全 文 ：2016年第 2期 植物检疫 PLANT QUARANTINE Vol.30 No.2
基金项目： 科技部 “十二五” 科技支撑项目（2012BAK11B02）；国家质检总局项目（2013IK290）
* 通讯作者： E-mail： mgl@nankai.edu.cn
收稿日期： 2015-06-19
重要检疫性杂草长芒苋的分子检测
李 淼 1，2 黄国明 1 姜 一 1 张 莹 1 刘 勇 1 廖 芳 1 李明刚 2*
（1.天津出入境检验检疫局 天津 300461； 2. 南开大学生命科学学院）
长芒苋（Amaranthus palmeri）隶属苋科（Ama-
ranthaceae）苋属 （Amaranthus）异株苋亚属 （Subgen
Acnida L.），为一年生草本植物。 苋属种类繁多，加上
栽培种，世界上共约 70 种［1］，异株苋有 10 种，其雌、
雄单性花未着生于同一植株 ， 其中长芒苋 （A.
palmeri）、西部苋（A. rudis）、糙果苋（A. tubercula-
tus）、沙地苋（A. aeronicola）和瓦氏苋（A. watsonii）
危害大，为检疫性杂草。 异株苋杂草原产自北美洲
地区，2010 年以来，每年都有截获，尤其是长芒苋，
不但为我国首次截获的异株苋种类 ［2］，而且截获总
量和截获次数都尤为突出，是最具有代表性的异株
苋杂草种类。
长芒苋原产自墨西哥西北部和美国南部［3］，随着
农业的拓展和频繁的贸易往来，近年来，长芒苋引起
人们的广泛关注， 被认为是美国南方农田最棘手的
杂草之一［4］。 长芒苋适生性强，结实量大，种子细小，
传入风险大［5，6］，加之抗草甘膦的抗性特征［7］，一旦在
新的生境繁衍定殖，极难根除，会严重影响农林业生
产及生态系统，2013 年长芒苋被国家质检总局和农
业部纳入进境植物检疫性有害生物名录。因此，急需
建立一种可靠、快速的鉴定方法防止该物种传入。
目前口岸对长芒苋的检测鉴定， 主要基于种子
形态特征，然而种子细小（直径在 1 mm 左右），种间
杂交、环境等影响造成的形态特征种间近似 ［8］等原
因，难以实现准确鉴定。 长芒苋基因组较小，个体间
核型变异大，且耗时费力 ［9］，细胞学检测也很难应用
于口岸检测，随着测序技术的发展和普及，基于核酸
序列的分子检测备受关注， 位点/序列特异性 PCR
技术（sequence-specific PCR assay）具有简便快捷、
特异性强、成本低、便于推广等诸多优点，已经在包
括黄芪、鹿茸、苍术、白术等的鉴定方面得到较好应
用［10-12］，该技术的关键在于靶基因/靶序列的选择。目
前已有学者基于 ITS［13］、trnL（叶绿体基因内含子）［14］
等基因序列研究了苋属植物的系统进化； 张伟等［15］
利用颗粒结合型淀粉合成酶基因 （granule-bound
starch synthase，GBSS） 实现了对银毛龙葵的分子检
测；Park［16］利用可溶性淀粉合成酶（soluble starch syn-
thase，SSS）基因 SSSI和 GBSSI实现了两种谷物苋的
分子鉴定， 目前尚无利用淀粉合成酶基因对长芒苋
进行鉴定的报道，为此，本文利用苋属可溶性淀粉合
成酶（soluble starch synthase，SSSl）基因部分序列的
差异， 建立了长芒苋的序列特异性 PCR 检测方法，
Molecular detection of quarantine weeds Amaranthus palmeri. Li Miao1，2，Huang Guoming1，Jiang Yi1，
Zhang Ying1，Liu Yong1， Liao Fang1， LiMinggang2* （1.Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bu-
reau，Tianjin 300461，China；2.College of Life Science， Nankai University）
Abstract In order to realize effective detection of Amaranthus palmeri， a significant quarantine weed. A
method， sequence-specific PCR assay based on soluble starch synthase I gene （SSSI） in Amaranthus， is
developed for identification of Amaranthus palmeri. The results indicate that the established method is
covenient and specific， which is suitable for quarantine and identification work in the ports.
