萃取,得到低极性的乙
酸乙酯相和高极性的水相,分别蒸干,称重[1 - 9]。
1. 2. 4 珊瑚藻提取物的薄层层析
制版:称取薄层层析硅胶 5 g,量取 15 mL质
量分数为 0. 5%的羧甲基纤维素钠,倒入研钵内
研磨 10 min,后铺板、颠板、在光线下观察,直
至薄板均匀平整为止,常温下自然风干。使用前
于烘箱中 100℃下活化 30 min。
点样分离:距离板下缘 1. 5 cm 处画上一条基
线,然后将浸提液点到基线上,重复点样,把层析
板放入层析缸,展层剂为丙酮∶石油醚 =1∶3,检视薄
层结果,计算各条带 Rf值,Rf值 =斑点中心至点样
基线距离/溶剂前缘至点样基线距离[2 -3]。
刮取各个分离带:刮取合并相同试验条件下
各个层析板的相同的条带,用乙酸乙酯浸泡,离
心去除硅胶,上清液即为各条带的组分。
1. 2. 5 珊瑚藻提取物的抗菌活性的测定
(1)真菌菌丝生长速率法
在 PDA平板表面中心接种直径 8 mm的青霉菌
饼,然后用移液枪取 20 μL药液,注射在菌饼周围。
以等量的溶剂作为对照,每处理重复 3 次。28℃恒
温培养。观测菌丝生长,测量直径,连续测量 3次,
记录数据。按慕立义[6]的方法计算抑制率:
菌丝生长抑制率 = [1 - (处理组生长直径
-菌饼直径) / (对照组生长直径 -菌饼直径) ]
× 100%。
(2)纸片法测定抑菌活性
将蘸有药剂的圆形纸片贴于接种了菌种的培
养基平板上,同时以相应溶剂作为空白对照。在
28℃下培养,定期观察并测量抑菌圈[2 - 3]。每个
处理进行 5 个重复,抑菌圈 =处理组抑菌圈直径
-空白组抑菌圈直径,记录数据并进行统计分析。
1. 2. 6 色谱一质谱 (GC-MS)法分析薄层层析
组分的化学成分
分别用 GC - MS 仪对珊瑚藻薄层层析组分进
行分离和结构分析,GC - MS 仪系安捷伦 6890 /
5973n色质联用仪,色谱柱 HP - FFAP 毛细管柱,
程序升温 70 ~ 290℃,炉温 40 ~ 220℃,进样口温
度 250℃。质谱仪电子轰击能量 70 eV,分流进样,
分流比 20∶1,载气为氦气,进样量 1. 0 μL[7]。
2 珊瑚藻的抗菌分析和脂溶性化合物的分析
2. 1 纸片法测定提取物的抗菌活性的作用
通过圆形纸片法测定了珊瑚藻乙酸乙酯萃取相
和各个薄层层析带对几种供试菌的抑制活性,结果
如表 1所示,可以看出珊瑚藻的乙酸乙酯萃取物对
仅对假单胞杆菌和黑曲霉有抑制作用。在纸片法测
试中珊瑚藻的各个薄层条带 (浓度为 100 mg /mL)
对几种供试菌的抑制效果;Rf 0. 92 对绿色木霉有
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比较明显的抑菌效果抑菌直径达到2. 1 cm,Rf 0. 00
对绿色木霉和黑曲霉也有一定的抑制作用。
表 1 珊瑚藻乙酸乙酯相薄层层析带的抗菌活性
Tab. 1 The antibiosis activity of ethyl acetate thin
layerchromatographic analysis belt of C. officinalis cm
extract Ps. Pe. Tr. As.
Rf 0. 92 0. 00 0. 00 2. 10 0. 00
Rf 0. 83 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
Rf 0. 82 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
Rf 0. 00 0. 00 0. 00 1. 11 1. 13
粗提物 crude extract 2. 48 0. 00 0. 00 1. 23
注:粗提物指的是珊瑚藻提取物的乙酸乙酯相;0 代
表无抑菌效果。
Note:Crude Extract refers to the ethyl acetate extracts;
0 represents no inhibitory effect.
2. 2 珊瑚藻 Rf 0. 92 对 3 种供试真菌的菌丝生长
的影响
采用菌丝生长速率法测定了珊瑚藻乙酸乙
酯相的 Rf 0. 92 薄层条带对绿色木霉、黑曲霉、
圆弧青霉菌丝生长的影响,结果见表 2,从中可
以发现,珊瑚藻 Rf 0. 92 部分在较高浓度下
(10 mg /mL)对绿色木霉的抑菌效果达到 20%
左右,而在低浓度下反而起作促进菌丝生长作
用。Rf 0. 92 部分对黑曲霉作用效果要比对绿色
木霉的强,但同样表现出在高浓度下起抑制作
用,在低浓度起促进作用的规律;而 Rf 0. 92 部
分在 3 种不同的浓度下均具有抑制圆弧青霉菌
丝生长作用,在浓度 (10,5 mg /mL)时,其抑
制率达到 60%以上。
表 2 珊瑚藻 Rf 0. 92 部分对绿色木霉、黑曲霉、圆弧青霉菌丝生长的影响
Tab. 2 The antibiosis activity Rf 0. 92 substance from C. officinalis on hyphal
growth of T. viride,A. niger and P. cyclopium %
处理
treatment
处理时间 /h treatment time
48 h 96 h 144 h
Tr. As. Pe. Tr. As. Pe. Tr. As. Pe.
