全 文 ：书文章编号:1674-7070(2013)04-0289-07
斜生栅藻对乙酰甲胺磷的急慢性毒性响应
陈敏东1，2 葛顺1，2 宋玉芝1，2 邱伟健1，2 周军英3
摘要
为了解有机磷农药乙酰甲胺磷污染
对本土水生敏感性物种斜生栅藻
(Scenedesmus obliquus)的毒性效应，在实
验室条件下采用静态毒性试验，研究了
乙酰甲胺磷对斜生栅藻 96 h急性毒性效
应，并在急性试验基础上进行慢性试验，
分析了斜生栅藻连续染毒 14 d的叶绿素
质量浓度、可溶性蛋白质量分数以及丙
二醛(MDA)质量摩尔浓度的变化． 结果
表明:乙 酰 甲 胺 磷 的 96 h EC50 为
482. 9 mg /L，属低毒农药，但在 1 mg /L
低质量浓度下可促进藻细胞生长;乙酰
甲胺磷对栅藻光合作用无明显影响，但
可通过干扰藻细胞代谢活动和引起膜脂
过氧化反应，对斜生栅藻产生毒性作用;
可溶蛋白和 MDA 可作为有效的生物标
志物对农药引起的毒性做出评价． 研究
结果可为本土水生敏感性物种的保护和
农药安全使用标准的制定提供理论
依据．
关键词
乙酰甲胺磷;斜生栅藻;EC50;叶绿
素 a;可溶蛋白;丙二醛
中图分类号 X173
文献标志码 A
收稿日期 2012-03-28
资助项目 公益性行业(环保)科研专项(2010-
09033)
作者简介
陈敏东，男，教授，主要研究方向为大气化
学及生态毒理． chenmd@ nuist． edu． cn
1 南京信息工程大学 环境科学与工程学院，
南京，210044
2 南京信息工程大学 江苏省大气环境监测与
污染控制高技术重点实验室，南京，210044
3 环保部南京环境科学研究所，南京，210042
0 引言
我国水生态基准的制定研究零星、分散，《地表水环境质量标准》
的标准值主要是参考美国各州、日本、前苏联、欧洲等国家及地区的
水质基准值和标准值来确定，没有考虑我国水生态系统的区域性特
征［1-2］．因此从维护我国水生态系统的长远利益来看，根据区域水体
的实际水质特性与水生态系统的结构特征制定相应的区域性水生态
基准或标准［3］，开展我国水质基准的研究意义重大［4-5］．
目前，越来越多的农药污染的报道已引起人们对水环境的关注，
特别是近几年来发生比较多的有机磷农药污染［6］，使得针对农药的
水环境基准研究已迫在眉睫．
藻类是水生生态系统的初级生产者，是评价水环境质量的重要
指标．斜生栅藻是一种广泛分布于温暖地区池塘、沟渠及河流中的淡
水单细胞绿藻，其生命力强、繁殖快，对环境条件变化反应敏感，在检
测污染物对水环境的影响时，通常把污染物对斜生栅藻的影响作为
测试的一项重要指标［7］． 本文通过对重点流域(长江三角洲流域)农
药生产及使用状况调查、农药暴露水平的模型预测和实际监测，选择
一种高效低毒有机磷农药———乙酰甲胺磷(acephate) ，在对斜生栅藻
急性毒性基础上，进一步对斜生栅藻进行系统完整的慢性毒性效应
试验，旨在为开展本土水生生物和有机磷农药品种筛选研究提供理
论和科学数据支持，为下一步开展毒性评价终点的深入研究和完成
重点有机磷农药品种水生态基准的制定工作提供参考．
1 材料和方法
1. 1 试验材料
斜生栅藻购自中国科学院水生生物研究所，编号为 FACHB416，
经实验室驯化培养后，选取对数生长期的藻种进行试验．
乙酰甲胺磷(体积分数 41%) ，由环保部南京环境科学研究所
提供．
1. 2 试验方法
1. 2. 1 急性毒性试验
试验参照 OECD［8］标准方法，以 BG11 为培养基，置于恒温光
照培养箱培养(光照强度 3 000 lx 左右，光暗时间比 12 h ∶ 12 h，温
度 25 ℃)［9-10］，每天定时摇动 4 次．正式试验采用国
际通用“瓶法”，500 mL 锥形瓶中接 200 mL 处于对
数生长期的藻液．根据预试验的结果，确定试验的质
量浓度范围，设置 5 个等差质量浓度梯度和一个空
白对照，每个处理设 3 个平行，然后向锥形瓶中添加
农药至相应质量浓度，空白 A的质量浓度为 0，处理
B、C、D、E、F 的质量浓度分别为 1、200、400、600 和
800 mg /L．
每天早上 9 点定时取样，一次取样 2 份，每隔
24 h取样 1 次，连续取样 5 d，分别记为 0、24、48、72
