全 文 ：三相静态萃取 HPLC鉴别五种贝母的研究
于海英 ,程秀民＊ ,王晓坤 ,曲　宁
(山东大学药学院 ,山东济南 250012)
　　摘要　目的:建立五种贝母药材三相静态萃取 HPLC分析方法 ,为贝母类药材鉴别提供依据。方法:采用液-
液-液三相静态萃取技术制备样品 ,以同一流动相系统 、不同的洗脱梯度对五种贝母的三个极性不同的萃取馏分分
别进行 HPLC测定 , 以中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件分析图谱。结果:三个萃取馏分的色谱图能够充分
显示各种贝母的鉴别特征 ,相似度计算结果表明五种贝母间存在着一定的差异。结论:三相萃取馏分中 , 极性萃取
馏分的 HPLC色谱图分离度好 、信息量大 、基线平稳 ,可以作为贝母药材鉴别和质量评价的依据。
关键词　三相静态萃取;HPLC;贝母;鉴别
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)02-0210-04
作者简介:于海英 ,女(1982-),山东省文登市人 ,硕士研究生;Tel:0531-88381377, E-mail:myhy12@ 163.com。＊通讯作者:程秀民 ,男 ,教授 ,硕士生导师。主要研究方向:中草药有效成分提取 、中药色谱分析;Tel:0531-88380526, E-mail:minn@sdu.edu.cn。
　　贝母为百合科贝母属多种植物的鳞茎 ,在我国
有悠久的应用历史 ,具清热化痰 、润肺止咳等功效 。
贝母的鉴别研究方法有性状鉴别法 〔1〕 、显微鉴别
法 、光谱法 〔2、3〕、DNA技术 〔4〕 、HPLC法 〔5〕 、ESI-MS
法 〔6〕等。目前 , HPLC法已成为中药鉴别的首选方
法 ,但用于贝母鉴别的报道甚少。由于贝母来源植
物种类多 、商品药材比较复杂 ,加之贝母药材化学成
分体系的复杂性和相近相似性 ,建立专属性 HPLC
鉴别方法比较困难 。本文尝试采用一种新的方
法 ———液-液-液三相静态萃取 HPLC法对贝母进行
鉴别实验 ,取得了满意的结果。
1 　仪器与试药
Agilent1100高效液相色谱仪系列(美国安捷伦
公司):G1311 A四元泵 、G1315 BDAD检测器 、G
1313A自动进样器 、G1316 A柱温箱 、G1322 A在
线脱气系统 、安捷伦化学工作站 , Ultrasonik-28 x超
声振荡器 , DZG-303 A纯水器 , AG135电子分析天
平 。
乙腈为色谱纯(美国 TEDIA公司), 水为超纯
水 ,其它试剂均为分析纯。
药材:1川贝母 BulbusFritilariaeUnibracteatae
(1000-0301)、2平贝母 BulbusFritilariaeUssuriensis
(924-200005)、3浙贝母 BulbusFritilariaeThunber-
gi(0972-9903)、 4伊贝母 BulbusFritilariaeWalu-
jewi(120929-200504)、5湖北贝母 BulbusFritilariae
Hupehensis(0962-99037),均为中国药品生物制品检
定所提供的药材对照品。
2 　方法
2.1　色谱条件　日本资生堂 C18 MGⅡ色谱柱(4.6
mm×150mm, 5μm),预柱为 C18柱 (4.0mm×3m,
5μm);流动相为水(A)和乙腈(B),对三相萃取物
分别以不同的洗脱梯度进行洗脱 ,其中中间相萃取
物梯度洗脱程序为:0※10 min, B(%)0 ～ 0, 10※20
min, B(%)0 ～ 5, 20※30 min, B(%)5 ～ 10, 40※55
min, B(%)10 ～ 10;流速:0.75 ml/min;检测波长:
260 nm、200 ～ 400 nm;柱温:30℃;进样量:20μl;分
析时间:50min。
2.2　供试品溶液的制备　取五种贝母药材样品粉
末各 100mg,精密称定 ,分别加蒸馏水 10ml,振摇 1
min,超声提取 15 min,振摇 ,离心 ,取上清液缓缓加
入事先盛有一定体积氯仿的特制直形分液漏斗中 ,
缓缓加入正已烷 ,组成(比重不同 、极性不同)三相
萃取体系 ,静置萃取 。萃取完成后进行相分离 ,得到
极性不同三个萃取馏分 ,蒸干 ,将残渣分别配制成溶
液 , 0.45μm微孔滤膜滤过 ,作为供试液 。
2.3　精密度 、稳定性和重现性试验　取 2.2项下
制备的川贝母极性馏分供试液重复进样 5次 ,比较
色谱峰(9、14、17、24号等 4个峰)的绝对保留时间 、
相对保留时间及相对峰面积 ,测得 4个峰的绝对保
留时间基本不变 、相对保留时间及相对峰面积的
RSD均分别小于 1.5%,精密度良好。
取同一川贝母样品 5份 ,按 2.2项下方法制备
供试液 ,取极性馏分供试液分别进样测定 ,测得色谱
峰(峰号同上)绝对保留时间基本不变 、相对保留时
间及相对峰面积的 RSD均小于 2.1%,表明其重复
性较好。
