全 文 ：浙贝母生物碱提取工艺研究
王忠华1 ,史姗姗 1 ,陈 雨 1 ,沈晓霞2
(1.浙江万里学院生物技术研究所 ,浙江 宁波 315100;2.浙江省中药研究所 ,浙江 杭州 310023)
摘要 本文分别采用超声波辅助提取法和摇床振荡(浸提)法提取浙贝母生物碱 ,通过提取率的比较进行浙贝
母生物碱最佳提取工艺的研究 , 包括提取溶媒 、料液比 、提取时间 、超声波功率等。结果表明 , 浙贝母生物碱的最佳
提取工艺条件为以 80%的乙醇为溶媒 , 10倍的料液比 , 在 1280w的超声波功率下提取 180s。此时生物碱的提取率
为 0.0115%。尽管超声波法提取的生物碱得率与传统的摇床浸提法相比 , 差异不显著 ,但该方法更快速且成本低 ,
可作为浙贝母生物碱的提取方法。
关键词 浙贝母;生物碱;超声波提取
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)01-0128-05
收稿日期:2009-09-08基金项目:浙江省重大项目资助(2009C12088)作者简介:王忠华(1972-),男,博士 ,副教授 ,主要从事中药材生物技术育种研究;Tel:13805864529, E-mail:wang1972@zwu.deu.cn。
浙贝母(FritilariathunbergiMiq)为百合科贝
母属多年生草本植物 ,是 “浙八味 ”中最主要的中药
之一 ,其鳞茎具有清热化痰 、止咳 、开郁 、散结之功 ,
用于热痰咳嗽 、肺痈 、乳痈 、痰核等多种病症的治
疗 〔1〕。对于浙贝母化学成分的研究始于 1923年 ,到
60年代末 ,从浙贝母中共分得十几种生物碱 ,但限
于当时的技术条件 ,仅确定了贝母甲素(peimine)、
贝母乙素(peiminine)和贝母辛(peimissine)等的结
构 。 80年代从浙贝母中又分出 isopeiminine、贝母乙
素的两个异构体和贝母甲素 、乙素的氮氧化物 ,以及
西藜芦碱类生物碱 〔2〕。生物碱大多具有天然的生
理活性 ,是多种中草药及药用植物的有效成分 ,本实
验研究了超声波法和浸提法提取浙贝母生物碱的最
佳工艺 ,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料 浙贝母鳞茎采自浙江省宁波市鄞州区
樟村贝母基地 ,用蒸馏水漂洗数次 , 80℃强风烘干 ,
万能高速粉碎机粉碎 ,过 60目筛 ,得干燥的浙贝母
粉末 ,备用。标准对照品浙贝甲素购自浙江省药品
检验所(批号:110750)。
1.2 实验方法 工艺流程:浙贝母※选择 、烘干
※粉碎※过筛※生物碱提取(其中分别用摇床振动
法和超声波处理)※过滤※粗液蒸干※2%盐酸溶
液※氨水调节 pH值※氯仿萃取 3次※氯仿蒸干※
紫外可见分光光度计测 OD值※比较得出最优工艺
条件。
1.2.1 对照品溶液的制备:精密称取 1.8 mg浙贝
素甲于 50 mL容量瓶中 ,用氯仿溶解并定容 ,得
36μg/mL的贝母素甲标准溶液 。
1.2.2 标准曲线的绘制:精密吸取贝母素甲溶液
0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0 mL分别置于 6只 100
mL的具塞锥形瓶中 ,分别加入 9.5、9.0、8.5、8.0、
7.5、7.0mL氯仿 ,再分别加入 5.0 mL蒸馏水和 2.0
mLpH4.5的 0.04%溴甲酚绿缓冲液 ,密塞 ,剧烈振
摇 30 min后 ,移入 60 mL分液漏斗中 ,静置 0.5 h。
取 5 mL下层氯仿液置于已加入了 1.0 mL的 0.001
mol/L氢氧化钾的无水乙醇溶液的具塞刻度试管
中 ,摇匀 ,随行空白对照 。最后 ,在 618nm处测定吸
光度 ,并用最小二乘法 ,以吸光度值为纵坐标 ,溶液
浓度为横坐标 ,即可得回归方程 〔3〕。最终得到的回
归方程为:y=0.0041x+0.009, 相关系数 R2 =
