全 文 ：第 36 卷第 3 期
2015 年 3 月
环 境 科 学
ENVIＲONMENTAL SCIENCE
Vol． 36，No． 3
Mar．，2015
镉与 S-异丙甲草胺对斜生栅藻的联合毒性作用
章小强，胡晓娜，陈彩东，刘惠君*
(浙江工商大学环境科学与工程学院，杭州 310018)
摘要:采用毒性标准实验方法研究了 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻急性毒性、总可溶性蛋白含量、超氧
化物歧化酶(SOD)活性和细胞膜通透性的影响． 结果表明 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独作用时 EC50均随时间的延长而减小，且
S-异丙甲草胺的急性毒性大于 Cd2 +;Cd2 +、S-异丙甲草胺的 EC50-24h分别为 0. 27 mg·L
－1、0. 24 mg·L －1，EC50-96h分别为 0. 16
mg·L －1、0. 13 mg·L －1 ． Cd2 +与 S-异丙甲草胺联合作用时低浓度表现为协同作用，高浓度表现为拮抗作用． 暴露 96 h后，Cd2 +
与 S-异丙甲草胺单独及联合作用下，随有毒物质浓度升高，斜生栅藻总可溶性蛋白含量降低，SOD酶活性先激活后抑制，细胞
膜通透性逐渐增大．
关键词:S-异丙甲草胺;Cd2 +;斜生栅藻;联合毒性;SOD酶活性;细胞膜通透性
中图分类号:X171. 5 文献标识码:A 文章编号:0250-3301(2015)03-1069-06 DOI:10． 13227 / j． hjkx． 2015． 03． 041
收稿日期:2014-09-09;修订日期:2014-11-03
基金项目:国家自然科学基金项目(21377115) ;浙江省大学生创新
创业孵化项目;浙江工商大学研究生科技创新项目
(1260XJ1513145)
作者简介:章小强(1990 ～) ，男，硕士研究生，主要研究方向为污染
物环境生态毒理，E-mail:1968287085@ qq． com
* 通讯联系人，E-mail:lhj@ mail． zjgsu． edu． cn
Combined Toxicity of Cadmium and S-metolachlor to Scenedesmus obliquus
ZHANG Xiao-qiang，HU Xiao-na，CHEN Cai-dong，LIU Hui-jun*
(School of Environmental Science and Engineering，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310018，China)
Abstract:The single and combined effects of Cd2 + and S-metolachlor on acute toxicity，total soluble protein content，superoxide
dismutase (SOD)activity and cell membrane permeability of Scenedesmus obliquus (S． obliquus)were studied using the standard toxic
testing methods． The results showed that the EC50 of Cd
2 + and S-metolachlor decreased with time，and the acute toxicity of S-
metolachlor was higher than that of Cd2 +，EC50-24h of Cd
2 + and S-metolachlor was 0. 27 mg·L －1 and 0. 24 mg·L －1，respectively，and
EC50-96hwas 0. 16 mg·L
－1 and 0. 13 mg·L －1，respectively． The combined toxicity of Cd2 + and S-metolachlor showed a synergistic
