全 文 ：3　小结
根据中国药典 [ 3] ,选择 346nm为检测波长 ,以药
典流动相甲醇 -乙腈 -磷酸(0.1%)溶液(10∶30∶60)
为流动相 ,在选定的色谱条件下 ,经 HPLC法测定芍药
苷峰和样品中其他组分峰可达基线分离 ,且分离度很
好 ,峰型对称 ,可见 ,本文建立的孕妇金花片中小檗碱
含量测定方法为控制孕妇金花片的质量提供了一定的
理论依据。
参考文献:
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QuantitativeDeterminationofPaeoniflorinofYunfujinhuaTabletbyHPLCMethod
YANGLian-yong1 , ZHANGZhe-feng2 , QILe-hui1 , XUShu-jun1 , LIYan-bing1
(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China;
2.HeilongjiangVeterinaryDrugandFeedMonitor, Harbin150069, China)
Abstract:Objective:AHPLCmethodforthedeterminationofberberineofYunfujinhuatabletwasestablished.Methods:
AKFchromatographiccolumnwasusedwithsolutionofmethylalcohol-acetonitrile-phosphoricacid(10∶30∶60)as
themobilephase, Thedetectionwavelengthwas346nm.Results:Thelinearrangewas0.192 ～ 0.96g, (r=0.99937)and
averagerateofrecoverywas105.37%(RSD=1.06%).Conclusion:Themethodissimpleandsensitivewithgoodsepa-
rationeficiency, itcanbeusedinthestandardofquantitativedeterminationofYunfujinhuatablet.
Keywords:Yunfujinhuatablet;Paeoniflorin;Contentdetermination;HPLC
民族药滇白珠的体外抗氧化活性研究
李东宸 ,郭志琴 ,吕海宁 ,折改梅＊
(北京中医药大学 中药学院 ,北京 100102)
摘　要:目的:研究滇白珠(G.leucocarpavar.yunnanensis)地上部分乙醇提取物的不同极性萃取部位和
大孔树脂柱层析的不同浓度甲醇洗脱部位的抗氧化活性 。方法:采用清除 DPPH(2, 2-二苯基苦味酰
基苯肼基)和 ABTS[ 2, 2′-连氮基 -双 -(3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)二铵盐 ]自由基的方法对滇
白珠乙醇提取物的不同极性萃取部位和大孔树脂柱层析的不同浓度甲醇洗脱部位进行清除自由基能力
的综合评价 。结果:乙酸乙酯部位的抗氧化能力最强 ,与阳性对照相近。 100%甲醇流出部位的抗氧化
能力能力最强 ,强于阳性对照。结论:滇白珠地上部分具有较好的体外抗氧化活性。
关键词:滇白珠(G.leucocarpavar.yunnanensis);DPPH;ABTS
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(0000)06-0062-05
收稿日期:2010-06-30　　修回日期:2010-10-09
作者简介:李东宸(1987-),女 ,制药工程(中药制药)专业。 E-mail:
lidongchen@live.cn
＊通讯作者:折改梅(1976-),女 ,讲师 , 博士 ,研究方向为中药和中药
相关产品的物质基础和质量控制。 E-mail:shegaimei@
126.com
　　滇白珠 ,杜鹃花科 (Ericaceae)白珠树属 (Gaul-
theriaKalmexL.)植物滇白珠(G.leucocarpavar.yun-