A1 27. 8 60. 9 93. 9 22. 7 34. 4 86. 0 11. 6 21. 0 62. 8
A2 - 5. 6 30. 4 72. 7 - 5. 0 18. 5 70. 1 - 4. 3 11. 4 65. 9
A3 - 13. 3 - 30. 4 21. 2 - 4. 5 - 6. 3 15. 0 - 2. 5 - 1. 7 6. 2
注:表中 A表示珊瑚藻 Rf 0. 92 部分;1,2,3 分别指浓度为 10,5,1 mg /mL。
Note:The A refers to Rf 0. 92 substance;1,2,3 represent the concentration of 10,5,1 mg /mL,respectively.
2. 3 珊瑚藻脂溶性化合物的分析
图 1 珊瑚藻乙酸乙酯 Rf 0. 92 成分分析:2
-丁氧基乙醇 (3. 23 53. 54)、4 -丁氧基乙酸
乙酯 (6. 13 1. 11)、1,3,5 - Triazine - 2,4,
6 (1H,3H,5H) - tri (15. 53 0. 13)、邻苯
二甲酸 1 - 2 甲基丙,2 -丁酯 (18. 17 0. 24)、
二甲氧基 2 戊烯 (22. 53 0. 28 )、2,4 二甲基
己烷 (24. 61 0. 66)、邻苯二甲酸辛酯 (25. 15
0. 24)、四甲基硫氰苯 (26. 05 0. 10)、9 - 烯
十八酮 (26. 29 0. 46)。其中 2 -丁氧基乙醇与
4 -丁氧基乙酸乙酯为其中的主要成分,提取
物的抗菌活性可能主要来源于这两种成分。
图 2 珊瑚藻乙酸乙酯 Rf 0. 00 成分分析:1,
2,4 - 丁三醇 (3. 17 27. 35 )、棕榈酸 (19. 28
36. 79)。
3 讨论
本试验通过纸片法和菌丝生长速率法,研究
了珊瑚藻提取物抗菌活性,从纸片法的结果可以
看出珊瑚藻的乙酸乙酯萃取物仅对假单胞杆菌和
黑曲霉有抑制作用;珊瑚藻的各个薄层组分对圆
弧青霉都没有效果;Rf 0. 92 部分对绿色木霉表现
出比较明显的抑菌效果,抑菌直径为 2. 0 cm;Rf
0. 00 部分对绿色木霉和黑曲霉都有一定的抑菌效
果,但是粗提物仅对黑曲霉表现出抑制作用,对
绿色木霉无抑制效果。菌丝生长抑制实验的结果
还显示,相同的薄层组份对同一供试菌在不同的
处理浓度下会表现出不同的作用效果,既有抑制
真菌菌丝生长又有促进真菌菌丝生长的,这种促
进生长的现象有可能是受试菌在低浓度药剂的逆
585第 4 期 欧阳桐娇,等:珊瑚藻提取物对食用菌病菌及杂菌的抗菌活性
境胁迫下的应激造成的。
OLESEN 等[8]的研究表明,在使用 TLC 方法
分离活性物质中能否达到高效、稳定、无破坏的
关键是在于对展层剂的选择,本试验中,对于不
同的展层剂的配比进行了试验,最后选定以丙酮∶
石油醚 = 1∶ 3 为展开剂在 G60 自制硅胶薄层板上
对珊瑚藻的乙酸乙酯萃取相进行分离,取得了较
好的分离效果。
在试验中发现珊瑚藻粗提物原本对绿色木霉
(Trichoderma viride)无抑制活性,但经过 TLC 分
离后部分组分确表现出抑制活性,而对于荧光假
单胞杆菌 (Pseudomonas fluorescent)这种情况却
恰恰相反。这和 ROBLES [10]和 ROBLES[11]等的报
道是一致的。徐年军等[9]报道运用 TLC 分离可显
示在粗提物中被屏蔽的低活性组分,这可能是由
于粗提物中一些活性物质相互拮抗或无活性物质
干扰使得其表现不出活性,而经过薄层层析分离
后这些物质相互分离,从而表现出活性。
685 云南农业大学学报 第 26 卷
[参考文献]
[1]王仁君,唐学玺,孙俊华. 小珊瑚藻对赤潮异弯藻
的化感效应 [J]. 应用生态学报,2008,19 (10) :
2322 - 2326.
