全 文 ：收稿日期:2015 － 08 － 30;修回日期:2016 － 02 － 28
基金项目:福建省发改委产业化项目(闽发改高技［2011］
1598);福建省海洋与渔业厅海洋高新项目(闽海洋高新
［2015］06)
作者简介:陈 涵(1991)，女，在读硕士，研究方向为微藻生
物技术(E-mail)chenhan91@ sina． cn。
通信作者:陈必链，教授(E-mail)chenbil@ fjnu． edu． cn。
微生物油脂
诱变结合流式细胞仪筛选栅藻高产油脂藻株
陈 涵1，李小妹1，蔡 钒1，2，周有彩1，戴幼芬1，王明兹1，2，陈必链1，2
(1．福建师范大学 生命科学学院，福州 350117;2．福建师范大学 工业微生物教育部工程研究中心，福州 350117)
摘要:为筛选出高产油脂的栅藻藻株，先利用硫酸二乙酯(DES)和紫外诱变再采用流式细胞仪对诱
变之后的栅藻进行逐个细胞筛选。结果表明:用诱变剂量为 0． 4% DES诱变之后，筛选到 1 株油脂
含量为(40． 95 ± 0． 12)%藻株;再紫外诱变 7 min 后经流式细胞仪筛选，得到的栅藻细胞主要以 4
个或更多细胞团聚形式存在，而且筛选到的细胞体积比对照组的大。经两步缺氮法扩大培养后，测
得其最高油脂含量达(53． 79 ± 0． 52)%，相对于对照组提高 10． 78 个百分点。
关键词:栅藻;诱变;流式细胞仪分选;油脂含量
中图分类号:TS222;TQ92 文献标识码:A 文章编号:1003 － 7969(2016)05 － 0065 － 04
Screening of high － yield oil strain from Scenedesmus sp． by
mutation combined with flow cytometry
CHEN Han1，LI Xiaomei1，CAI Fan1，2，ZHOU Youcai1，DAI Youfen1，
WANG Mingzi1，2，CHEN Bilian1，2
(1． College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou 350117，China;2． Engineering Ｒesearch
Center of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Fujian Normal University，Fuzhou 350117，China)
Abstract:In order to screen high － yield oil strain from Scenedesmus sp．，firstly Scenedesmus sp． was mu-
tated by diethyl sulfate (DES)and ultraviolet ray，then the cells of mutated Scenedesmus sp． were
screened one by one by flow cytometry． The results showed that after being mutated by DES with mutation
dosage 0． 4%，a strain with oil content (40． 95 ± 0． 12)% was screened，and after being further mutated
by ultraviolet ray for 7 min and screened by flow cytometry，the cells of screened Scenedesmus sp． mainly
existed in form of four or more cells assembling，and their volume were bigger than the control group． Af-