nanensis)的干燥根或全草 ,具有清热解毒 、活血化瘀 、
祛风除湿等功效 ,为我国西南少数民族治疗风湿的常
用药材 。滇白珠的根部和地上部分在西南各少数民族
的使用目的有所不同 ,水族利用滇白珠根治疗风湿疼
痛 ,茎叶治疗皮肤湿疹;纳西族利用其茎叶治疗关节
炎 ,湿疹;瑶族 、彝族 、苗族等民族利用滇白珠根或全草
入药 ,治疗风湿 、跌打伤痛等[ 1] 。
滇白珠根部主要含有挥发油 、有机酸 、三萜类 、黄
酮苷类 、香豆精类 、木质素等化合物 [ 2-10] 。滇白珠地
上部分主要报道了黄酮葡萄糖醛酸苷类化合物 ,其中
槲皮素 -3-O-β -D-葡萄糖醛酸苷含量高达乙醇
提取物的 50%以上 [ 11] 。目前认为 ,由自由基介导的
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过氧化损伤是引起风湿性关节炎和类风湿性关节炎的
重要原因之一 [ 12] 。且现代药理实验表明滇白珠根部
具有良好的抗菌抗炎和镇痛作用 [ 13] 。但是 ,关于滇白
珠地上部分抗氧化活性实验至今未见报道 。
所以本文采用清除 2, 2-二苯基苦味酰基苯肼基
自由基 (2, 2-diphenyl-1 -picrylhydrazyl, DPPH)和
2, 2′-连氮基 -双 -(3-乙基苯并噻唑啉 -6-磺酸)
二铵盐 [ 2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-
sulphonicacid), diammoniumsalt, ABTS]自由基的方
法 ,分别以维生素 C和维生素 E为对照[ 14, 15] ,评价滇
白珠地上部分乙醇提取物的不同极性萃取部位和大孔
树脂柱层析的不同浓度甲醇洗脱部位对自由基的清除
能力 ,为民族药滇白珠的进一步开发为抗风湿的新药
提供前期研究和理论基础 。
1　材料与仪器
1.1　药材及供试品制备
药材于 2007年 9月在云南楚雄采收 ,由北京中医
药大 学中 药 学院 闫 玉凝 教 授鉴 定 为滇 白 珠
(G.leucocarpavar.yunnanensisorvar.crenulta)的茎和
叶 ,简称为滇白珠 。
将滇白珠枝叶粉碎 ,用 80%乙醇回流提取 3次 ,
每次 1小时 。提取物旋干至浸膏(Ⅰ 、Ⅱ)。浸膏 Ⅰ用
水分散 ,依次经石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯和正丁醇萃取 ,
得石油醚 、氯仿 、乙酸乙酯 、正丁醇和水五个极性部位。
浸膏Ⅱ甲醇溶解至小体积溶液 ,采用 AB-8大孔树脂
层析色谱柱 , 10%、30%、50%、70%、90%和 100%甲
醇梯度洗脱 ,得六个部位流出物 。
1.2　试剂及供试液配制
DPPH试剂(2, 2-二苯基 -1-苦肼基)和 ABTS
试剂 [ 2, 2′-连氮基 -双 -(3-乙基苯并噻唑啉 -6-
磺酸)二铵盐 ] (Sigma-Aldrich公司),维生素 C和维
生素 E(Sigma-Aldrich公司),过硫酸钾(北京市红星
化工厂),无水乙醇等 ,化学试剂均为分析纯。
供试液配制:供试样品适量 ,无水乙醇溶解 ,充分
振荡 ,配制成 1.0mg· mL-1供试样品溶液。将样品液
依次以 2倍量乙醇稀释 ,配制系列梯度浓度的供试样
品溶液 。
1.3　仪器
DNM-9602G型酶标仪(北京艾普在线科技有限
公司), DH-250型电热恒温培养箱(北京中兴伟业仪
器有限公司),电子天平 (德国 Sartorius公司), RE-
52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂), SHB-Ⅲ
型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。
2　实验方法
2.1　DPPH自由基清除实验
实验采用 YoshidaT.等的方法[ 11] ,以维生素 C为
阳性对照。计算供试样品对 DPPH自由基的清除能力
SR%(Thepercentageofscavengingradicalcapacity)。
SR% =[ 1-(Ai-Aj)/Ac] ×100%
式中 Ac为加入 DPPH后空白对照的吸光值;Ai
