全 文 ：　　 ＊国家高技术发展计划(863)课题(2001AA621090)资助;广西科学基金(桂科基 0236011)资助;青岛市科技计划项目
(03-21-JSH-02)资助。李文红 , 副教授 ,博士 , E-mail:whli66@163.com
1)通讯作者:段德麟 ,博士 , 研究员 ,博士生导师 , E-mail:dlduan@ms.qdio.ac.cn
收稿日期:2004-02-06 ,收修改稿日期:2004-12-29
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)选育品系
及其野生型的 ISSR指纹分析＊
李文红　姚建亭 　王继成 　王如才 　段德麟 1)
(中国科学院海洋研究所　青岛　266071;广西大学水产系　南宁　530005)
(中国科学院海洋研究所　青岛　266071;中国科学院研究生院　北京　100039)
(中国科学院海洋研究所　青岛　266071)
(中国海洋大学水产学院　青岛　266003)
提要　　采用 ISSR标记对龙须菜一个野生型群体和选育品系两个不同年代的栽培群体 ,进行
了亲缘关系分析 ,构建了龙须菜选育品系的指纹图谱。通过实验从 22个 ISSR引物中筛选出
16条引物 ,可以产生清晰稳定及可重复的带 ,共扩增出 118个位点;野生型和选育品系两个群
体的遗传相似率分别为 0.7301 、0.7189 ,选育品系的两养殖种群间的遗传相似率为 0.9375;遗
传距离聚类分析证明 ,龙须菜选育品系与其青岛野生型亲缘关系很近 。7条引物产生的 12条
特异片段可用于龙须菜选育品系的种质鉴定 ,每条引物都能将龙须菜选育品系和其野生型分
开;根据引物 S848扩增的位点构建了指纹图谱 ,可用于区分龙须菜选育种群及野生种群 。
关键词　　龙须菜 ,红藻 ,亲缘关系分析 ,种质鉴定 ,指纹图谱 , ISSR
中图分类号　　Q75
　　龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是红藻门
(Rhodophyta)、杉 藻 目 (Gigartinales)、江 蓠科
(Gracilariaceae)、江蓠属(Gracilaria)的一个种 ,可
进行大规模生产养殖 ,作为提取琼胶的原料 ,也可
作为生物滤器用于改善 、修复富营养化的海水养
殖水域(杨红生等 , 2003)。有关江蓠种苗的研
究 ,前期不少科技人员做了大量工作 ,旨在希望获
得养殖生产所需的大量种苗 。陈美琴等(1985 ,
1987)曾对江蓠种苗的早期发育及温度的影响做
了研究 ,任国忠等(1988)研究了温度对细基江蓠
繁枝变型生长的影响 ,李纫芷(1999)运用组织培
养 ,研究龙须菜匍匐组织可作为潜在种苗的可能
性及其生理特性 ,刘静雯等(2004)对细基江蓠繁
枝变型铁限制的生理生态学反应进行了研究 。
自从龙须菜全人工养殖获得成功以后 ,优良
品种的选育及繁育是面临的重要课题。以四分孢
子及果胞子采苗 ,用作龙须菜的养殖生产 ,所需要
的时间至少要 3年以上 ,难以满足养殖生产的需
要。因此 ,解决龙须菜种苗的来源及龙须菜优良
品系的选育是开展大规模人工养殖的关键 。作者
所在的研究小组经过十多年的努力 ,通过龙须菜
青岛野生型的驯化 ,再经过杂交及选育 ,结合组织
培养及繁殖 ,获得了具有生长速度快 、琼胶强度高
的龙须菜优良品系 。目前 ,在辽宁 、山东 、江苏 、浙
江 、福建及广东沿海进行了人工养殖 ,其目标性状
表现稳定 ,有良好的养殖前景 。
龙须菜生态变型的现象很普遍。由于其栽培
群体绝大多数以无性繁殖获得种苗 ,这使得龙须
菜栽培群体在生长过程中会逐渐形成相似的表观
特征 。仅靠龙须菜外部形态和生殖结构等特征 ,
难以对其同种材料不同来源的种苗进行区分。因
此 ,有必要建立有效的分子标记鉴定方法 ,来对其
第 36 卷　第 3期 海　洋　与　湖　沼 Vol.36 , No.3
2 0 0 5 年 5 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA May , 2 0 0 5　
种苗进行鉴定 ,同时对养殖种群的遗传与变异进
行分析。
ISSR(Inter Simple Sequence Repeats , 简单重复
序列区间)标记技术已广泛用于高等植物遗传多
样性和种质鉴定的研究(钱韦等 , 2000)。由于
ISSR具有与 RAPD 技术同样简便的操作 ,更高的
DNA多态性检测能力 ,可以排除细菌 DNA污染等
特点 ,尤其适合真核经济海藻的研究 。但迄今为
止 , ISSR用于海藻研究的报道还很少 ,国内仅见
用 ISSR技术对江蓠属不同种进行相似性分析的
报道(孙雪等 , 2003)。