取 2.2项下制备的川贝母极性馏分供试液 ,于
0、4、8、16、24 h进样测定 ,测得色谱峰(峰号同上)
绝对保留时间基本不变 、相对保留时间及相对峰面
积的 RSD均小于 1.8%,表明供试液在 24h之内稳
·210· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 2期 2008年 2月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.02.017
定 。
2.4　五种贝母药材极性馏分的 HPLC图谱测定及
数据分析
2.4.1　图谱测定:按 2.2项下方法制备五种贝母
样品 ,取极性馏分供试液 ,分别进样 20μl,分析时间
50 min,记录 260nm色谱图(二维图谱)和 200 ～ 400
nm全波长色谱图(三维图谱),比较各样品色谱图
和色谱数据 。由于色谱峰和色谱数据多 ,为便于观
察 、分析 ,仅附 5 ～ 25min的图谱及数据 ,二维图谱与
数据见图 1与表 1,三维图与数据见图 2、表 2。
2.4.2　二维色谱图及数据分析:以二维图谱中分
离好 、无干扰 、较为稳定的 9号色谱峰(保留时间约
为 19.14 min)作为各自的基准 ,计算得到各色谱峰
的相对保留时间和相对峰面积值。从图 1和表 1可
以看到:5种贝母极性馏分的 HPLC色谱图的基线 ,
峰对称性和分离度良好;色谱峰的数量及保留时间
各不尽相同;保留时间相同的峰之间 、信号强度也多
有较大差异 。图 1、表 1明确显示出各药材整体特
征和量化指标(如峰高 、峰面积 、峰数等)。
2.4.3　三维色谱图及数据分析:三维图谱中的特
有峰以字母编号标示 ,非特有峰未标示 ,数据表中仅
列出特有峰的数据(保留时间 、相对保留时间 ,峰光
谱的最大吸收波长与吸收强度 、最小吸收波长与吸
收强度)。从图 2可以直观地看到五种贝母显著的
鉴别特征及其质量信息 ,如色谱峰的数量 、峰光谱的
形状与强度等 。从表 2可以看到五种贝母特有色谱
峰的数量各不尽相同 ,保留时间完全不同;峰光谱的
最大吸收和最小吸收波长以及吸收强度等均存在很
大差异。上述分析表明 ,三维图谱较二维图谱信息
量大 ,鉴别能力和质量指标的量化能力更强 ,可用于
贝母类药材专属性鉴别 。
2.4.4　相似度计算结果:采用中药色谱指纹图谱
相似度评价系统(2004 A版)软件分析五种贝母的
色谱指纹图谱 ,取共有峰 1、2、6、9、14、17、21、24进
行多点校正。因川贝母药用历史悠久且为贝母药材
出口的主要品种 〔7〕 ,所以选其为对照 ,其它四种与
之比较计算相似度 。匹配结果及相似度计算结果如
图 3、表 3 ,表明五种贝母之间存在一定的差异 。
3　讨论
3.1　实验结果显示 ,液-液-液三相静态萃取 HPLC
鉴别贝母 ,谱图质量高 ,如基线 、峰分布 、分离度及峰
对称性均较好 ,峰数也较多。表明通过三相静态萃
取达到了较佳的样品预处理效果 ,使供试品的纯度 、
成分的复杂程度以及分子的极性范围与色谱的分离
能力形成较佳匹配 ,有利于色谱的良好及绘制出能
够清晰显示药材综合质量与鉴别特征的色谱图。
图 1　　五种贝母极性馏分 HPLC图(5 ～ 25min)
·211·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 2期 2008年 2月
　　表 1 　五种贝母极性馏分二维图谱(5 ～ 25min)数据表
峰号
川贝母
相对 tR 相对 A
平贝母
相对 tR 相对 A
浙贝母
相对 tR 相对 A
伊贝母
相对 tR 相对 A
湖北贝母
相对 tR 相对 A
1 0.411 0.186 0.410 0.158 0.411 1.945 0.411 0.247 0.408 0.269
2 0.454 0.044 0.454 0.128 0.454 1.668 0.454 0.100 0.452 0.204
3 - - - - 0.505 1.099 0.498 0.100 - -
4 0.587 0.231 0.573 0.459 0.572 0.404 0.572 0.162 0.572 0.248
5 0.643 0.163 0.631 0.418 0.646 0.544 0.645 0.089 0.644 0.195
6 0.711 0.039 0.709 0.361 0.709 0.227 0.710 0.063 0.710 0.475
7 - - - - 0.808 0.138 0.802 0.051 0.799 0.126
8 0.826 0.034 0.837 0.153 - - - - 0.817 0.162
9 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
10 1.041 0.050 - - - - - - - -
11 - - - - - - - - 1.141 0.046
12 - - 1.405 0.053 - - - - - -