为加入 DPPH后样品液或阳性对照的吸光值;Aj为未
加入 DPPH时样品液或阳性对照的吸光值。
2.2　ABTS自由基清除实验
依据 LeeI.K.等的方法[ 12]配制 ABTS工作液并
做简要改进 ,以维生素 E为阳性对照 。计算供试样品
对 ABTS自由基的清除能力 SR%。
SR% =(Ac-As)/Ac×100%
式中 Ac为加入 ABTS后空白对照的吸光值;As
为加入 ABTS后样品液或阳性对照的吸光值。
3　结果与讨论
本文采用自由基清除率为 50%时的样品浓度 IC50
(concentrationinμMrequiredfor50% reductionofDP-
PHradical)评价滇白珠提取物不同极性萃取部位和大
孔树脂柱层析不同浓度甲醇洗脱部位清除 DPPH和
ABTS自由基的能力大小 , IC50越小 ,表明其对自由基
清除能力或抗氧化活性越强。
3.1　不同极性萃取部位清除自由基活性研究
3.1.1　不同极性萃取部位清除 DPPH自由基活性研
究
滇白珠提取物的各个极性萃取部位对 DPPH自由
基都有一定的清除能力 ,数据见表 1。其中 ,滇白珠提
取物的乙酸乙酯萃取部位清除 DPPH自由基的能力明
与阳性对照品维生素 C极为相近 。正丁醇 、氯仿 、石
油醚和水萃取部位清除 DPPH自由基能力则依次减
弱 。各部位对 DPPH自由基清除率的量效关系曲线见
图 1。
图 1　不同极性萃取部位对 DPPH自由基清除率的量效
关系曲线
Fig.1　Dose-responserelationshipofthedifferentextracts
fromG.leucocarpavar.yunnanensisonDPPH
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滇白珠取物的不同极性萃取部位对 DPPH自由基
的清除能力依次为:乙酸乙酯 >正丁醇 >氯仿 >石油
醚 >水 。
表 1　滇白珠不同极性萃取部位对 DPPH自由基的
清除能力(IC50mg·L-1)
Tab.1　DPPHradicalscavengingofthedifferentextractsfrom
G.leucocarpavar.yunnanensis(IC50mg·L-1)
样品 IC50 样品 IC50
VC 18.3 乙酸乙酯 20.8
石油醚 62.5 正丁醇 31.3
氯仿 54.7 水 125
由图 1可看出 ,当样品液浓度大于 0.125mg·L-1
时 ,阳性对照品的清除自由基的能力要明显高于滇白
珠醇提物的不同极性萃取部位 ,当样品液浓度小于 0.
125mg·L-1时 ,乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位
清除自由基的能力与阳性对照品较为相近 ,特别是乙
酸乙酯萃取部位 ,在浓度为 3.125×10-2 ～ 6.25×10-2
mg·L-1范围内时 ,与阳性对照品的清除自由基能力
相当。
3.1.2　不同极性部位清除 ABTS自由基活性研究
滇白珠提取物的各个极性萃取部位对 ABTS自由
基都有很好的清除能力 ,数据见表 2。其中 ,乙酸乙酯
萃取部位和氯仿萃取部位清除 ABTS自由基的能力最
为突出 ,其清除 ABTS自由基的能力与阳性对照品维
生素 E相当 。而正丁醇萃取部位的清除 ABTS自由基
的能力则略弱于对照品。石油醚和水萃取部位的清除
ABTS自由基的能力均较弱。
即不同极性萃取部位对 ABTS自由基的清除能力
依次为:乙酸乙酯 >氯仿 >正丁醇 >石油醚 >水。滇
白珠提取物不同极性萃取部位和阳性对照品对 ABTS
自由基的清除率与浓度的量效关系曲线见图 4。
图 2　不同极性萃取部位对 ABTS自由基清除率的量效关系曲线
Fig.2　Dose-responserelationshipofthediferentextractsfromG.leucocarpavar.yunnanensisonABTS
表 2　滇白珠不同极性萃取部位对 ABTS自由
基清除能力(IC50mg·L-1)
Tab.2　ABTSradicalscavengingofthediferentextractsfrom
G.leucocarpavar.yunnanensis(IC
50
mg·L-1)