effects at low concentration，and antagonism effects at high concentration． After 96h-exposure，the total soluble protein content of S．
obliquus decreased，the SOD activity first increased and then decreased，and the cell membrane permeability increased with the
increasing concentration of both single and combined treatment．
Key words:S-metolachlor;Cd2 +;S． obliquus;the combined toxicity;SOD activity;cell membrane permeability
近年来一些对映体纯或对映体富集的农药制剂
得到发展和应用，如 S-异丙甲草胺(S-metolachlor)
已实现商品化生产，许多国家包括我国已用 S-异丙
甲草胺取代外消旋异丙甲草胺的生产使用，其生态
毒性也随之受到关注［1］，研究发现异丙甲草胺对微
藻细胞的急性毒性存在立体选择性差异且 S-异丙
甲草胺的毒性更大［2］． 镉作为毒性最强的重金属元
素之一，可与酶活性中心或蛋白质中的疏水基结合，
还可取代金属硫蛋白中的必须元素(Ca2 +、Fe2 +、
Mg2 +、Zn2 +) ，导致生物大分子构相改变，必须元素
缺乏，干扰细胞正常代谢过程［3］，还会抑制斜生栅
藻和栅列藻的生长，影响光合作用等［4］．
随着工业的发展，进入环境的污染物种类和数
量明显增多，国内外学者在污染物复合污染方面进
行了广泛研究并取得了重要成果［5 ～ 9］，然而在有机-
无机复合污染中手性农药和重金属复合污染研究方
面亟待深入． 斜生栅藻是单细胞生物，具有生长周
期短、易获得、对毒物敏感、培养方便等特点，是水
生毒理研究中较理想的测试生物［10］． 本文以斜生
栅藻为指示生物，研究了 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独
及联合作用对斜生栅藻的急性毒性、蛋白含量、超
氧化物歧化酶(SOD)活性和细胞通透性的影响，以
期为全面合理评价 Cd2 +与 S-异丙甲草胺的生态毒
性提供理论依据．
1 材料与方法
1. 1 藻种及培养
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学
院水生生物研究所，培养基采用水生 4 号(HB-4)人
工培养液，恒温光照培养［11］．
1. 2 主要试剂
S-异丙甲草胺购自先正达(瑞士)公司，纯度为
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96%;氯化镉(CdCl2)购自国药集团化学试剂有限
公司，为分析纯;其他试剂、药品均为分析纯． 水为
二次亚沸蒸馏水．
1. 3 分析测定方法
1. 3. 1 急性毒性的测定
根据有毒化学品对藻类毒性测试的标准实验
方法［12］，结合预实验结果，设置 Cd2 +和 S-异丙甲
草胺浓度均分别为 0、0. 02、0. 05、0. 10、0. 15、
0. 20 和 0. 50 mg·L － 1，进行单独及联合培养，每组
设置 3 个平行;分别于 24、48、72、96 h用可见光
分光光度计测定藻液在 680 nm 处的吸光值，由藻
细胞密度和光密度之间的线性关系得到藻细胞密
度，计算生长抑制率，通过 Logistic 模型进行拟合
得到 EC50值．
采用毒性单位法［13］和相加指数法［14］对 Cd2 +与
S-异丙甲草胺的联合毒性进行分析．
1. 3. 2 蛋白含量及酶活性测定
设置 Cd2 + 与 S-异丙甲草胺浓度分别为 0、
0. 02、0. 1 和 0. 2 mg·L －1，每组 3 个平行． 取暴露 96
