全 文 ：柳橙胚胚性愈伤组织辐照效应的研究 *
张进仁 吴安仁 陈善春 高 峰
( 中国农业科学院柑桔研究所 )
长期继代培养的胚性愈伤组织产生的体细胞胚
与合子胚的起源一样 , 来源于单细胞 , 所分化的植
株是没有嵌合性的。 另外能提供遗传性一致且容易
处理的较大群体数 , 不受季节和植物发育阶段的限
制 , 任何时候都可 以进行试验 , 给研究工作提供了
很多方便 。 这是突变育种所需要的一种理想试材 。
然而要利用这一胚性细胞无性系进行辐射诱变 , 首
先必须研究其辐射敏感性问题 , 找出致死和半致死
剂量 , 为辐射诱变提供依据 。
材 料 和 方 法
试验材料来源于 1 9 7 6 年 4 月从柳 橙 ( C i f r “ s
s￡” e ” s e O s b e e k )胚培养中获得的胚性愈伤组织 〔`〕 ,
已继代 10 年 , 45 代 以上 。 由于该胚 性 细 胞 无性系
( 以下简称 L 76I 细胞系 )已完全驯化 , 所以仍具有分
化再生能力 。
用于本试验的基本培养基是M T , 附加 有 BI A
(。 . 5毫克 /升 )和 C H ( 5 0。毫克 /升 ) 的为 1 号培养基 ,
只含 C H ( 50 0毫克 /升 )的为 2 号培养基 。
将 L 761 细胞系接种在 1号培养基上在 25 一 30 ℃
条件下培养 , 每 日光照 14 小时 ,光强 2 0 0 0勒克斯 (荧
光灯 ) 。 当处于生长旺盛期时 (转管后 3一 5周 ) , 用西
南农业大学钻源 , 以不同剂量“ C。 一 , 射线辐照 , 剂
量率为 2 4工 . 6 4伦琴 /分钟 , 按不同时间 获 得不同剂
量 。 处理后 1一 3天内将辐照后的材料切割成小块 ,
称重并转入 2 号培养基上进行培养 , 每 处 理 接 种
10 一 15 管 。 在同样条件下培养一定时间后 , 调查愈
伤组织的重量和胚状体的生长状况 , 计算增殖倍数
(现鲜重除以原鲜重 ) 。 镜检不同处 理的细 胞 并用
7% 不连续系统聚丙烯酞胺 ` 凝 胶垂直板电泳分别检
验不同处理的过氧化物酶同工酶 , 样品的制备 、 电
泳条件及染色方法均见前述 〔幻 。
为了观察辐射对培养基的间接作用 , 作三种处
理 : 材料和培养基均不照射 ; 只 照射材料 , 只照射
培养基。 照射剂量为 12 千伦琴 。 用 1号和 2 号培养
基作重复试验 。
礴
结 果 与 分 析
一 、 辐照对 L 76 .细胞系增殖和分化的影响
用 0、 4 、 8 、 1 0 、 1 2 、 1 4 、 1 6、 2 0、 2 4、 2 8 千
伦琴的下射线照射 已在 i号培养基上培养5周的 L 7 6I
细胞系 , 照射后转入 2 号培养基中。 开始几天各剂
量间差别不大 , 约 2 周后开始出现差异 , 3 周后更
加明显 。 剂量大的先是停止生长 , 随后愈伤组织变
得松散 , 逐渐萎缩 , 全部转褐死亡 , 中等剂量的生
长缓慢或少部分转褐 , 其后又从 褐 变 的愈伤组织
上重新长出少量淡黄色胚性细胞团 ; 低 剂 量 的 生
长均低于对照 , 但有明显增殖 。 培养 7 周后进行测
(
表 1 不 同剂童下射线对 L 7 6I 细胞 系生长和 形成胚状体的作用
愈伤组织原 7 周后鲜重 愈伤组织增 增殖倍 数为鲜近 (克 /管 ) (克 /管 ) 殖倍数 对照的%
0 (对照 )
4
8
ō了泣丹JQ臼
.…八已OùSJ任
0
。
1 2 0
0
。
1 1 1
0
。
1 2 4
0
。
0 9 0
0
。
1 0 4
0
。
1 1 3
0
。
07 7
0
。
0 9 5
0
一 0 92
0
。
10 4
1
。
8 9 9
1
。
34 5
1
。
0 8 2
0
。
4 9 9
0
。
5 0 0
0
。
4 2 9
0
。
0 7 0
0
。
0 7 6
0
。
0 7 0
/
0
。
0 8 8
1 5
。
8
1 2
。
1
8
一
7
5
.
5
4
.
8
3
一
8
一 O 。 9
一 O 。 8
一 0 一 8
一 O 。 8
1 0 0
。
0
7 6
。
6
55
。
1
3 4
。
8
3 0
。
4
24
。
1
一 5。 7
一 5。 1
~ 5一 1
一 5 . 1
3
.