样品 IC50 样品 IC50
VE 19.9 乙酸乙酯 22.4
石油醚 146 正丁醇 36.4
氯仿 26.5 水 179
3.2　不同浓度甲醇洗脱部位清除自由基活性研究
3.2.1　不同浓度甲醇洗脱部位清除 DPPH自由基活
性研究
实验结果表明 ,滇白珠提取物的不同浓度甲醇洗
脱部位对 DPPH自由基的清除能力差别较大 ,数据见
表 3。其中 ,滇白珠提取物的 100%甲醇洗脱部位清除
DPPH自由基的能力较明显 ,其清除 DPPH自由基的
能力强于阳性对照品维生素 C,而 50%、90%和 30%
甲醇洗脱部位清除 DPPH自由基的能力则依次减弱。
滇白珠提取物的不同浓度甲醇洗脱部位对 DPPH
自由基的清除能力依次为:100% MeOH>50% MeOH
>90% MeOH>30% MeOH>10% MeOH>70%
MeOH。滇白珠提取物大孔树脂 10%、50%、100%甲
醇脱部位和阳性对照品对 DPPH自由基的清除率与浓
度的量效关系曲线见图 3。
3.2.2　不同浓度甲醇洗脱部位清除 ABTS自由基活
性研究
滇白珠提取物的不同浓度甲醇洗脱部位 ,除 70%
甲醇洗脱部位外 ,对 ABTS自由基都着有极好的清除
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能力 ,数据见表 4。
图 3　不同浓度甲醇洗脱部位对 DPPH自由基清除率的量效关系曲线
Fig.3　Dose-responserelationshipofthediferentconcentrationMeOHelutesfromG.leucocarpavar.yunnanensisonDPPH
图 4　不同浓度甲醇洗脱部位对 ABTS自由基清除率的量效关系曲线
Fig.4　Dose-responserelationshipofthedifferentconcentrationMeOHelutesfromG.leucocarpavar.yunnanensisonABTS
表 3　滇白珠不同浓度甲醇洗脱部位对 DPPH自由基
清除能力(IC
50
mg·L-1)
Tab.3　DPPHradicalscavengingthediferentconcentration
MeOHelutedfromG.leucocarpavar.yunnanensis(IC50mg·L-1)
Samples IC50 Samples IC50
10%MeOH 86.2 70%MeOH 250
30%MeOH 34.3 90%MeOH 31.3
50%MeOH 23.4 100%MeOH 13.2
表 4　滇白珠提取物的不同浓度甲醇洗脱部位对
ABTS自由基清除能力(IC50mg·L-1)
Tab.4　ABTSradicalscavengingofthedifferentconcentration
MeOHelutedfromG.leucocarpavar.yunnanensis(IC50mg·L-1)
Samples IC50 Samples IC50
10%MeOH 55.2 70%MeOH 102.5
30%MeOH 31.1 90%MeOH 24.2
50%MeOH 36.2 100%MeOH 15.1
其中 ,滇白珠提取物的 100%甲醇洗脱部位对
ABTS自由基的清除能力强于阳性对照品维生素 E,
90%甲醇洗脱部位的清除 ABTS自由基的能力与阳性
对照品相当 , 10%、30%和 50%甲醇洗脱部位的清除
ABTS自由基的能力稍弱于阳性对照品。 70%甲醇洗
脱部位清除 ABTS自由基的能力较弱 。
不同浓度甲醇洗脱部位清除 ABTS自由基的能力
依次为:100% MeOH>90% MeOH>30% MeOH>
50% MeOH>10% MeOH>70% MeOH。
50%、90%、100%三个甲醇洗脱部位和阳性对照
品维生素 E对 ABTS自由基的清除率与浓度的量效关
系曲线见图 2。
如图 4所示 , 30%、50%、90%和 100%甲醇洗脱
部位对 ABTS自由基都有着较好的清除能力 ,这四个
甲醇洗脱部位的清除率(SR%)曲线在所测范围内整
体与维生素 E的清除率曲线趋势大体相同 。即浓度
在小于 0.125mg·L-1时呈非常显著的上升趋势;在浓
度大于 0.125mg· L-1之后 ,变化趋势极为平稳 ,趋于