和 96 h．每份 1 mL，加水稀释定容至 10 mL，采用浮
游计数框［11-12］测定藻细胞密度，做藻细胞个数测定，
以 Trimmed Spearman-Karber 软件计算 24、48、72 和
96 h的 EC50 ．
1. 2. 2 慢性毒性试验
根据急性毒性试验结果，以
1
2 Q(96 h EC50)
［13］
为试验最高质量浓度，设置 5 个农药质量浓度等差
梯度组和 1 个空白对照组，并做空白试验，共设 3 个
平行组．然后向锥形瓶中添加农药至相应质量浓度，
空白 G的质量浓度为 0，处理 H、I、J、K 的质量浓度
分别为 48. 3、96. 6、144. 9、193. 1，处理 L 为 12 Q，单
位 mg /L．每天早上 9 点定时取样，一次取样 4 份，每
份 5 mL，每隔 48 h取样 1 次，连续取样 14 d，分别记
为 0、2、4、6、8、10、12 和 14 d． 其中第 1 份采用滤膜
差重法精确称量藻液的干质量，再按鲜藻含水质量
分数 90%换算藻的鲜质量［14］．
1. 2. 2. 1 叶绿素 a测定
第 2 份，用 47 mm 玻璃纤维滤膜过滤后对折放
入 10 mL离心管，保存在 － 20 ℃的冰柜中(此样品
最长冷冻 3 个月) ，叶绿素 a质量浓度测定采用热乙
醇萃取法［15］．
1. 2. 2. 2 可溶蛋白测定
第 3 份，冷冻离心(12 000 r /min)20 min，弃上
清液加 5 mL pH =7. 8 磷酸缓冲液，采用冰浴下超声
破碎［16-17］(超声 3 s停止 3 s，每 99 次换 1 次自制带
有离心管槽的冰杯，每次破碎 2 个) ，破碎完再次冷
冻离心(12 000 r /min)20 min取上清液即为粗酶液，
粗酶液用于可溶蛋白质量分数的测定，其可溶蛋白
测定采用 G-250 染色法［18］．
1. 2. 2. 3 MDA测定
第 4 份，用 10%(质量分数)的三氯乙酸代替
pH = 7. 8 磷酸缓冲液作为酶液提取液，其余步骤同
1. 2. 2. 2，粗酶液用于丙二醛(MDA)的测定，其丙二
醛测定采用硫代巴比妥酸法［18］．
2 结果与分析
2. 1 乙酰甲胺磷对斜生栅藻的急性毒性效应
用不同质量浓度乙酰甲胺磷分别处理藻类培养
液，以藻细胞密度为指标做生长曲线(图 1)． 由图 1
可见:对于农药乙酰甲胺磷，在低质量浓度1 mg / L
条件下，藻细胞数目呈增长趋势，且高于空白样，这
种现象与 Wong 等［19］发现溴谷隆在低于1 mg /L 时
能刺激栅藻的生长，2，4-D 和杀螟松在低浓度
(1 mg /L)时能促进莱哈衣藻生长，Doggett 等［20］发
现二嗪磷在 1 mg /L 时促进蛋白核小球藻和羊角月
芽藻的生长是一致的，可能原因是毒物在低质量浓
度下对微藻有“毒物兴奋效应”［21］，同时也可能是因
为本文选取的培养液 BG11 pH值在 7. 5 ～ 8. 5 之间，
呈弱碱性，对乙酰甲胺磷有一定的分解作用;可提供
藻细胞生长需要的营养元素 P，从而起一定的促进
作用;当农药质量浓度达到 600、800 mg /L 时，发现
在 24 h出现一低点，然后随处理时间延长藻细胞密
度上升，可以看出斜生栅藻仍能得到较好的恢复．但
可以发现:随着农药质量浓度的增大，藻细胞受到一
定的抑制作用，且随着农药质量浓度的升高，抑制现
象越来越明显，呈良好的浓度-剂量效应． 此外在显
微镜观察藻细胞形态结构过程中，发现当农药质量
浓度高时，可以观察到部分藻细胞体积增大，子细胞
发生畸形分裂，出现人字形和裤型，这种现象与其他
研究者发现 DBP 对栅藻细胞形态所产生的影响有
相似之处，说明它们均使斜生栅藻的生长与分裂产
生一定的解偶联作用［22］．
图 1 乙酰甲胺磷对斜生栅藻生长的影响
Fig． 1 Influence of acephate on growth of Scenedesmus obliquus
092
陈敏东，等．斜生栅藻对乙酰甲胺磷的急慢性毒性响应．
CHEN Mindong，et al． Acute and chronic response of Scenedesmus obliquus to acephate．