Key words dioecious Amaranthus species；Amaranthus palmeri；SSSI；molecular detection
摘要 为实现检疫性杂草长芒苋（Amaranthus palmeri）的有效检测，本研究基于苋属植物可溶性淀粉合
成酶 I基因（SSSI），建立了一种序列特异性 PCR方法，可实现从众多苋属种子中检测出长芒苋。结果显示，该
方法特异性强、简便快捷，可为口岸检疫鉴定工作提供有效的技术支持。
关键词 异株苋；长芒苋；可溶性淀粉合成酶 I基因；分子检测
中图分类号 S41-30
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实现了对长芒苋的简便、特异性检测，为口岸检疫工
作提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试种子
苋属种子来源于天津出入境检验检疫局。 共计
21 种，包括异株苋 5 种，同株苋 16 种。 供试材料的
相关情况见表 1。
1.1.2 主要试剂及仪器
PCR 缓冲液、Taq 酶、dNTP 等购自大连宝生物
公司；DNA 提取试剂盒为美国 QIAGEN 公司生产
的 DNeasy Plant Mini Kit；Tprofessional 梯度 PCR
仪为德国 Whatman Biometra 公司；Infinity-3026 凝
胶成像系统为法国 VILBER LOURMAT 公司。
1.2 方法
1.2.1 苋属种子 DNA提取
将每颗苋属种子放入 1.5 mL 离心管， 每管加
入 0.03 g 石英砂，液氮研磨，按照 QIAGEN 公司生
产的 DNA 提取试剂盒提取苋属种子 DNA， 溶于
100 μL 1×TE缓冲液中，置于 -20℃保存。
1.2.2 引物设计
针对苋属植物可溶性淀粉合成酶 I 基因——
SSSI（主要为内含子 14），自行设计了一系列引物，
对一系列苋属种子的 DNA 进行相应的扩增、 测序
及比对分析，最终利用 Primer Premier V5.0 软件设
计出长芒苋特异性引物 PALF/ PALR （参见专利申
请号 201510701508.9）；同时将苋属植物 ITS的通用
引物 ITS5/ ITS4 用于种子基因组 DNA 质量验证，
上述引物委托上海英骏生物技术有限公司合成，引
物序列见表 2。
表 1 供试材料情况
序号 拉丁名 中文名 收集年份 来源
1 Amaranthus retroflexus 反枝苋 2013 中国检验检疫科学研究院
2 A. palmeri 长芒苋 2013 美国
3 A. polygonoides 合被苋 2013 美国
4 A. viridis 皱果苋 2013 中国检验检疫科学研究院
5 A. albus 白苋 2013 美国
6 A. blitoides 北美苋 2013 美国
7 A. hybridus 绿穗苋 2013 中国检验检疫科学研究院
8 A. paniculatus 繁穗苋 2013 中国检验检疫科学研究院
9 A. blitum 野苋 2013 中国检验检疫科学研究院
10 A. deflexus - 2013 美国
11 A. standleyanus 菱叶苋 2013 美国
12 A. tamaulipensis - 2013 美国
13 A. aernicola 沙地苋 2013 美国
14 A. fimbriatus 流苏苋 2013 美国
15 A. crispus - 2013 美国
16 A. greggii - 2013 美国
17 A. powellii 鲍氏苋 2013 美国
18 A. quitensis 野生苋 2013 美国
19 A. tuberculatus 糙果苋 2013 美国
20 A. wrightii - 2013 美国
21 A. rudis 西部苋 2013 中国检验检疫科学研究院
1.2.3 DNA质量验证
利用通用引物 ITS5/ ITS4，对所提基因组 DNA
扩增，反应体系为 30 μL：10×Buffer 3.0 μL（含终浓
度为 1.5 μmmol/L MgCl2）、2.5 μmmol/L dNTPs 2.0
μL、10 μmol/L 引物 ITS5/ITS4 各为 1.0 μL、5 U/μL
Taq DNA聚合酶 0.4 μL、DNA模板 2.0 μL（约为 20
ng）、加双蒸水至 30 μL，以双蒸水为模板作为阴性
对照。 反应程序：94℃预变性 3 min；94℃变性 30 s，
58℃复性 30 s，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸
5 min。 2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色并成像观察。
表 2 所用引物序列及其参数
扩增序列 引物 序列 5′-3′ 长度 / nt 退火温度 /℃ 预期产物大小 / bp
ITS ITS5
ITS4
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC
22
20
58 750
SSSI PALF
PALR
TTATGTTTACACTGATTTCACGTCT
ACATAAAATATTACAAATCGACGCA
25
25
57 262
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2.2 长芒苋序列特异性 PCR检测方法的建立