ter two stages of N － deficient cultivation，the highest oil content reached (53． 79 ± 0． 52)%，increasing
by 10． 78 percentage points compared with the control group．
Key words:Scenedesmus sp．;mutation;flow cytometry;oil content
目前，流式细胞仪被广泛应用于微生物中，如肿
瘤细胞或者其他动物细胞相关基因的表达等目的细
胞的筛选等［1］。由于流式细胞分选技术的高效性
和准确性，已有研究将其应用于微藻上，进而筛选出
高产油脂、EPA 和 TAG［2］等的目的藻株。Montero
等［3］通过两次流式细胞分选技术，筛选得到尼罗红
荧光值提高为原来 4 倍的 Tetraselmis suecica。Bou-
garan等［4］也利用流式细胞分选结合二次紫外诱变
技术，筛选得到总脂肪酸含量为 409 mg /g 的等鞭金
藻突变株，高于野生株等鞭金藻 Isochrysis affinis
Galbana(T － Iso)的总脂肪酸含量(262 mg /g)。
栅藻属绿藻门(Chlorophyta)、绿球藻目(Chloro-
coccales)，是一种常见的淡水微藻，广泛分布于湖
泊、池塘、沼泽等静水环境。由于其生长快速、能大
量合成油脂，是典型的产油微藻［5］，可能成为生物
柴油原料的微藻种类之一［6］。在最近的研究中，Li
等［7］筛选到一种栅藻 Scenedesmus sp． LX1 并将其置
562016 年第 41 卷第 5 期 中 国 油 脂
于二级污水中培养，培养结束后栅藻的油脂含量为
31% ～33%。Chen 等［8］研究表明通过分批式培养
28 d，栅藻 Scenedesmus sp． NJ － 1 的平均生物量产
率可达 0． 105 g /(L·d)(干重)，最高油脂含量可达
干重的 35%，其中中性油脂占总油脂含量的 78%。
马红芳等［9］利用废水培养栅藻 LX1(Scenedesmus
sp． LX1)，培养至稳定期后，单位藻细胞油脂含量达
31． 6%。
实验表明复合诱变结合流式细胞仪是比较高度
有效的分离筛选方法，传统的方法都是需要分离筛
选单藻落比约 1∶ 10 000，才能分选到高产藻株［10］。
钟娜等［11］利用流式细胞仪筛选了一株油脂含量比
原始菌株高 140%的菌株。李忠英等［12］利用紫外
诱变筛选出的突变株 UV － 6 酶活力比原始菌株芽
孢杆菌 CS － 4 提高了 6． 76%，而利用复合诱变(紫
外结合硫酸二乙酯诱变)使突变株 DE － 8 的酶活提
高 48． 2%。
本研究先用硫酸二乙酯(DES)诱变结合紫外诱
变藻种，后用流式细胞分选技术研究其筛选效果，筛
选出高产油脂的藻株，为高效筛选高产油脂藻株提
供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 藻种
栅藻 Scenedesmus sp． FACHB14，购于中国科学
院水生生物研究所中国淡水藻种库。
1． 1． 2 培养基
BG11 培养基，调节培养基 pH 为 7． 0 左右，
121℃灭菌 20 min。BG11(－ N)培养基为不添加硝
酸钠成分的培养基。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 DES诱变
用诱变剂量为 0． 25%、0． 4%和 0． 5%(以藻液
质量计)的 DES 诱变栅藻。诱变条件:25℃在摇床
上 120 r /min诱变 30 min，后用 25% Na2S2O3 中止
反应，后涂布于含 2． 5 μmol /L 三氯生的 BG11
(－ N)平板上，参考文献［13］的培养方法进行培
养，挑选长势较好的 20 株藻株在摇瓶中低光缺氮培
养 9 d后转高光缺氮培养 6 d，测定油脂含量［13］。
1． 2． 2 紫外诱变