h后的斜生栅藻，在 4℃ 下6 000 r·min －1离心 10
min，弃去上清液，加入 10 mL 预冷的 0. 05 mol·L －1
磷酸缓冲液混匀，超声破碎仪破碎 15 min 后在 4℃
下15 000r·min －1离心 10 min，上清液为酶液． 采用
Brandford法测定总可溶性蛋白含量［15］． SOD 活性
的测定采用氮蓝四唑法(NBT法)［16］．
1. 3. 3 藻细胞通透性测定
设置 Cd2 + 与 S-异丙甲草胺浓度分别为 0、
0. 02、0. 1 和 0. 2 mg·L －1，每组 3 个平行． 采用荧光
素二乙酸酯(FDA)荧光色素染色法［17］进行测定．
1. 4 数据统计与分析
实验数据使用 Microsoft Excel 2010 和 Origin
8. 0 进行处理，用 SPSS 15. 0 进行单因素方差分析
(ANOVA)并用 Duncan 法进行显著性检验，结果以
平均值 ± SD表示．
2 结果与讨论
2. 1 Cd2 +与 S-异丙甲草胺复合污染的急性毒性及
联合毒性分析
不同浓度 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合
作用下，斜生栅藻细胞密度均明显低于空白组(P
＜ 0. 05) ，说明两者单独及联合作用均对斜生栅
藻细胞的生长有显著的抑制作用 ． 由表 1 可知，
Cd2 +与 S-异丙甲草胺对斜生栅藻单独及联合作
用的 EC50值均表现为随着处理时间的延长而减
小，Cd2 +、S-异丙甲草胺、0. 02 mg·L － 1 S-异丙甲
草胺 + Cd2 +、0. 1 mg·L － 1 S-异丙甲草胺 + Cd2 +
的 EC50-24h 分 别 为 0. 27、0. 24、0. 27 和 0. 16
mg·L － 1，EC50-96h 分 别 为 0. 16、0. 13、0. 12 和
0. 20 mg·L － 1，表明 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及
联合作用对斜生栅藻的急性毒性随着处理时间
的延长而增大 ． 同一处理时间内，Cd2 +单独作用
对斜生栅藻的 EC50值均大于 S-异丙甲草胺单独
作用的 EC50值，说明 Cd
2 + 对斜生栅藻的急性毒
性小于 S-异丙甲草胺 ．
表 1 Cd2 +与 S-异丙甲草胺复合污染的 EC50值1)
Table 1 EC50 values of Cd2 + and S-metolachlor combined pollution
暴露时间 /h 浓度 /mg·L －1 A1 A2 EC50 Ｒ2 P
Cd － 1. 80 98. 4 0. 27 0. 998 1 3. 89
24 S
2) － 4. 05 75. 6 0. 24 0. 999 7 4. 81
0. 02S + Cd 8. 83 81. 8 0. 27 0. 979 5 1. 42
0. 1S + Cd 10. 4 64. 0 0. 16 0. 989 6 3. 00
Cd 9. 99 85. 0 0. 17 0. 995 3 2. 25
48 S － 10. 1 92. 6 0. 16 0. 987 6 6. 04
0. 02S + Cd 38. 5 84. 2 0. 17 0. 981 7 2. 90
0. 1S + Cd 20. 2 80. 9 0. 15 0. 999 2 4. 01
Cd 9. 32 95. 2 0. 16 0. 980 6 2. 01
72 S － 2. 32 97. 9 0. 14 0. 985 9 3. 42
0. 02S + Cd 30. 7 93. 3 0. 14 0. 981 4 1. 66
0. 1S + Cd 22. 1 87. 0 0. 16 0. 999 8 3. 62
Cd 8. 46 97. 2 0. 16 0. 976 4 2. 02
96 S － 2. 68 97. 5 0. 13 0. 960 8 3. 94
0. 02S + Cd － 4. 40 108. 5 0. 12 0. 998 6 1. 40
0. 1S + Cd 22. 0 94. 2 0. 20 0. 998 6 2. 65