以 Trimmed Spearman-Karber 分析计算，确定各
时间(24、48、72 和 96 h)的 EC50值及其 95%置信区
间，如表 1 所示．
表 1 乙酰甲胺磷对斜生栅藻的 EC50
Table 1 EC50 of acephate to Scenedesmus obliquus
时间 /h EC50 /(mg /L) 95%置信区间 /(mg /L)
24 613. 0 550. 7 ～ 682. 3
48 667. 7 571. 3 ～ 780. 5
72 523. 0 488. 4 ～ 561. 1
96 482. 9 452. 2 ～ 515. 6
由表 1可知:乙酰甲胺磷对斜生栅藻24、48、72和
96 h EC50分别为 613. 0、667. 7、523. 0 和 482. 9 mg /L，
其 EC50值随处理时间先升后降，说明斜生栅藻在染
毒作用下短时间内有少许恢复，但最终仍体现出受
农药的胁迫作用．
2． 2 乙酰甲胺磷对斜生栅藻的慢性毒性效应
2. 2. 1 乙酰甲胺磷对斜生栅藻叶绿素 a的影响
用不同质量浓度乙酰甲胺磷分别处理藻类培养
液，经暴露 14 d，以叶绿素 a质量浓度为指标做生长
曲线(图 2)．由图 2 可见:乙酰甲胺磷对叶绿素 a 的
影响在同一质量浓度上，其叶绿素 a 质量浓度随着
染毒时间的增加呈递增趋势，但在同一时间段上，随
着农药质量浓度的增大，即增大到 1 /2 急性 EC50时，
也无明显的变化趋势，且实验值均与对照样接近，整
体表现出无明显的毒物效应，但是在质量浓度 1 mg /L
处理条件下，叶绿素 a有微弱上升的趋势，表现出轻
微的诱导效应，这一现象与前面的低浓度下促进藻
细胞生长是一致的．
图 2 乙酰甲胺磷对斜生栅藻叶绿素 a的影响(2 ～ 14 d)
Fig． 2 Influence of acephate on content of chlorophyll a(2 － 14 d)
2. 2. 2 乙酰甲胺磷对斜生栅藻可溶蛋白的影响
经暴露 14 d，以可溶蛋白质量分数为指标做生
长曲线(图 3)．由图 3 可知:在处理 2 d后，斜生栅藻
的可溶蛋白质量分数与对照组相比，均有显著增高，
呈先上升的趋势，当乙酰甲胺磷质量浓度为 241. 4
mg /L时，可溶蛋白质量分数为 10. 6 mg /g 达到最高
点;处理 4 d变化趋势与 2 d相似，亦呈上升趋势，且
也在 241. 4 mg /L质量浓度时，可溶蛋白质量分数达
到最高点为 16. 3 mg /g，表现出很好的浓度诱导效
应，这与卢晶等［23］发现四羟甲基硫酸鏻促进铜绿微
囊藻可溶性蛋白质量分数升高一致;随着处理时间
的延长，当处理质量浓度为中等水平时，可溶蛋白质
量分数已达到最高点，其后有下降趋势;当处理时间
为 14 d时，发现可溶蛋白质量分数曲线较12 d升高，
本文认为可能是因为农药降解，毒性降低所引起的
促进作用．
2. 2. 3 乙酰甲胺磷对斜生栅藻 MDA的影响
图 4 研究发现，在乙酰甲胺磷农药处理条件
下，每个时间段内栅藻 MDA 质量摩尔浓度呈上升
的趋势，与对照组相比，均有显著提高，表现出很好
的浓度诱导效应． 在处理时间 6 d 时，不同质量浓
度处理后 MDA质量摩尔浓度均达到该浓度点的最
高值，且在 6 d，处理 J时，达到整个实验中最大值
192
学报:自然科学版，2013，5(4) :289-295
Journal of Nanjing University of Information Science and Technology:Natural Science Edition，2013，5(4) :289-295
图 3 乙酰甲胺磷对斜生栅藻可溶蛋白的影响(2 ～ 14 d)
Fig． 3 Influence of acephate on content of soluble protein(2 － 14 d)
图 4 乙酰甲胺磷对斜生栅藻 MDA的影响(2 ～ 14 d)
Fig． 4 Influence of acephate on content of MDA(2 － 14 d)
为 235. 5 μmol /g．从前后时间上纵向分析 MDA质量
摩尔浓度曲线，表现出其随时间的延长呈先上升后