取生长至对数期的栅藻，用无菌的 0． 1 mol /L
PBS(pH 7． 0)调整 OD684为 0． 2 ～ 0． 22，制成藻悬
液。打开紫外灯(40 W、35 cm)预热 20 min，取 4 mL
的藻悬液于 6 cm 的无菌平面中，分别照射 0、1、4、
7、10、14 min，暗处理 24 h，在红外灯下分别逐级稀
释至 10 －4倍，取 100 μL 涂布于含有 1． 7%琼脂的
BG11 培养平板上，先低光强(2 000 lx 左右)后高光
强(6 000 lx左右)下培养至长出可见藻落，绘制紫
外致死曲线。
1． 2． 3 尼罗红荧光染色
分别取紫外诱变 7 min和 10 min的藻液 1 滴于
载玻片上，盖上盖玻片，再滴加尼罗红储备液暗处理
5 min 后，于荧光显微镜下观察细胞形态。调整
OD684小于 0． 2，取 5 mL藻液，加入 50 μL尼罗红，暗
处理染色 10 min，用于流式细胞仪分选。
1． 2． 4 流式细胞仪分选藻细胞
用上样管取 3 mL 已用尼罗红染色的藻样于进
样口，流式细胞仪(BD FACSAriaIII)的进样管口具
有自带的网格滤嘴可以对样品作进一步过滤。由于
尼罗红结合油脂后，在 488 nm激发波长下的发射波
长为 550 ～ 590 nm，故选择(575 ± 25)nm 带通滤波
器，压力 7 000 V，以 PBS为鞘液［3］。
设置 Ｒegions软件分析藻细胞的尼罗红荧光强
度，选择 Ｒegions内细胞的最强荧光值的 10%进行
收集，并以 2 000 个 / s左右的速度筛选目的细胞，细
胞从 70 μm喷嘴喷出，用含 0． 5 mL BG11 培养基的
无菌收集管收集目的细胞，置于冰上保存。将细胞
浓度逐级稀释至 10 －4倍涂布在 BG11 平板上，置于
2 000 lx左右光强下。参考文献［13］对其进行两步
缺氮培养和油脂提取，考察筛选效果。
1． 2． 5 数据处理
实验分别设置 3 次平行，对实验数据进行标准
差分析。
2 结果与讨论
2． 1 DES诱变结果(见表 1)
表 1 不同 DES诱变剂量诱变栅藻之后的油脂含量
样品 油脂含量 /% 油脂含量超过 40%株数
对照组
DES诱变组
34． 94 ± 0． 03 0
0． 25% 40． 03 ± 0． 05 1
0． 4% 40． 95 ± 0． 12 2
0． 5% 40． 03 ± 0． 13 1
注:表中诱变组油脂含量均为不同 DES 诱变剂量下测得
的最高值。
从表 1 可以看出，DES 诱变组的油脂含量均高
于对照组的平均油脂含量(34． 94 ± 0． 03)%;
0． 25%DES处理栅藻，其油脂含量超过 40%的藻株
有 1 株为(40． 03 ± 0． 05)%;0． 4% DES 处理栅藻，
其油脂含量超过 40%的藻株有 2 株，其中最高油脂
含量为(40． 95 ± 0． 12)%，编号为 0． 4 － 1;0． 5%
66 CHINA OILS AND FATS 2016 Vol. 41 No. 5
DES处理栅藻，其油脂含量超过 40%的藻株有 1 株
为(40． 03 ± 0． 13)%。故选择诱变剂量为 0． 4%的
DES处理栅藻，并且选择油脂含量超过 40%的藻株
编号为 0． 4 － 1 再进行紫外诱变。
2． 2 紫外诱变结果
选择经 DES 诱变获得的较高产油脂的栅藻
0． 4 － 1 进行紫外诱变，按 1． 2． 2 方法将诱变藻株涂
布于 BG11 培养基上培养，计数，绘制致死率曲线，
结果见图 1。
从图 1 可以看出，紫外诱变 7 min 的致死率为
82%，诱变 10 min的致死率为 89%，根据 80% ～90%
的致死率为最适诱变剂量，故选择紫外诱变 7 min 和
10 min的藻株进行下一步的流式细胞仪筛选。
图 1 栅藻 0． 4 －1 的紫外诱变致死率曲线
2． 3 流式细胞仪分析
根据油脂的尼罗红染色荧光强度，利用流式细胞
仪分析其藻细胞的突变情况，以栅藻 0． 4 － 1 诱变 0