利用长芒苋序列特异性引物 PALF/ PALR 对
21种苋属种子基因组 DNA进行扩增。结果表明，仅
长芒苋样品在 262 bp 位置左右出现条带，且条带单
一， 而其他 20种苋属样品与阴性对照均无条带，与
预期一致。说明建立的长芒苋序列特异性 PCR检测
方法特异性良好（图 2）。
1～23分别为 DL2000bp Marker、 A. palmeri、 A. aernicola、 A. tuberculatus、 A. rudis、 A. greggii、 A. deflexus、 A. standleyanus、 A. retroflexus、
A. hybridus、 A. paniculatus、 A. blitum、 A. crispus、 A. fimbriatus、 A. powellii、 A. quitensis、 A. wrightii、 A. tamaulipensis、 A. polygonoides、
A. blitoides、 A. viridis、 A. albus、 阴性对照 （双蒸水）
图 2 长芒苋序列特异性引物 PCR扩增结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
bp
2000—
1000—
750—
500—
250—
100—
1.2.4 长芒苋序列特异性 PCR检测方法的建立
利用特异引物 PALF/PALR 对 21 种苋属种子
DNA进行扩增，经优化，最终建立的扩增体系为 30μL：
10×ExTaq Buffer 3.0μL （含终浓度为 1.5mmol/L 的
MgCl2）；2.5mmol/L dNTPs为 1.0μL；5 U/μL TakaRa
ExTaq聚合酶 0.15μL；10μmol/L引物 PALF/ PALR
0.3 μL/0.3 μL；DNA模板 3.0 μL，加双蒸水至 30 μL，
以双蒸水为模板作为阴性对照。反应条件为：94℃预
变性 3 min；94℃变性 30 s，57℃复性 30 s，68℃延伸
30 s，40个循环；68℃延伸 5min。 PCR产物用 2%琼脂
糖凝胶电泳，EB染色并成像用以观察目的条带。
1.2.5 长芒苋序列特异性 PCR灵敏度测试
将苋属种子基因组 DNA 用紫外分光光度计进
行核酸浓度测定，定量为 10 ng/μL作为初始浓度，再
进行 2倍梯度稀释，共设置 6个浓度梯度，作为 PCR
扩增模板。分别以不同浓度的 DNA为模板进行 PCR
反应，阴性对照为 ddH2O，以检测引物的灵敏度。
2 结果与分析
2.1 DNA质量验证
利用通用引物 ITS5/ ITS4 对 21 种苋属种子基
因组 DNA进行扩增。 结果表明：所有种子在同一位
置均出现单一条带， 没有拖尾现象， 扩增片段约为
750 bp，而阴性对照无条带，与预期一致。 经验证，提
取的 DNA质量可靠（图 1）。
1～23 分别为 DL2000bp Marker、A. palmeri、A. aernicola、A. tuberculatus、A. rudis、A. greggii、A. deflexus、A. standleyanus、A. retroflexus、
A. hybridus、A. paniculatus、A. blitum、A. crispus、A. fimbriatus、A. powellii、A. quitensis、A. wrightii、A. tamaulipensis、A. polygonoides、
A. blitoides、A. viridis、A. albus、阴性对照（双蒸水）
图 1 苋属植物基因组 DNA通用引物 PCR扩增结果
bp
2000—
1000—
750—
500—
250—
100—
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
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2.3 长芒苋序列特异性 PCR灵敏度测试
如图 3所示，随着初始模板浓度依次降低，目的
条带逐渐减弱，长芒苋序列特异性 PCR 检测灵敏度
为 1.25 ng/μL。
3 讨论
苋属植物分子鉴定的研究相对较少， 目前分子
检测主要是利用 RAPD［17］、AFLP［18］、微卫星标记 ［19］，
ISSR［20］等分子标记技术，由于稳定性和重复性差、操
作繁琐、需结合形态学进行综合鉴定，或者需要用到
限制酶成本高等因素， 在口岸检疫中具有局限性。
位点/序列特异性 PCR 技术， 仅需要少量样品和试
剂即可完成检测，应用相对广泛，该方法常常受到靶
基因参考序列资源的制约。 对于陆生植物， 叶绿体
基因及 ITS被认为是最具竞争力的候选基因， 具有
重要参考价值， 然而本研究针对叶绿体基因 matK
和 rbcL、trnL 以及核基因 ITS 研究表明这些基因没
有适用于特异性 PCR检测的靶位点。为寻找合适的
靶基因序列， 本研究将目光转向了蛋白编码基因。
植物中的淀粉含量及支链淀粉所占比重， 可因植物
品种不同有所差异，这与淀粉合成酶基因有关，张伟
等建立的检疫性杂草银毛龙葵的 DNA 分子检测方
法，所利用的 3个 DNA区段就包括了颗粒结合型淀
粉合成酶基因（GBSS）［15］。Park利用苋属植物可溶性
淀粉合成酶（SSS）基因 SSSI和 GBSSI的序列差异所
建立的 PCR-RFLP 方法， 成功实现了谷物苋中 A.