下降的趋势．前期上升的原因可能是脂质过氧化反
应造成其产物 MDA的大量积累引起的，而后期下降
可能是因为长时间的胁迫作用造成生物膜的损伤，
乃至引起藻细胞的大量死亡引起的，这与马剑敏
等［24］溴化 1-己基-3-甲基咪唑对斜生栅藻 MDA质量
摩尔浓度影响是一致的．
3 讨论
本文选择栅藻起始密度约为 4 × 106 mL －1，培养
96 h后藻细胞密度与初始密度相比增值比例约为 4
倍，其栅藻细胞密度能达到 1. 5 × 107 mL －1，说明栅藻
在该初始密度较高的条件下仍能很好地繁殖生长．牟
文等［25］也以藻细胞约为3. 9 ×106 mL －1的初始密度进
行重金属对斜生栅藻的毒性研究．藻细胞初始密度较
低会导致后期试验中其他生化指标测定不明显．
292
陈敏东，等．斜生栅藻对乙酰甲胺磷的急慢性毒性响应．
CHEN Mindong，et al． Acute and chronic response of Scenedesmus obliquus to acephate．
国内外藻类毒性试验中需要提交杀虫剂对绿藻
的实验材料，故本文选择长江三角洲地区使用残留较
多、污染较重的杀虫剂乙酰甲胺磷为目标农药．目前，
已有大量关于农药对斜生栅藻毒性研究的报道，农药
对藻类细胞造成的损害，主要表现为对藻类的杀灭性
和对生长的抑制作用，以 EC50值表示．根据《水和废水
检测分析方法》［26］中规定，乙酰甲胺磷对斜生栅藻的
96 h EC50 =482. 9 mg /L ＞100 mg /L，属于低毒农药．
叶绿素是各种浮游藻类中广泛存在的天然色素，
其中叶绿素 a存在于所有的浮游藻类中，大约占有机
物干质量的 1% ～2%，是估算浮游植物生物量的重要
指标［27］．本文选择误差较小的热乙醇法萃取法测定
叶绿素 a质量浓度，保证了实验数据的可靠性．同时
叶绿素质量浓度也是客观反映植物利用光照能力的
一种重要指标，往往作为判断植物光合能力强弱，反
映环境胁迫状况的依据［28］，但从实验中发现杀虫剂
乙酰甲胺磷对斜生栅藻叶绿素 a 的抑制并不明显，可
以说明该农药对栅藻的光合作用无明显影响，叶绿素
a在该毒性试验中不能作为一个有效的毒性效应敏感
指标．
蛋白质是细胞中重要的结构物质，其功能是细胞
代谢过程中的催化剂．蛋白质质量分数变化可以反映
细胞内代谢活动是否正常［29］，经不同质量浓度的乙
酰甲胺磷处理后，各组斜生栅藻细胞可溶性蛋白质量
分数较对照组均有提高，说明乙酰甲胺磷能够刺激藻
细胞蛋白合成，干扰藻细胞蛋白代谢平衡．
MDA作为脂质过氧化反应的产物之一，可以用
来度量过氧化反应的程度［30］．因此可以认为，农药的
胁迫造成了自由基的大量产生，从而在分子水平上快
速而高效地动员了藻细胞的防御反应．本文的试验结
果表明:MDA 质量摩尔浓度在短时间的农药处理下
均有极显著增高，说明农药胁迫已经引起了自由基的
大量产生，对细胞的膜系统造成了广泛的损伤，引起
膜脂的过氧化反应，从而造成了 MDA质量摩尔浓度
的显著增高;同时，长时间处理下，藻 MDA 质量摩尔
浓度的普遍降低很可能暗示长时间的胁迫已经对斜
生栅藻的细胞造成了实质性的损伤，已接近藻细胞负
荷的极限，以至藻细胞功能无法完全恢复，这与前面
发现乙酰甲胺磷干扰藻细胞代谢活动，从而对藻细胞
产生毒性作用是相一致的．
本实验是在室内模拟条件下进行的，没有考虑生
物体组织、细胞或基因水平的改变，拟继续开展农药
对斜生栅藻组织水平和分子水平的评价终点研究．另
外，关于农药品种的性质及对水生藻类作用机理还有
待进一步研究和探讨．
4 结论
1)乙酰甲胺磷的 96 h EC50为 482. 9 mg /L，为低
毒农药，在 1 mg /L质量浓度下可促进藻细胞生长．
2)慢性毒性试验中，乙酰甲胺磷对栅藻光合作
用无明显影响，但通过干扰藻细胞代谢活动和引起膜
脂过氧化反应，对斜生栅藻产生毒性作用．
3)可溶蛋白和 MDA 可作为有效的生物标志物
对农药引起的毒性做出评价．
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Acute and chronic response of Scenedesmus obliquus to acephate