本实验采用 ISSR技术研究龙须菜不同群体
之间的 DNA多态性 ,分析其选育品系与野生型之
间的亲缘关系 ,并构建龙须菜选育品系的 ISSR指
纹图谱 ,旨在建立龙须菜养殖群体的分子标记特
征 ,更好地用于其种苗检测 ,同时建立与龙须菜快
速生长性状相关联的连锁标记 ,为其分子标记辅
助选育打下基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料及引物
实验所用藻类样品均是无囊果的无性新鲜营
养体为材料 。每群体取 12个样本 ,龙须菜野生群
体 ,2003年春采自青岛市湛山湾;龙须菜选育材
料采自连云港养殖的群体(本实验室培育的龙须
菜品系),分别于 2000年春及 2003年春采集 。采
样时将有同一附着点的藻体视为一个个体;无附
着点的采用分隔距离采样 ,将每个采样点不同的
营养枝顶端的嫩枝芽剪下混合视为一个个体样
品。选择无性的细基江蓠群体作外类群对照 。用
于 ISSR反应的引物和试剂均购自及合成于上海
Sangon公司 。
1.2　基因组 DNA的提取
采用北京鼎国生物技术公司生产的植物基因
组DNA快速提取试剂盒 ,用于提取龙须菜基因组
DNA ,紫外分光光度计定量 , 含有溴化乙锭的
0.7 %琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA ,紫外灯
下观察拍照 ,用λHind ⅢDNA作为分子量标记 。
1.3　ISSR反应及检测
反应条件参照孙雪等(2003)略做修改。反
应总体积为25μl , 其中包括 1 ×PCR buffer , 2.5
mmol/L MgCl2 ,0.2mmol/L dNTP , 0.2μmol/L 引物 ,
40ng模板 DNA , 1.0U Taq 酶。反应在 eppendorf
mastercycler gradient PCR仪上进行。扩增程序为
94℃预变性 5min ,接着 32个循环:变性 94℃,50s ,
按照不同引物的 Tm 值退火 , 退火温度 48℃、
50℃、53℃、55℃,1min ,延伸 72℃, 2min ,最后 72℃
延伸 8min。反应产物在含有溴化乙锭的 2.0%琼
脂糖凝胶中电泳检测 , 紫外灯下观察拍照 , 用
100bp的 DNA ladder作为分子量标记 。
1.4　数据分析
以电泳后扩增带的清晰度 ,可重复性为标准
用于 ISSR的标记分析。将电泳图谱中的每一条
带的迁移位置记为一个位点 ,相同迁移位置的扩
增带出现时记为 1 ,缺失记为 2 ,扩增带模糊不清
记为 0。设定扩增带出现时 ,该位点的基因型为
纯合显性基因型或杂合显性基因型;扩增带缺失
时 ,该位点的基因型为纯合隐性基因型 。
种群的多态位点比例 P =该种群的多态位点
数/所测位点总数×100%。
以Nei s指数(Nei , 1978)量化种群的平均杂
合度(H):
H = ∑n
i=1
(1 -∑x2i) n
其中 , n 为所测位点总数 , xi 为第 i 个基因的频
率。
遗传距离根据 Nei(1978)公式计算:
D =-ln[ J xy(J xJ y)1/2]
其中 , J xy为群体x和群体y的遗传相似度 , J x和Jy
分别为群体 x 和群体 y 的平均遗传相似度。
扩增片断共有率 S =2Nxy/(Nx +N y), Nxy为
x 和 y 两个个体共有的扩增带 , Nx 、Ny 为 x和 y 个
体分别拥有的扩增带。
通过上述 1 、2 、0谱带矩阵 ,利用种群遗传分
析软件包 TFPGA(Tools for Population Genetic Analy-
ses , Miller , 1999)进行遗传多样性检测 、遗传距离
计算以及聚类分析绘制群体间系统进化树 。
1.5　指纹图谱的构建
从 ISSR引物中挑取产生多态性的引物用于
龙须菜野生型群体和养殖群体的分析 ,所产生的
特异片段用于图谱的构建。图谱横轴为样品 ,纵
轴为特异的扩增片段(如 S8582000表示编号 S858
的 ISSR引物所产生的大小为 2000个碱基的特异
片段)。图谱中特异片段存在表示为有“ —”或无 。
2　结果
2.1　遗传分析
以提取的龙须菜野生和栽培的藻体基因组
242　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
DNA为模板 ,用于引物筛选 ,最终从 22条 ISSR引
物中 ,筛选出 16条引物 ,可以扩增出稳定 、清晰且
重复性好的带 ,在龙须菜野生型青岛 2003年群体
和选育品系连云港 2000 群体 、连云港 2003栽培
群体中进行PCR扩增 ,共扩增出 118个位点 ,青岛
群体 、连云港 2000群体 、连云港 2003群体各 114 、