0.9927,线性范围为 1.8 ～ 10.8 μg/mL。
1.2.3 摇床振荡(浸提)法:称取 2g浙贝母粉末 ,
置于 100mL具塞锥形瓶中 ,加入 40 mL80%乙醇 ,
摇床振荡提取 24 h,转速为 130 r/min,用中速定性
滤纸进行过滤 ,得到粗液 ,加热使醇提液挥发蒸干 ,
再加入 20mL2%的盐酸 ,溶解 ,过滤 ,滤液用氨水调
pH值至 11,然后再氯仿萃取 3次 ,每次 10mL,萃取
液蒸干 ,得到浸膏 ,最后用氯仿定容至 1mL。再用分
光光度计在 618 nm下测其吸光度 ,按照标准曲线得
到的回归方程换算出生物碱的含量〔4〕。
1.2.4 超声波法:称取 2 g浙贝母粉末 ,置于 100
mL具塞锥形瓶中 ,加入 40 mL80%乙醇 ,在超声波
仪处理中 ,用中速定性滤纸进行过滤 ,得到粗液 ,加
热使醇提液挥发蒸干 ,再加入 20mL2%的盐酸 ,溶
解 ,过滤 ,滤液用氨水调 pH值至 11。然后用氯仿萃
取 3次 ,每次 10 mL,萃取液蒸干 ,得到浸膏 ,最后用
氯仿定容至 1mL。再用分光光度计在 618 nm下测
其吸光度 ,按照标准曲线得到的回归方程换算出生
物碱的含量〔5〕。
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.01.044
2 结果与分析
2.1 摇床振荡(浸提)法的单因素实验
2.1.1 不同乙醇浓度对生物碱提取率的影响:本
实验采用 30倍液料比 ,提取时间为 24 h,用不同的
溶媒摇床振荡提取:60%乙醇 、70%乙醇 、80%乙醇 、
95%乙醇。结果见图 1。
图 1 不同乙醇浓度对生物碱提取率的影响
由图 1可见 ,随着乙醇浓度的升高 ,生物碱的提
取率也随之升高 ,但当浓度超过最适浓度 80%时 ,
提取率反而降低 。因为当乙醇浓度升高时 ,溶入有
机溶剂的生物碱的量也越多 ,但当浓度升高至超过
最适浓度时 ,其他物质也被提取出来 ,而且已经溶出
的生物碱也有可能因为浓度的加大 ,反而溶解在了
溶剂中 ,从而影响了浙贝母生物碱的提取率 ,使得提
取率随着浓度的升高下降〔6〕。由此可认为浙贝母
生物碱常规浸提法的最适提取浓度为 80%的乙醇 。
有报道表明 ,甲醇的提取率虽然也比较高 ,但因其对
人体有一定的毒性 ,故本实验不采取用甲醇当溶媒
来提取的方法。
2.1.2 不同提取时间对生物碱提取率的影响:本
实验用 80%的乙醇作溶媒 , 30倍液料比 ,在不同的
提取时间下摇床振荡提取:1 h、12 h、24 h、36 h、48
h。结果见图 2。
图 2 不同提取时间对生物碱提取率的影响
由图 2可知 ,随着提取时间的延长 ,生物碱的提
取率也随之升高 ,但当时间超过 24 h时 ,提取率反
而有所降低 。因为 ,当时间延长时 ,溶入有机溶剂的
生物碱量也随之增多 ,但当时间超过最适提取时间
时 ,生物碱会少量的溶于提取剂中 ,反而影响了浙贝
母生物碱的提取率 ,使得提取率随着时间的延长而
下降 。由此认为 ,浙贝母生物碱常规浸提法的最适
提取时间为 24 h。
2.1.3 不同液料比对生物碱提取率的影响:本实
验采用 80%的乙醇做溶媒 ,提取时间为 24 h,在不
同的液料比下摇床振荡提取:10倍 、20倍 、30倍 、40
倍 、50倍 ,结果见图 3。
图 3 不同液料比对生物碱提取率的影响
由图 3可知 ,随着液料比的增加 ,生物碱的提取
率也随之升高 ,但当液料比超过最适液料比(30倍)
时 ,提取率反而降低 。这是因为 ,当液料比升高时 ,
细胞里的生物碱更容易溶入到有机溶剂中 ,生物碱
的提取率也就相应提高了 ,但当液料比升高直至超
过最适液料比时 ,其他的物质也相继溶入到了有机
溶液中 ,反而影响了浙贝母生物碱的提取率 ,使得提
取率随着液料比的升高而下降 〔7〕。由此可以认为 ,
浙贝母生物碱常规浸提法的最适提取液料比为 30
倍。
2.2 超声波法的单因素实验
2.2.1 不同乙醇浓度对生物碱提取率的影响:本