2
2
。
4
1 5
。
1
18
一
3
1 6
。
2
1 7
一
6
定 , 结果见表 1 。 可以看出 ,
在试验剂量下 随着剂量增大 ,
抑制作用增强 。 在 4 千伦琴最
低剂量下 , 其增殖倍数为对照
的76 . 6 % , 8 千伦琴增殖倍数
为对照的 5 。 1% , 已有近半数
死亡 ; 10 一 14 千伦琴增殖倍数
仅为对照的 3 4 . 8一2透. 1 % , 大
部分死亡 ; 16 千伦琴以上全部
死亡 。 关于胚状体的发生 , 在
. 参加本项工作的还 有 张 水
芳 、 葛康同志。
ù
U,曰J任一匕nù呀8ù工1ù1孟,曰心白n`
DOI : 10. 13938 /j . i ssn. 1007 -1431. 1987. 01. 003
丫\ 、
困版 不 同荆量60 C 。 一 , 封线处 理 L 76 I细胞 系培养 7 周后 的
1
。
O伦琴 (对照 ) , 细胞系生长正常
2
。
8 千伦琴 , 近半数死亡
3。 1 2千伦琴 , 大部 分死亡
` 1 6千伦琴 , 姜缩 , 全部
5 。 正常细胞
缘护确
少
致死之前各剂量间 , 随着辐射剂量的增加 , 有刺激
胚状体数目增加的趋势 。 高剂量处理起初所分化的
胚状体 , 虽然细胞团以后逐渐死亡 , 但胚状体仍生
长良好 。 重复试验结果相同。
对培养 7 周后的 L 7 6I 细胞系镜检结果发现 , 8
, 公于 J乙; 苗口争争刀 、 ; J沈尹迈歌之抽召己苗; 2书 , 口七 {1. . 11. . . ! 心
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6
。
8 千伦琴以上出现的巨型细胞
果表明 , o一 1 4千伦琴有 P x i 、 P x Z 、 P x s三条主要
酶带 , 16 千伦琴以上仅具有 P 火 2一条酶带 , 且颜色
加深 (见图 ) 。
上述试验表明 L 76I 细胞系对辐射较敏感 , 低剂
量即有一定的抑制作用 , 其 L叭 。是 8 千伦琴 , 1G 千
琴以上是致死剂量 。 因此 , 若用半致死剂量进行诱
变 , 可用 8 千伦琴进行照射。
二 、 辐照培养甚对 L 76 I细胞系的影晌
辐照除了直接作用于被照射的细胞外 , 是否还
间接地通过被照射的培养基影响细胞和组织的生长
分化? 我们用12 千伦琴? 射 线照射 1 号和 2 号空白
培养基 , 分别与未照射的培养基作对比 。 7 周后测
定其增殖和分化情况 , 结果见表 2 。 可 以 看出 , ,
表 2 , 升线照舫培养基时 L 76 I
细胞系的影响
1 号培养基 2 号培养其
. . 强 皿勿弱
图 下封线处理 L 76I 细胞系后过羲化物睁
同工酶主要讲带 的变化
愈伤组 l培养 7 周后
千伦琴以上剂量开始出现巨型细胞 (见照片 ) , 同时
对不同剂量处理的过氧化物酶同工酶电泳分析 , 卜结
对照 备
只照射培养基
只照射细胞系
织增殖倍数
2 0
。
3
1 9
一 2
5 . 0
胚状体数
(个 /管 )
2一 4
1 4
一 3
愈伤组 } 培养 7 周后织增殖 J 胚状体数
倍 数 ! (个 /管 )
15 . : … : . 2
, , · 5
{
, · ,
4 · 8 ! 1 6
· 2
告 培养基和细胞系均不服射
射线只对细胞有直接影响 , 通过辐照处理后的培养
基对 L 76 I细胞团增殖和胚状体产生并 无间接影响。
所以 , 在进一步作诱变试验时 , 仅辐照细胞系材料
即可 , 而不必辐照空白培养基 。
讨 论
在常规辐射育种中 , 常常用接穗为试材 。 根据
原套— 原体学说 , 接穗的顶端分 生 组 织尖端是
L一 I
、
L 一 I 和 L 一皿组织原层构成的。 由于三层组织原
的各层细胞或同一层的不 同细胞不可能都突变 , 这
样 , 便产生了于生产不利的嵌合体 , 从而成为突变
育种中需要解决的一个重要间题 。 利用愈伤组织为
试材进行人工诱变 , 则突变的细胞所产生的植株是
单纯的突变体 , 这样就解决了突变细胞被掩盖或形
成嵌合体的弊病 , 从而提高了选择的机率 。 但柑桔
组织培养中组织和细胞对 v射线辐照 敏感性是一个
复杂的间题。 首先必须筛选出一个合适的剂量 , 既
要保存活体最多弘又要诱变机率最高 , 一般以 L几。
即半致死剂旦作为衡量标准 。 目前研究辐照对柑桔
离体组织和细胞作 用的 报 道 尚不多见 。 S iP eg el -
R oy 等 〔幻详细观察了下射线对继 代 培养了一年多的