13 1.444 0.031 1.441 0.053 - - 1.443 0.030 1.439 0.325
14 1.480 0.123 1.473 0.360 1.479 0.909 1.478 0.117 1.475 0.861
15 1.613 0.030 1.611 0.036 1.614 0.175 1.610 0.053 1.607 0.162
16 - - - - 1.633 0.199 - - - -
17 1.656 0.600 1.655 1.100 1.660 0.739 1.655 0.466 1.651 0.670
18 1.762 0.110 1.762 0.130 - - 1.761 0.035 1.766 0.109
19 - - - - 1.766 0.181 1.803 0.015 - -
20 1.827 0.043 1.825 0.031 - - 1.826 0.016
21 1.901 0.185 1.893 0.077 1.899 0.061 1.893 0.055 1.897 0.515
22 - - 1.937 0.052 1.938 0.060 1.938 0.013 - -
23 2.023 0.130 2.021 0.070 2.027 0.323 2.021 2.289 - -
24 2.084 1.464 2.079 1.985 2.084 2.259 2.078 0.713 2.079 1.033
25 2.179 0.219 2.183 0.057 - - 2.182 0.059 2.173 0.060
峰数 18 19 17 20 17
　　表 2 　五种贝母极性馏分三维图谱(5～ 25 min)特有峰数据表
样品 峰号 tR(min) 相对 tR λmax/I(nm/mAU) λmin/I(nm/mAU) λmin/I(nm/mAU) λmin/I(nm/mAU)
川贝母 B 4.68 0.239 218/5.16 202/3.39 - -
D 12.65 0.645 270/3.66 234/2.47 - -
平贝母 A 4.44 0.226 274/5.04 238/2.81
C 10.78 0.549 258/3.38 238/2.91 240/6.81 202/3.32
H 17.75 0.873 258/3.51 246/2.79 226/4.35 204/1.87
J 20.95 1.066 270/3.80 258/3.17 250/4.12 230/2.80
浙贝母 E 13.65 0.695 274/3.07 234/3.81 - -
G 16.96 0.863 286/6.02 234/3.19 - -
I 19.87 1.011 286/11.03 234/2.71 214/4.18 202/3.72
K 21.89 1.114 274/6.15 238/2.98 210/5.44 202/4.57
伊贝母 L 21.96 1.119 258/4.21 238/3.17 - -
M 22.24 1.334 258/4.81 234/3.46 - -
湖北贝母 F 14.10 0.714 266/3.06 230/2.10 - -
·212· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 2期 2008年 2月
图 2　　五种贝母极性馏分三维图谱(5～ 25 min)
　表 3 　五川贝母极性馏分相似度计算结果
品种 川贝母 平贝母 浙贝母 伊贝母 湖北贝母
相似度 1 0.959 0.757 0.884 0.815
3.2　本文采用 DAD检测器 ,设定单波长(260 nm)
和全波长(200 ～ 400nm)同时检测 。单波长检测对
某些在该波长无吸收的成分会造成漏检和对某些成
分也会造成不能在其最大吸收波长处检出 。全波长
(三维图谱)测定则对所有具紫外吸收的成分能检
出并显示每个色谱峰的光谱图 ,利用这些信息 ,可准
确描述 5种贝母药材的共性与差异 ,为其归属做出
正确判断 ,这是二维图谱所无法比拟的。
3.3　通过对三相萃取物色谱分析 ,发现极性萃取
馏分色谱图信号多 、分离度好 ,能够代表并充分显示
图 3　　五种贝母极性馏分匹配图谱
S1.川贝母　S2.平贝母 　S3.浙贝母 　S4.伊贝母　
S5.湖北贝母
药材的鉴别特征和内在质量 ,因此选择极性馏分作
为供试品 ,所测图谱作为贝母鉴别依据 。而非极性
和弱极性萃取馏分 ,由于色谱信息量较少 ,则作为杂
质弃去。
参 考 文 献
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别贝母类中药材中的研究 .中国中药杂志 , 2005, 30
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(2007-08-06收稿)
·213·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 2期 2008年 2月