min的藻株作为空白对照，分析紫外诱变 7 min 和 10
min后细胞荧光强度对应的群落分布，结果见图 2。
注:A1、B1 为栅藻 0． 4 － 1 对照组，A2、B2 为栅藻 0． 4 － 1 诱变 7 min，A3、B3 为栅藻 0． 4 － 1 诱变 10 min。FSC － A 为细胞的
大小，PE － A表示细胞内油脂结合尼罗红染色的荧光强度。
图 2 栅藻细胞的大小及群落分布与油脂荧光强度间的关系
从图 2 可以看出，与对照组相比，藻株 0． 4 － 1
紫外诱变 7、10 min 在 P7 区有明显的峰，且有 2 个
明显的高产油脂群落图。同时，藻种 0． 4 － 1 对照组
的 P2 区的细胞数占总细胞数量的 0． 3%，紫外诱变
7 min的 P2 区的细胞数占总细胞数量的 14． 4%，紫
外诱变 10 min 的 P2 区的细胞数占总细胞数量的
6． 1%。P2 区的尼罗红荧光强度较强，尼罗红荧光强
度越强，油脂含量越高，且栅藻 0． 4 － 1 紫外诱变 7
min后的 P2 区细胞数占总细胞数量最多，因此选择
栅藻 0． 4 － 1 紫外诱变 7 min 为最佳诱变条件进行
诱变，再采用流式细胞仪进行逐个细胞筛选，以筛选
到高产油脂藻株，结果见图 3。
图 3 流式细胞仪分选栅藻图
762016 年第 41 卷第 5 期 中 国 油 脂
从图 3 可以看出，栅藻 0． 4 － 1 对照组和紫外诱
变 7 min的流式细胞仪分选图共分为 4 个区，综合
考虑各个区藻株细胞大小，高产油脂藻株细胞占比
和荧光强度，最终对照组选择 P9、P10 区进行细胞
收集，诱变组选择 P8、P5 区进行细胞收集。
当收集的细胞数达(5 ～ 10)× 104个后，分别稀
释涂布于 BG11 的平板上，于 2 000 lx左右光强下培
养。分别挑取单藻落于含 15 mL BG11 培养基的 50
mL三角瓶中培养，逐级扩培后，利用两步缺氮培养
法研究流式细胞仪的筛选效果。将收集的细胞镜
检，观察细胞形态。结果发现，对照组的 P9 区和诱
变 7 min的 P8 区的细胞均较小，对照组的 P10 区和
诱变 7 min的 P5 区的细胞均较大，对照组的细胞主
要以单细胞的形式存在;而诱变 7 min 后，细胞主要
以 4 个或更多细胞团聚组合形式存在，P8 区和 P5
区均是多细胞。
表 2 为流式细胞仪筛选后各区细胞油脂含量。
表 2 流式细胞仪分选栅藻后各区细胞油脂含量
样品 区域 油脂含量 /%
对照组 平均 43． 01 ± 0． 56
P9 区 48． 60 ± 0． 96
P10 区 49． 43 ± 0． 77
诱变组 P5 区 53． 79 ± 0． 52
P8 区 50． 77 ± 0． 62
从表 2 可以看出，未经过流式细胞仪筛选的原
始对照组平均油脂含量为(43． 01 ± 0． 56)%;对照
组经筛选、两步缺氮法培养后，诱变 0 min 的 P9 区
的油脂含量平均值为(48． 60 ± 0． 96)%，P10 区的油
脂含量平均值为(49． 43 ± 0． 77)%;栅藻 0． 4 － 1 诱
变 7 min 后 P8 区的油脂含量最高可达(50． 77 ±
0． 62)%，P5 区的油脂含量最高可达(53． 79 ±
0． 52)%，相对于对照组平均油脂含量提高了 10． 78
个百分点。
3 结 论
采用两步诱变(DES 诱变和紫外诱变)结合流
式细胞仪筛选栅藻高产油脂藻株。通过 DES 诱变
筛选获得产油脂较高的栅藻 0． 4 － 1，再利用紫外进
一步诱变栅藻 0． 4 － 1，对紫外诱变 7、10 min藻株采
用流式细胞仪进行筛选，最终筛选到 1 株藻株，经两
步缺氮培养测得最高油脂含量为 (53． 79 ±
0． 52)%，比未经诱变筛选的栅藻平均油脂含量
(43． 01 ± 0． 56)%提高了 10． 78 个百分点。
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