91 、86 个位点 ,片段大小范围在 200—4000bp 。引
物序列及其扩增结果见表 1。
表 1　龙须菜 ISSR引物及其扩增结果
Tab.1　The ISSR primers used and their amplified results
引物
名称
5′※3′
序列
ISSR扩增位点
总位
点数
野生
群体
连云港
2000
群体
连云港
2003
群体
SP2 (GA)7AC 8 8 7 6
SP3 (CA)6GG 10 10 4 4
SP4 (GT)6CC 7 7 5 4
SP5 (GAA)6 7 7 7 7
SP6 (AAG)7 4 4 4 4
S848 (CA)8RG 11 10 7 6
S857 (AC)8YG 6 5 5 5
S858 (TG)8RT 7 7 2 2
S864 (ATG)6 6 6 5 4
S873 (GACA)4 5 4 2 2
S884 HBH(AG)7 9 9 7 7
S840 (GA)8YT 9 8 7 6
S835 (AG)8YC 4 4 4 4
S889 BHB(GA)7 9 9 9 9
S901 VHV(GT)7 6 6 6 6
S902 BDB(CA)7 10 10 10 10
合计 118 114 91 86
　　龙须菜野生群体和选育品系群体间的平均杂
合度和多态位点比例见表 2。
表 2　龙须菜野生群体和选育品系群体间的
平均杂合度和多态位点比例
Tab.2　Average heterozygosities and mean proportions of
polymorphic loci between natural and cultivated
populations of G.lemaneiformis
群体 青岛群体
连云港
2000 群体
连云港
2003 群体
平均杂合度 H 0.0305 0.0400 0.0000
多态位点比例 P% 6.7700 8.4700 0.0000
　　龙须菜野生群体和两个养殖群体的遗传相似
率分别为 0.7301 、0.7189 ,两个养殖群体的遗传相
似率为 0.9375(表 3)。
表 3　野生群体和选育品系栽培群体间的
遗传相似率(上)和遗传距离矩阵(下)
Tab.3　Genetic identities and genetic distances matrix between
the natural and cultivated populations of G.lemaneiformis
群体 青岛群体
连云港
2000 群体
连云港
2003 群体
细基江
蓠群体
青岛群体 — 0.7301 0.7189 0.6654
连云港 2000 群体 0.3146 — 0.9375 0.7001
连云港 2003 群体 0.3300 0.0645 — 0.6653
细基江蓠群体 0.4073 0.3566 0.4075 —
　　根据遗传距离数值 , 用 TFPGA 软件进行
UPGMA聚类分析 ,结果表明(图 1),龙须菜选育品
系其不同年代的两个养殖群体首先聚集为一支 ,
两群体间的遗传距离最小(0.0645);其后养殖群
体和野生群体聚为一类 ,最后再与外类群细基江
蓠群体聚为一类。
图 1　ISSR龙须菜野生群体和选育
品系群体间的聚类图
Fig.1　Cluster analysis of G.lemaneiformis
populations revealed by UPGMA using TFPGA
1.野生群体;2.连云港 2000群体;
3.连云港 2003群体;4.细基江蓠群体
2.2　龙须菜选育品系指纹图谱的构建
在使用的 16 条引物中 ,有 7 条能产生多态
性 ,其分别为 S848 、S857 、S858 、S864 、S873 、S 884 、
SP3。它们所产生的 12个特异位点 ,均为龙须菜
野生群体所特有(表 4),任意一特异位点均可区
分龙须菜选育品系和其野生型种群(图 2)。 每条
3期 李文红等:龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)选育品系及其野生型的 ISSR指纹分析 243　
图 2　龙须菜 ISSR引物 SP5(a)和 SP3(b)扩增图谱
Fig.2　The ISSR patterns of G.lemaneiformis
populations with primer SP5(a)and SP3(b)
B 为空白 ,M为引物
引物在龙须菜野生型和选育品系间的片段共享率
见表 4。这些引物对龙须菜野生种群和选育种群
的分辨率由大至小依次为:S858 、S848 、S873 、S857 、
SP3 、S884 、S864。
引物 S848可以将龙须菜野生型和不同年代
的选育品系区别开来 。以引物 S848 所产生的差