1)Logistic 模型:y = A2 +(A1 － A2)/［1 +(x /EC50)P］;式中，y表示有毒物质对斜生栅藻细胞的生长抑制率(%) ，x表示有毒物质的浓度，数据
由 Origin 8. 0 软件计算所得;2)S为 S-异丙甲草胺，下同
0701
3 期 章小强等:镉与 S-异丙甲草胺对斜生栅藻的联合毒性作用
分别采用毒性单位法和相加指数法对 Cd2 +与
S-异丙甲草胺的联合毒性进行了评价． 由表 2 可
知，低浓度 Cd2 +与低浓度 S-异丙甲草胺的联合毒性
表现为协同作用，M ＜ 1，同时 AI ＞ 0;高浓度 Cd2 +
与 S-异丙甲草胺的联合毒性表现为拮抗作用，高浓
度 S-异丙甲草胺与 Cd2 +的联合毒性也表现为拮抗
作用，M ＞M0，同时 AI ＜ 0． 在评价 0. 1 mg·L
－1 Cd2 +
与 0. 1 mg·L －1 S-异丙甲草胺的联合毒性时，两种方
法得到的结论出现不一致的现象，毒性单位法得 M0
＞M ＞ 1，为部分相加作用，而相加指数法 AI ＜ 0 为
拮抗作用． 已有研究通过实验和评价结果发现，不
同评价方法对同一实验结果的毒性评价可能不同，
但多数评价结论是相同的［18］． 总体而言，低浓度
Cd2 +与低浓度 S-异丙甲草胺的联合毒性为协同作
用，高浓度 Cd2 +与高浓度 S-异丙甲草胺的联合毒性
为拮抗作用．
表 2 Cd2 +与 S-异丙甲草胺的联合毒性分析1)
Table 2 Combined toxicity of Cd2 + and S-metolachlor
混合物 M M0 AI 作用类型
0. 02Cd + 0. 02S 0. 279 1. 813 2. 587 协同
0. 10Cd + 0. 02S 0. 779 1. 246 0. 284 协同
0. 20Cd + 0. 02S 1. 404 1. 123 － 0. 404 拮抗
0. 02Cd + 0. 1S 0. 894 1. 163 0. 118 协同
0. 10Cd + 0. 1S 1. 394 1. 813 － 0. 394 部分相加(拮抗)
0. 20Cd + 0. 1S 2. 019 1. 615 － 1. 019 拮抗
0. 02Cd + 0. 2S 1. 664 1. 081 － 0. 664 拮抗
0. 10Cd + 0. 2S 2. 164 1. 406 － 1. 164 拮抗
0. 20Cd + 0. 2S 2. 789 1. 812 － 1. 789 拮抗
1)毒性单位法(TU法) :M ＜ 1 为协同作用，M = 1 为简单相加作用，M0 ＞M ＞ 1 为部分相加，M = M 0为独立作用，M ＞M0 为拮抗作用;相加指数
法(AI法) :AI ＞ 0 为协同作用，AI = 0 为简单相加作用，AI ＜ 0 为拮抗作用
图例说明同表 1，下同
图 1 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻总蛋白含量的影响
Fig． 1 Combined effects of Cd2 + and S-metolachlor on the total protein content of S． obliquus
2. 2 Cd2 +与 S-异丙甲草胺复合污染对斜生栅藻总
蛋白含量的影响
从图 1 可知单独作用时，藻细胞总蛋白含量随
Cd2 +浓度的升高而降低，且均低于空白组，分别是对
照的 80. 84%、69. 18%和 34. 87%，其趋势与其对藻
细胞密度的影响一致，说明 Cd2 +抑制了藻的生长从
而导致蛋白含量的减少． 不同浓度 S-异丙甲草胺单
独作用时，藻细胞总蛋白含量分别是对照的
104. 50%、55. 05%和 27. 30%，0. 02 mg·L －1处理组总
蛋白含量略高于空白组，这可能是由于低浓度 S-异丙
甲草胺刺激了藻的生长． 在高浓度处理组 S-异丙甲
草胺对藻细胞总蛋白含量的影响高于 Cd2 +的影响．
Cd2 +与 S-异丙甲草胺联合作用时藻细胞的总
蛋白含量均明显低于空白组． 由图 1 可知，总体而