沙莫蒂甜橙 ( C . 。泣n e n s 玄: O s b e e k )胚珠胚性愈伤组
织辐照的影响 , 以剂量率为 3 . 1千伦琴 /小时辐照时 ,
在 16 千伦琴胚状体数达到最高滩 , L D ` 。 为 20 千伦
琴 , 28 一 32千伦琴为致死剂量 。刘功弼阅以接种28 天
的锦橙珠心苗茎尖外植体所产生的愈伤组织为辐照
试材 , 当用12 7伦琴 / 分钟剂量率 照射时 , L D 6。为
6一 7千伦琴 。 以上结果与本试验结果都不尽相同 ,
这说明来源于不同品种 、 不同器官、 不同年龄的愈
伤组织以不同剂量率辐照时 , 其半致死剂量的差别
是显而易见的 。
关于射线对柑桔细胞遗传的作用 , 可以通过巨
型细胞着出。 巨型细胞比一般细胞体积大 3一 5倍 ,
形状很不规则 。 8 千伦琴是产生巨型细胞的最低剂
量 , 随剂量升高数量增多 。 我们认为 , 巨型细胞是
体细胞的突变 , 它的出现是辐照损伤的一种表现形
式 , 它与细胞的死亡率成正相关 。 另一方面 , 从过
氧化物酶同工酶分析结果可 以看出 : 致死剂量 16 千
伦琴以上缺少原有三条主要谱带 中的 P x l和 P x 3
两条酶带 , 而仅有的一条 P x Z颜 色 加深 。 这表 明
P x l 和 P x 3对愈伤组织的生长和细胞 的正常 代谢
是必不可少的 , 而 P x Z的活性增加并 不 能弥补 由
于 P x l 和 P x 3活性丧失所产生的致死损伤 。 因此 ,
似可用过氧化物酶同工酶的酶谱特征作为试材致死
剂量的一个生化标志。
另外 , S iP e ge l一 R o y等闭用剂 旦 率 为 3 . 1千伦
琴 /小时的 1 . 6千伦琴剂量分别照射培养基和沙莫蒂
甜橙胚珠的愈伤组织后指出 , 照射培养基对愈伤组
织增重有间接影响 。但是 ,本试验的结果指出 , 在离
体组织或细胞进行辐照诱变时 , 培养基照射与否与
诱变效果无关 。
综上所述 , 将组织培养与人工诱变相结合 , 能
克服单纯诱变育种中不能解决的问题 , 能较快 、 较准
确地进行早期鉴定 , 选择突变体 , 从而为提高诱变
机率 , 加速培育柑桔新品种提供新途径 。
可
参 考 文 献
〔 1〕 王大元等 : 用组织 培养 法繁殖 柑 桔 , 《遗传学报 }),
1 97 5年 , 第 5 卷 , 第 2 期 , 第1 3 3一 1 37页
〔 2 〕 张进仁等 : 柑桔杂种同工酶的初步研究 , 《中国柑桔》 ,
1 9 8 3年 , 第 3 期 , 第 1 3一 15页
〔 3 〕 刘功弼 : 柑桔茎尖组织培养及其人工 诱变初报 , 《园
艺学报》 , 1 9 8 3年 , 第 10卷 , 第 4 期 , 第 27 7一2 8 0页
〔 4 ] SP i e g e l一R o y , P 。 e t a l . : S t im u la t i o 吐 o f d i f fe r e n -
t ia t i o n i几 o r a n g e o v u l a r e a ll u , i n r e la t io n t o
i r a d ia t io n o f t h e m e d i
a , R a d i
a t io n B o t a n y
-
1 9 7 3
, 13
*
97一 10 3
(
柑桔商品标准审定暨哈姆林甜橙鉴评会在福建召开
由中国农科院柑桔研究所主持的柑桔商品标准
审定和哈姆林甜橙选优单株鉴评会 , 于 1 9 8 6年 12 月
2一 8日在福建闽清一福州召开 。 到会的有福建 、 四
川 、 湖南、 江西、 浙江、 广西、 广东 、 贵州 、 云南 、
上海、 湖北等省 (市 ) 、 自治区的 1 46 位代表 , 农牧
渔业部科技司 、 中国农业科学院科研部的有关负责
同志出席了会议 。 会上 , 柑桔商品标准制定协作组
成员和专家评审组对锦橙 、 红桔 、 新会橙 、 雪柑 、
血橙 、 暗柳橙 、 脐橙 、 及橙 、 哈姆林甜橙 、 温州蜜
柑 (兴津 、 宫川、 尾张品系 ) 、 焦柑 、 搓柑 、 南丰蜜
桔 、 本地早 、 柠檬 、 沙田抽等 1 8个品种 (系 )鲜食果
实商品标准 , 从先进性 、 科学性和实用性方面进行
了评审 , 提出了审定意见 。 哈姆林甜橙选优单株鉴
评会对 5 8个样品进行了鉴评 , 其中连续两年性状优
异的 5个单株可望在全国推广 , 其他单株也有各 自
的特点 。 代表们希望继续抓好选优单株鉴评 , 为建
立不同层次的优良单株母本园奠定基础 , 为发展我
国橙汁原料基地作出贡献 。 (李安富 )