异性较大的特异位点 ,构建龙须菜选育品系 ISSR
指纹图谱(表 5)。有 、无特异位点在图谱上以
` — 或空白表示 ,用于龙须菜选育品系的指纹分
析与鉴定 。
3　讨论
从 ISSR标记分析结果看 ,龙须菜选育品系及
其野生型亲缘关系很近 ,可以验证其来自野生型
种群 。这与作者采用 RAPD标记的分析结果相吻
合(李文红等 , 2004)。 ISSR分析结果表明 ,选育
品系龙须菜 ,其江苏连云港 2000 、连云港 2003的
养殖群体间遗传距离为 0.0645 , 遗传相似性为
0.9375 ,两者间基因型基本上一致 。表 2表明 ,同
一栽培海区 ,随着栽培年份的增加 ,选育品系的平
均杂合度(0 .040 , 0.000)和多态位点比例(8.470 ,
0.000)由高到低呈下降趋势。作者推测 ,这主要
是由于人工繁育过程中 ,选种及制种影响了龙须
菜的遗传多样性 ,而连云港在这三年的养殖环境
变化较小 ,因此 ,以营养繁殖方式进行的繁育及养
殖 ,其后代表现型出现的差异在减少 ,基因型越来
越纯 ,趋于单一化 。
表 4　多态引物序列及其共享片段率和特异片段大小
Tab.4　Specific loci , similarities and primer sequences
引物编号 序列 5′※3′ 共有片段比率 S 龙须菜野生型特异片段(bp)
S848 (CA)8RG 36.00 　　S8481150、S848839、S848648
S857 (AC)8YG 50.00 　　S857916
S858 (TG)8RT 33.33 　　S8582000、S858517、S858396
S864 (ATG)6 90.91 　　S8641000
S873 (GACA)4 44.44 　　S8731120、S873613
S884 HBH(AG)7 87.50 　　S884760
SP3 (CA)6GG 66.67 　　SP3776
表 5　龙须菜选育品系的 ISSR指纹图谱
Tab.5　The ISSR fingerprints of selected G.lemaneiformis strain
244　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
　　龙须菜的 ISSR标记研究结果说明 ,对于龙须
菜等江蓠属的红藻 ,运用营养繁殖等无性繁殖方
式在短时间内可获得大量苗种 ,因此无性繁殖技
术作为海藻种苗来源及遗传选育技术 ,具有较大
潜力。但无性繁殖的种质材料必须以丰富的遗传
多样性为基础 ,海藻育种中应该无性和有性繁殖
交互使用。无性繁殖有利于生产性状的体现 ,但
应有一定的数量和地域的限制 ,以防遗传环境互
作造成遗传力和生产力下降 ,不利于保持海藻的
遗传多样性。
由DNA标记技术所产生的 DNA指纹图谱分
析 ,可从 DNA水平上反映海藻个体间的差异 ,最
大程度减少了其他因素的干扰 ,使海藻的分类和
鉴定更准确和真实 ,因此在品种鉴定 ,新品种注
册 ,种质真实性和纯度检验等方面很有效(梁明山
等 , 2001)。但 RAPD标记在藻类种内水平的多态
检测能力较低 ,如 Patwary 等(1993)对石花菜 Ge-
lidium vagum 群体的分析中 , RAPD引物产生多态
的比例为 17/165;Gonzalez等(1996)对 G.chilensis
群体分析 ,20条 RAPD引物在不同地理来源的群
体间都没有差异;Lim等(2001)对缢江蓠的两个形
态变种研究结果 , RAPD引物产生多态的比例为
4/60。作者在对龙须菜野生型及其选育材料进行
RAPD多态性分析时发现 ,扩增出多态的引物比
例为 7/300(李文红等 , 2004)。因此认为 ,应用
RAPD标记区别亲缘关系较近的龙须菜有一定的
局限性 ,应采用更有效 、灵敏的标记方法 。
本研究中 , ISSR 引物产生多态的比例为 7/
22 ,7条多态引物在群体间的相似率在 33.33%—
90.91%之间 ,其中引物 S848检测龙须菜野生型
和选育品系 2000群体及 2003 群体的相似率为
35.29%—71.43%。这说明 ,相对 RAPD 方法而
言 , ISSR方法检测多态性的能力更高 ,分辨力更
强。Morgan(1999)应用 ISSR技术可以检测出美国
宾夕法尼亚州的 Powdermill河流的淡水红藻串珠
藻 Batrachospermum boryanum 个体间的差异也证明
了这点 。因此 , ISSR标记更适合于以营养繁殖为
主的红藻群体 ,特别是群体间个体差异很小的龙
须菜选育材料 DNA水平的检验 。
致谢　　本研究得到中国科学院海洋研究所王秀
良博士在引物方面的帮助 ,连绍兴老师在实验材