水平。
在浓度大于 0.125mg· L-1时 ,维生素 E的 SR%
比较明显的大于样品液 ,当浓度在 0 ～ 0.125mg· L-1
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的范围内时 ,各甲醇洗脱部位活性与维生素 E较为相
近 。
30%、 90%和 100%甲醇洗脱部位样品浓度在
7.8125×10-3 ～ 3.125×10-2mg·L-1范围内和 3.125
×10-2 ～ 1.25×10-1mg·L-1范围内时 ,对 ABTS自由
基的 SR%与浓度分别呈线性正相关 ,且样品液浓度在
7.8125×10-3 ～ 3.125×10-2mg·L-1范围内时 SR%随
浓度增加的变化趋势远大于样品液浓度在 3.125×
10
-2 ～ 1.25×10-1mg·L-1范围 。各甲醇洗脱部位的量
效关系式见表 5(y、x分别代表 SR%和样品液浓度)。
表 5　各甲醇洗脱部位对 ABTS自由基清除率的量效关系式
Tab.5　Dose-responserelationshipofthediferentconcentration
MeOHelutesfromG.leucocarpavar.yunnanensisonABTS
Samples 7.8125×10
-3 ～ 31.25×
10-2mg·L-1
3.125×10-2 ～
1.25×10-1mg·L-1
30%MeOH Y=14.08x+0.06 Y=3.73x+0.39
50%MeOH Y=16.64x-0.07 Y=2.99x+0.37
90%MeOH Y=21.76x-0.09 Y=2.13x+0.52
100%MeOH Y=19.63x+0.07 Y=1.28x+0.64
4　结论
本实验结果表明 ,滇白珠地上部分具有良好的抗
氧化活性 ,但是不同极性部位的活性相差较大 ,其中 ,
乙酸乙酯萃取部位和大孔树脂层析 100%甲醇洗脱部
位的抗氧化活性最为显著 。滇白珠地上部分提物乙酸
乙酯萃取部位主要成分为黄酮类及黄酮葡萄糖醛酸苷
类化合物;滇白珠地上部分醇提物 100%甲醇洗脱部
位的薄层色谱表明其中的主要成分为槲皮素 -3 -O
-β -D-葡萄糖醛酸苷。综上所述 ,推测槲皮素 -3
-O-β -D-葡萄糖醛酸苷为滇白珠地上部分抗氧化
的主要活性成分 。
参考文献:
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AntioxidantActivityofExtractsfromG.leucocarpavar.yunnanensis
LIDong-chen, GUOZhi-qin, LVHai-ning, SHEGai-mei
(SchoolofChinesePharmacy, BeijingUniversityofChineseMedicine, Beijing100102, China)
Abstract:Objective:Tostudytheantioxidantactivityofdiferentextractsandmacroporousresincolumnchromatography
gradientsolutionsfromethanolextractofGaultherialeucocarpavar.yunnanensisorvar.crenulta.Methods:Adoptedthe
DPPHandABTSassay, withVCandVEasthecontrol.Results:Theethylacetateandthe100%MeOHhavethestron-
gestABTSandDPPHradicalsscavengingefects, asstrongasthepositivecontrol.Conclusion:TheG.leucocarpa
var.yunnanensishasagoodantioxidantactivityinvitro.
Keywords:Gaultherialeucocarpavar.yunnanensisorvar.crenulta;DPPH;ABTS
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