[2]吕惠敏,张侃. 海藻的利用与开发 [J]. 食品科技,
1998 (6) :29 - 30.
[3]张翼,李晓明,王斌贵. 海藻生物活性物质研究的
回顾与展望 [J]. 世界科技研究与发展,2005,27
(5) :56 - 63.
[4]陈灼华,郑怡,庄惠如. 10 种红藻和褐藻抗细菌抗
真菌活性的研究 [J]. 福建师范大学学报:自然科
学版,1994,10 (4) :75 - 79.
[5]操海群,岳永德,花日茂,等. 植物源农药研究进
展 (综述) [J]. 安徽农业大学学报,2000,27 (1) :
40 - 44.
[6]慕立义. 植物化学保护研究方法 [M]. 北京:中国
农业出版社,1994:80 - 81.
[7]林雄平,郑怡,陈晓清. 三种褐藻乙醇提取物抗动
植物病原菌活性 [J]. 福建师范大学学报:自然科
学版,2005,21 (1) :112 - 116.
[8]OLESEN P E,MARETZKI A,ALMODOVAR L A. An in-
vestigation of antimicrobial substances from marine algae
[J]. Botanica Marina,1964,6 (3/4):224 -232.
[9]徐年军,范晓,韩丽君,等. 海藻乙醇提取物抗菌
活性的研究 [J]. 海洋与湖沼,2002,33 (3) :265
- 270.
[10] ROBLES - CENTENO P O,BALLANTINE D L. Dy-
namics of antibacterial activity in three species of Carib-
bean marine algae as a function of habitat and life histo-
ry [J]. Hydrobiologia,1996,326 /327:457 - 462.
[11] ROBLES - CENTENO P O,BALLANTINE D L. Effects
of culture conditions on production of antibiotically ac-
tive metabolites by the marine alga Spyridea filamentosal
(ceramiaceae,Rhodophyta)light [J]. Journal of Ap-
plied Phycology,1999,11:
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
217 - 224.
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[参考文献]
[1]谭淑豪,张卫健. 中国稻田节能减排的技术模式及其
配套政策的探讨 [J]. 科技导报,2009,27 (23) :
96 - 100.
[2] Netherlands Environmental Assessment Agency. Wikipe-
dia energy policy of China[EB /OL]. [2010 - 04 - 21].
http: / /en. wikipedia. org /wiki /Energy - policy-china.
[3]董红敏,李玉娥,陶秀萍,等. 中国农业源温室气体
排放与减排技术对策 [J]. 农业工程学报,2008,24
(10) :269 - 273.
[4]牛博英,马洪亮,史磊. 小麦免耕播种机防堵装置的
研究进展———以一年两熟地区为例 [J]. 农机化研
究,2009,31 (2) :247 - 249.
[5]张喜瑞,何进,李洪文,等. 小麦免耕播种机驱动链
式防堵装置设计 [J]. 农业机械学报,2009,40
(10) :44 - 48.
[6]张小丽,张晋国,李江国,等. 双层施肥旋耕播种机
的设计 [J]. 农业机械学报,2006,37 (11) :49
- 51.
[7]李兵,李洪文. 2BMD - 12 型小麦对行免耕播种机的
设计 [J]. 农业机械学报,2006,37 (3) :35 - 38.
[8]刘立晶,杨学军,李长荣,等. 2BMG - 24 型小麦免
耕播种机设计 [J]. 农业机械学报,2009,40
(10) :39 - 43.
[9]田斌,韩少平,吴建民. 2BMFSG - 3 /6 型固定道作
业免耕施肥播种机的设计 [J]. 农业机械学报,
2007,38 (6) :187 - 189,198.
[10]朱国辉,李问赢,何进. 2BFML - 5 型固定垄免耕播
种机设计与试验 [J]. 农业机械学报,2008,39
(2) :51 - 54,76.
[11]陈浩,黄虎,杨亚莉,等. 固定道对行小麦 /玉米通
用免耕播种机设计 [J]. 农业机械学报,2009,40
(3) :72 - 76.
[12]张佳喜,王学农,陈发,等. 秸秆粉碎还田回收机
刀辊工作参数的研究 [J]. 农业机械学报,2007,
38 (6) :82 - 85,37.
[13]姚宗路,高焕文,李洪文,等. 不同结构免耕开沟
器对土壤阻力的影响 [J]. 农机化研究,2009
(7) :30 - 34.
[14]王万钧. 农业机械化设计手册:上册 [M]. 北京:
机械工业出版社,1998:183 - 185.
[15]丁为民. 农业机械学:上册 [M] . 北京:中国农
业大学出版社,1996:78 - 80.
785第 4 期 欧阳桐娇,等:珊瑚藻提取物对食用菌病菌及杂菌的抗菌活性