CHEN Mindong1，2 GE Shun1，2 SONG Yuzhi1，2 QIU Weijian1，2 ZHOU Junying3
1 School of Environmental Science and Engineering，Nanjing University of Information Science ＆ Technology，Nanjing 210044
2 Jiangsu Key Laboratory of Atmospheric Environment Monitoring and Pollution Control，
Nanjing University of Information Science ＆ Technology，Nanjing 210044
3 Nanjing Institute of Environmental Sciences，SEPA，Nanjing 210042
Abstract In order to understand the toxic effects of the pollution by organophosphorus pesticide as acephate on the
local aquatic sensitive species as Scenedesmus obliquus，under laboratory conditions，based on the static toxicity test，
the acute toxic effects of acephate on Scenedesmus obliquus for 96 hours were investigated in this paper． And based
on the acute test，the chronic experiments including the 14 days changes of chlorophyll a，soluble protein and MDA
in Scenedesmus obliquus were analyzed． It shows that:the 96 h EC50of acephate is 482. 9 mg /L，which belongs to the
low-toxic pesticide and the growth of Scenedesmus obliquus could be promoted with 1 mg /L of acephate;no signifi-
cant effect is showed on the photosynthesis of Scenedesmus obliquus，but the toxic effects are exposed by acephate
through interfering the algaes metabolic activities and causing membrane lipid peroxidation;the soluble protein and
MDA could be used as valid biological markers for evaluating the toxicity of pesticide． The results in this paper
could be considered as the theoretical basis for protecting local aquatic sensitive species and establishing the criteri-
on on safe use of pesticide．
Key words acephate;Scenedesmus obliquus;EC50;chlorophyll a;solute protein;MDA
592
学报:自然科学版，2013，5(4) :289-295
Journal of Nanjing University of Information Science and Technology:Natural Science Edition，2013，5(4) :289-295