实验采用功率 800W, 30倍液料比 ,提取时间为 140
s,用不同溶媒超声波法提取:60%乙醇 、70%乙醇 、
80%乙醇 、95%乙醇 。结果见图 4。
图 4 不同乙醇浓度对生物碱提取率的影响
由图 4可知 ,随着乙醇浓度的升高 ,生物碱的提
取率液随之升高 ,但当浓度超过最适浓度 80%时 ,
提取率反而降低。究其原因 ,当浓度升高时 ,溶入有
机溶剂的生物碱量也就越多 ,但当浓度升高至超过
最适浓度时 ,其他物质也被提取出来 ,而且已经溶出
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的生物碱也有可能因为浓度的加大 ,反而溶解在了
溶剂中 ,从而影响了浙贝母生物碱的提取率 ,使得提
取率随着浓度的升高反而下降。由此可认为 ,超声
波辅助法提取生物碱的溶媒应采用 80%乙醇为宜 。
2.2.2 不同提取时间对生物碱提取率的影响:本
实验采用功率 800 W,溶媒为 80%乙醇 , 30倍液料
比 ,在不同的提取时间下超声波法提取:20 s、60 s、
100s、140 s、180 s、220s。结果见图 5。
图 5 不同提取时间对生物碱提取率的影响
由图 5可知 ,随着超声波作用时间的延长 ,生物
碱的提取率也随之升高 ,但当提取时间超过 180 s
时 ,提取率反而有所降低 。这是因为 ,当时间延长
时 ,溶入有机溶剂的生物碱的量也随之增多 ,但当时
间超过最适提取时间时 ,虽然超声波法的作用时间
增强 ,可导致其对细胞的破坏效率加大 ,可是此时 ,
其他的化学物质也会随之溶解到溶液中 ,而且 ,原先
提取的生物碱会因时间的延长而少量的溶于提取溶
剂中 ,因此反而影响了生物碱的提取率 ,使得提取率
随着时间的延长而下降。由此认为 ,浙贝母生物碱
超声波辅助法的最适提取时间为 180 s。
2.2.3 不同液料比对生物碱提取率的影响:本实
验采用功率 800 W,溶媒为 80%的乙醇 ,提取时间
为 140s,分别用 10倍 、20倍 、30倍 、40倍 、50倍的
液料比进行超声波法提取 ,结果如图 6所示。
图 6 不同液料比对生物碱提取率的影响
由图 6可知 ,随着液料比的增加 ,生物碱的提取
率也随之升高 。但当液料比超过最适比例(30倍)
时 ,提取率反而降低了 。这是由于当液料比升高时 ,
溶入有机溶剂的生物碱量也相应增加 ,但当液料比
升高至超过最适比例时 ,其他物质也溶入到有机溶
剂中 ,此时反而影响了浙贝母生物碱的提取率 ,使得
提取率随着液料比的升高而下降 。由此可以认为 ,
浙贝母生物碱超声波辅助法的最适提取液料比为
30倍。
2.2.4 不同功率对生物碱提取率的影响:由于超
声波具有空化作用 、超声波机械机制和热学机理 ,能
使细胞之间介质的运动加快 ,从而加速细胞壁的破
裂 ,使生物碱能更快速的进入到有机溶剂中。但关
于多少功率最适合生物碱提取的报道并不是很多 ,
因此本实验经由多种超声波功率作用于浙贝母粉溶
液 ,最后比较得出超声波功率的最佳输出值 。
本实验采用溶媒为 80%的乙醇 ,提取时间为
140 s,液料比为 20倍 ,分别在 800 W、1040 W、1280
W、1520W、1760 W的超声波功率下提取 ,结果见图
7。
图 7 超声波不同功率对生物碱提取率的影响
由图 7可知 ,随着提取功率的加大 ,生物碱的提
取率也随之升高 ,但当功率超过 1280 W时 ,提取率
反而有所降低 。这是因为 ,当功率加大时 ,溶入有机
溶剂的其他有机溶质也随之增多 ,但当功率超过最
适提取功率时 ,虽然超声波的破壁功能加大了 ,但超
声波也会破坏生物碱 ,使之溶解到有机溶剂中。这
样 ,反而影响了浙贝母生物碱的提取率 ,使得提取率
随着提取功率的加大而下降 〔8〕。由此可以认为 ,浙
贝母生物碱超声波辅助法的最适提取功率为 1280
W。
从浙贝母生物碱提取的单因素实验中可以看
出:当利用摇床振荡法提取时 , 其最佳工艺为以
80%的乙醇为溶媒 , 30倍的液料比下摇床振荡提取