言当 Cd2 +浓度一定时，与 S-异丙甲草胺联合作用对
藻细胞蛋白含量的影响随着 S-异丙甲草胺浓度的
升高而降低;当 S-异丙甲草胺浓度一定时，与 Cd2 +
联合作用对藻细胞蛋白含量的影响随着 Cd2 +浓度
的升高而降低． 0. 1 mg·L －1 S-异丙甲草胺处理下，
与 0. 1 mg·L －1和 0. 2 mg·L －1 Cd2 +联合作用时总蛋
白含量均高于 0. 02 mg·L －1 S-异丙甲草胺处理下与
Cd2 +联合作用时的总蛋白含量，总蛋白含量分别为
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60. 85 mg·L －1、38. 75 mg·L －1以及 48. 34 mg·L －1、
23. 07 mg·L －1，表现出在 0. 1 mg·L －1 S-异丙甲草胺
处理下与 0. 1 mg·L －1和 0. 2 mg·L －1 Cd2 +联合作用
对藻细胞总蛋白含量的影响产生了拮抗作用，这与
联合毒性分析结果一致． 0. 2 mg·L －1 S-异丙甲草胺
处理藻细胞总蛋白含量均较小，没有明显变化，这可
能是由于高浓度 S-异丙甲草胺对藻细胞的抑制作
用已经较大，添加 Cd2 +对藻细胞总蛋白含量影响所
起的联合毒性作用不明显．
2. 3 Cd2 +与 S-异丙甲草胺复合污染对斜生栅藻
SOD酶活性的影响
逆境胁迫下植物细胞会产生过多的活性氧自由
基(ＲOS)，包括过氧化氢(H2O2)、基态氧(
1O2)、
超氧阴离子自由基(O· －2 )和羟自由基(·OH)等，而
生物则会启动自身细胞内的抗氧化系统清除多余的
活性氧自由基以防止细胞损伤． 在酶促过程中 SOD
是清除自由基的重要酶之一，将毒性较强的 O· －2 转
化为毒性次级的 H2O2 和基态氧，减少·OH的生成，
常被作为评价抗氧化水平的有效生物指标［19］．
从图 2 可知单独作用时 SOD 酶活性随 Cd2 +浓
度的升高而下降，分别为 3. 56、2. 51 和 1. 45
U·mg －1;SOD 酶活性随 S-异丙甲草胺浓度的升高
呈先增大后减小、先刺激后抑制的趋势，分别为
3. 12、5. 69 和 1. 23 U·mg －1 ． 0. 02 mg·L －1、0. 1
mg·L －1 Cd2 +和 0. 02 mg·L －1、0. 1 mg·L －1 S-异丙甲
草胺联合作用对 SOD 酶活性的刺激作用大于其单
独作用，SOD酶活性分别为空白组的 2. 12 倍(0. 02
mg·L －1 Cd2 + + 0. 02 mg·L －1 S-异丙甲草胺)、2. 26
倍(0. 02 mg·L －1 Cd2 + + 0. 1 mg·L －1 S-异丙甲草
胺)、1. 43 倍(0. 1 mg·L －1 Cd2 + + 0. 02 mg·L －1 S-
异丙甲草胺)和 1. 56 倍(0. 1 mg·L －1 Cd2 + + 0. 1
mg·L －1 S-异丙甲草胺)． 根据联合毒性分析，0. 02
mg·L －1、0. 1 mg·L －1 Cd2 + 和 0. 02 mg·L －1、0. 1
mg·L －1 S-异丙甲草胺联合作用属于协同作用或部
分相加作用，氧化应激响应使 SOD酶活性增加以清
除更多的自由基． 0. 2 mg·L －1 Cd2 +或 0. 2 mg·L －1
S-异丙甲草胺联合作用对 SOD 酶活性抑制作用明
显，这可能是由于高浓度作用下藻细胞生长抑制率
较大，导致大量自由基生成从而细胞的抗氧化酶活
性下降．
图 2 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻 SOD酶活性的影响
Fig． 2 Combined effects of Cd2 + and S-metolachlor on the SOD activity of S． obliquus
SOD激活说明有毒物质的存在使藻细胞内产
生了氧化应激反应，随着有毒物质浓度的升高酶活
性被抑制，产生的过量自由基会转化为毒性更强的
·OH，从而导致细胞大分子或其结构的破坏，被破坏
的大分子中可能包括蛋白酶类等，如藻细胞内的总