caudatus 和 A. hypochondriacus的鉴定［16］。 因此，本
研究将 SSSI作为研究的候选靶序列。
目前苋属植物及其近似属中， 只有谷物苋（A.
cruentus）的 SSSI 基因序列是公开的，本研究自行设
计引物以及反应条件的优化，得到了 21 种苋属植物
SSSI的部分序列（主要是内含子 14）。比对和分析结
果表明：此段序列呈现较高的遗传多态性，与其他
20 种苋属植物相比， 长芒苋基因序列存在大段的
缺失以及多个差异位点。 基于此，本文设计了长芒
苋的特异性引物 ， 并建立了长芒苋序列特异性
PCR 检测方法， 该方法特异性强，21 种供试材料
中仅长芒苋出现 262 bp 左右的目的条带， 灵敏度
可达 1.25 ng/μL， 整个检测过程可在 4 h 内完成，
有效促进了货物的快速通关， 为口岸检疫鉴定工
作提供了切实可行的技术支持， 保障了我国生态
安全； 同时本研究也为其他植物种子的鉴定以及
植物 DNA条形码等研究提供了参考。
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ng/μL；8.阴性对照（双蒸水）
图 3 长芒苋序列特异性 PCR灵敏度测试结果
1 2 3 4 5 6 7 8
bp
2000—
1000—
750—
500—
250—
100—
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江苏南通口岸首次截获大量活体澳洲赤背寡妇蛛
2015年 10月， 江苏南通出入境检验检疫局检疫人员在对澳大利亚进境装载铁制托盘的集装箱进行开
箱检疫时， 发现大量蛛网和活体蜘蛛。 经检疫除害处理后， 检疫人员掏箱获得蜘蛛样本 20 余只， 送至南
通局有害生物检疫实验室鉴定后， 又由西南大学蛛形纲鉴定专家张志升教授复核， 确认为 Latrodectus
hasseltii Thorell， 1870， 中文名为赤背寡妇蛛， 这是江苏口岸首次截获， 如此多的截获数量在全国口岸也
极为罕见。
赤背寡妇蛛又名哈氏寇蛛， 隶属于蛛形纲 （Arachnoidea）， 蜘蛛目 （Araneae）， 姬蛛科 （Theridiidae），
寡妇蛛属 （Latrodectus）， 主要分布于澳大利亚、 日本、 新西兰等国家。 其主要形态特征为： 雌蛛体长约
10 mm， 雄蛛体长 4～5 mm。 额长与眼域长相等。 前后眼列平行， 侧眼分离很远， 前中眼的间距较前中侧
眼的间距短。 胸板后端尖凸， 插入第 IV 步足基节间。 腹部大， 呈椭圆形。 全身黑色， 腹部背面中央有一
醒目红色的大型叶状斑。 腹部腹面还有一个红色的沙漏形斑纹， 此为一般寡妇蛛属的主要特征之一。 卵囊
淡褐色， 表面具有许多瘤状突起， 悬挂在蛛网上。
澳洲赤背寡妇蛛虽不是检疫性有害生物， 但其体内含有剧毒， 分泌的毒液是一种强烈的神经毒素， 人
类被叮咬后可引起剧烈疼痛、 出汗、 乏力、 呕吐等症状， 如不及时治疗可致人死亡。 赤背寡妇蛛的活动能
力和适应能力极强， 一旦入侵我国， 将会由于环境适宜、 缺乏天敌制约等原因导致其大量繁殖和扩散， 给
我国人民健康、 生态环境安全和农林业生产安全造成严重威胁。 因此， 各口岸应加强对进口废旧物品， 或
者多次反复使用的包装、 托盘、 框架及装载这些货物集装箱等物品的检疫查验， 防止赤背寡妇蛛的侵入。
南通出入境检验检疫局 禹海鑫 孙民琴 徐宁 丁伟
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