24h;当利用超声波法辅助提取时 ,其最佳工艺条件
为以 80%的乙醇为溶媒 , 30倍的液料比下 ,以超声
波输出功率 1280 W提取 180s。
2.3 摇床振荡(浸提)法的正交试验 依据表 1的
因素水平 ,采用摇床振荡(浸提)法提取浙贝母鳞茎
生物碱 ,并测其吸光度〔9〕 ,再依照标准曲线得出浙
贝母生物碱的浓度 ,并以此为标准得出超浸提法提
取浙贝母生物碱的最优条件 。结果见表 2。
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表 1 浸提法因素水平表
水平 因素A乙醇浓度 /% B提取时间 /h C液料比 /倍
1 70 24 10
2 80 36 20
3 95 48 30
表 2 浸提法的正交试验结果
试验号 A B C 生物碱浓度/(μg/mL)
1 1 1 1 200.00
2 1 2 2 200.32
3 1 3 3 232.03
4 2 1 2 261.87
5 2 2 3 284.39
6 2 3 1 225.85
7 3 1 3 263.33
8 3 2 1 195.61
9 3 3 2 205.12
K
1 632.36 725.20 621.46
K
2 772.11 680.33 667.32
K3 664.07 663.01 779.76
k1 261.73 241.73 207.15
k1 308.32 226.78 222.44
k3 272.30 221.00 259.92
R 46.59 20.73 52.76
正交试验的结果表明 ,摇床振荡(浸提)法提取
浙贝母生物碱时 ,其最佳工艺条件是 A2B2C3。也就
是当浙贝母粉溶解在 80%的乙醇中 ,在 30倍的液
料比下 ,摇床振荡提取 36h,得到的等量溶液中生物
碱的浓度最高。由 R值分析可得 ,影响生物碱提取
效率的 3个主要因素的主次顺序为 C>A>B。当
液料比为 30倍时 ,生物碱的提取率最大 ,液料比过
多或过少时 ,生物碱的提取率反而会下降;乙醇的浓
度为 80%时 ,生物碱的提取率最高 ,过高或过低都
不利于提取的最佳效率;提取时间则以 24 h为宜 ,
时间过长或过短都不利于生物碱的提取 〔10〕。
2.4 超声波法的正交试验 依据表 3的因素水
平 ,采用超声波辅助法提取浙贝母鳞茎生物碱 ,并测
定其吸光度 ,再依照标准曲线得浙贝母生物碱的浓
度 ,并以此为标准得出超声波法提取浙贝母生物碱
的最优条件 。结果见表 4。
正交试验的结果表明 ,超声波法提取浙贝母生
物碱时 ,其最佳工艺条件是 A2B3C1D2。也就是当浙
贝母粉溶解在 80%的乙醇中 ,在 10倍的液料比下 ,
超声波 1280 W功率提取 180 s,得到的等量溶液中
生物碱的浓度最高 ,这与俞丹等报道的黄柏总生物
碱提取工艺类似〔11〕。超声波输出功率为 1280W时
生物碱的提取率最大 ,之后 ,随着功率的增加或减
少 ,生物碱的提取效率逐渐降低;当液料比为 10倍
时 ,生物碱的提取率最大 ,液料比过多或过少时 ,生
物碱的提取率反而下降;超声波辅助提取的溶媒应
以 80%的乙醇为宜 ,当乙醇浓度过高或过低时 ,浙
贝母生物碱的提取率都不是很高 ,这与摇床振荡法
提取的正交试验结果相似;超声波提取时间以 180 s
为宜 ,时间过长或过短都不利于生物碱的提取 ,这类
似于郑少泉等对超声波法提取龙眼多糖工艺的报
道〔12〕。
表 3 超声波法因素水平表
水平
因素
A乙醇浓度 /% B提取时间 /h C液料比/倍 D功率/W
1 70 100 10 1040
2 80 140 15 1280
3 95 180 20 1520
表 4 超声波法的正交试验结果
试验号 A B C D 生物碱浓度 /(μg/mL)
1 1 1 1 1 246.04
2 1 2 2 2 308.35
3 1 3 3 3 310.67
4 2 1 2 3 294.63
5 2 2 3 1 324.45
6 2 3 1 2 364.39
7 3 1 3 2 334.70