可溶性蛋白和 SOD酶蛋白，而这些蛋白含量的减少
会造成抗氧化能力的下降． 这与 Liu等［20］研究得到
的异丙甲草胺对蛋白核小球藻的 CAT 酶活性影响
结果一致．
2. 4 Cd2 +与 S-异丙甲草胺复合污染对斜生栅藻的
细胞通透性的影响
由图 3 可知，各处理组藻细胞膜通透性均高于
对照组，说明 Cd2 +与 S-异丙甲草胺的存在破坏了藻
细胞膜的完整性． 单独作用下，藻细胞膜通透性随
S-异丙甲草胺浓度的增加而逐渐增大，各浓度处理
组藻细胞通透性分别是对照组的 1. 11、3. 73、
29. 81 倍;Cd2 +单独作用时呈现相同的趋势，各浓
度处理组藻细胞通透性分别是对照组的 0. 91、4. 0、
2701
3 期 章小强等:镉与 S-异丙甲草胺对斜生栅藻的联合毒性作用
10. 87 倍． 说明 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独作用对斜
生栅藻细胞通透性的影响与其各自浓度呈正相关效
应，且 S-异丙甲草胺对藻细胞膜通透性的影响显著
大于 Cd2 +的影响． Cd2 +浓度一定时，随着 S-异丙甲
草胺浓度的增加，藻细胞膜通透性增加，与 0. 02
mg·L －1、0. 1 mg·L －1 S-异丙甲草胺联合作用处理
组藻细胞内产生荧光信号的强度与 Cd2 +单独处理
组相比增强不明显，与 0. 2 mg·L －1 S-异丙甲草胺联
合作用处理组荧光信号强度明显增强，细胞膜通透
性明显增大，分别是对照组的 20. 78、23. 55 和
12. 60 倍;当 S-异丙甲草胺浓度一定时，随着 Cd2 +
浓度升高，荧光信号强度增强，细胞膜通透性增大．
Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用下，藻细
胞膜通透性随有毒物质浓度的升高呈逐渐增大的趋
势，该过程使细胞内各种物质正常的运输过程遭到
干扰，增大了污染物透过细胞膜进入细胞内部的可
能性． 研究认为污染物等逆境胁迫下生物细胞内过
量 ＲOS的产生可能会使细胞膜完整性受损［21 ～ 23］．
有毒物质对藻类的毒害作用是由于对藻细胞膜的破
坏导致细胞膜通透性增加，使环境中的有毒物质能
顺利进入细胞，并与细胞中有生命活性的物质发生
反应，干扰或破坏了细胞正常的代谢［24，25］．
图 3 Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用对斜生栅藻的细胞通透性影响
Fig． 3 Combined effects of Cd2 + and S-metolachlor on the cellular membrane permeability of S． obliquus
3 结论
(1)Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独作用对斜生栅
藻的 EC50均随着暴露时间的延长而减小，且 S-异丙
甲草胺毒性大于 Cd2 +;Cd2 +与 S-异丙甲草胺联合
作用时低浓度表现为协同作用，高浓度表现为拮抗
作用．
(2)Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用下，
斜生栅藻细胞总可溶性蛋白含量随有毒物质浓度的
升高而降低;Cd2 +单独作用的影响大于 S-异丙甲草
胺单独作用的影响．
(3)Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用下，
斜生栅藻细胞 SOD 酶活性随有毒物质浓度的升高
呈先激活后抑制的趋势;高浓度 Cd2 +或高浓度 S-
异丙甲草胺联合作用对 SOD 酶活性的抑制作用
明显．
(4)Cd2 +与 S-异丙甲草胺单独及联合作用对
斜生栅藻细胞膜通透性的影响总体呈逐渐增大的趋
势;S-异丙甲草胺单独作用的影响大于 Cd2 +单独作
用的影响;在高浓度 S-异丙甲草胺条件下，Cd2 +与
S-异丙甲草胺复合作用对藻细胞膜通透性的影响逐
渐减弱．
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