8 3 2 1 3 274.39
9 3 3 2 1 274.09
K1 865.06 875.37 804.82 844.57
K2 983.48 987.20 957.07 1007.44
K3 883.17 869.15 969.82 879.70
k1 288.35 291.79 268.27 281.52
k2 341.16 342.40 322.36 349.15
k3 294.39 289.72 323.27 293.23
R 52.81 52.68 55.00 67.63
3 结论与讨论
3.1 两种方法最优提取条件下的比较 本实验比
较了常规浸提法与超声波辅助法在最佳提取条件下
浙贝母生物碱的得率情况 , 结果常规浸提法为
0.0077%,超声波辅助法为 0.0115%,可见 ,无论是
常规浸提法还是超声波辅助法 ,浙贝母生物碱提取
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的量都不是很多 。但从两种不同辅助方法的最佳工
艺中可以看出 ,利用超声波辅助法提取生物碱的提
取时间 ,液料比都优于传统的浸提法。而且超声波
辅助法提取生物碱的量要略多于常规浸提法。
3.2 浙贝母生物碱超声波辅助法最优提取工艺
本实验结果表明 ,浙贝母生物碱超声波辅助法提取
工艺的最佳条件为:80%乙醇为溶媒 、10倍液料比 、
1280W超声波输出功率和超声波处理时间 180 s。
与传统浸提法相比 ,超声波辅助法大大缩短了提取
时间 ,提高浙贝母生物碱的提取率 ,这是因为超声波
具有空化效应 、机械效应及热效应的特点 ,这些作用
增大了介质分子的运动速度 ,提高了介质的穿透能
力 ,促进了药物有效成分的溶解及扩散。本实验还
发现 ,超声波法提取浙贝母生物碱的另一个优点是
减少了液料比 ,因此在提高效率的同时 ,更节约提取
成本。这在当今注重效率 、注重利润的工业社会来
说 ,是一个很大的优势 。同时 ,由于超声波作用时无
需加热 ,因此 ,在提高热敏性生物碱提取率的同时 ,
对其生理活性基本没有影响。鉴于超声波提取的优
点 ,建议将其引入到浙贝母生物碱的工业提取 。当
然 ,大规模工业化提取工艺需要进一步的研究 。
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国产巴西人参提取工艺研究
蓝鸣生1 ,陈 路 1 ,王 硕 1 ,陈月升2
(1.广西药用植物园 ,广西 南宁 530023;2.广西中医学院 ,广西 南宁 530001)
摘要 目的:摸索国产巴西人参药材的最佳提取工艺。方法:采用正交试验法 ,以乙醇提取物和有效成分(提
取物水解后齐墩果酸的量为标识)收率为指标 , 对国产巴西人参的乙醇提取工艺进行优选 ,同时也对醇提后的药渣
是否有必要进一步提取进行研究。结果:国产巴西人参药材的最佳乙醇提取工艺为:提取乙醇浓度为 70%, 提取方
式为分两次提取 , 首次加醇量为药材的 16倍(v/m, 下同), 提取 1 h:二次加醇量为药材的 10倍 , 提取 1 h。提取后
的药渣进一步提取处理 , 提取物水解后齐墩果酸含量和提取的固溶物收率都非常低。结论:前述最佳乙醇提取工
艺提取物的醇溶物得率 、主要有效化学成分含量最高 , 提取后的药材无需进一步提取处理 ,可作为国产巴西人参的
生产提取工艺。
关键词 国产巴西人参;齐墩果酸;提取工艺
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)01-0132-04
收稿日期:2009-09-18作者简介:蓝鸣生(1957-),男,副主任药师 ,从事新药开发 、药学和植物化学研究工作;Tel:13977104998、 0771-5602461, E-mail:lanmingsh-eng@126.com。
·132· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 1期 2010年 1月