料采集方面 ,夏邦美研究员在材料鉴定方面均给
予大力协助 ,谨致谢忱。
参　考　文　献
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ISSR ANALYSIS OF WILD AND SELECTED STRAINSOF
GRACILARIA LEMANEIFORMIS (RHODOPHYTA)
LI Wen-Hong , YAO Jian-Ting , WANG Ji-Cheng , WANG Ru-Cai , DUAN De-Lin
(Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao , 266071;
Department of Aquaculture , Guangxi University , Nanning , 530005)
(Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao , 266071 ;
Graduate School , Chinese Academy of Sciences , Beijing , 100039)
(Institute of Oceanology , Chinese Academy of Sciences , Qingdao , 266071)
(Fisheries College , Ocean University of China , Qingdao , 266003)
Abstract　　 Gracilaria lemaneiformis is edible for human being and a feed for shellfish (abalone).It is also a raw
material from which phycocolloid agar is extracted.This algal material can be used as bioremediation and is important
in coastal ecosystem.Usually , it was harvested from natural stocks , but over-harvesting reduced its populations and
resulted in the shortage of a constant and reliable supply.Therefore , cultivation became an alternative source of sup-
ply.Currently , G.lemaneiformis is one of the main commercial red seaweeds in China , and was widely cultivated
along coasts of Shandong , Zhejiang , Jiangsu , Fujian and Guangdong provinces driven by fast-growing agar-agar in-
dustry.Since fully artificial cultivation techniques were applied , strain s selection demanded by large-scale cultiva-
tion in China became the main task for scientists in recent years.
Through over ten years of efforts , a strain of G.lemaneiformis was selected successfully with promising applica-
tion.The objective characters of selected strain are fast growing and comparatively high agar yielding , it originally
habited in Qingdao with wild populations , but now widely applied in large-scale cultivation in Shandong , Zhejiang ,
Jiangsu , Fujian and Guangdong provinces.Several-year successive cultivation proved that its objective characters
were stable.It is however hard to distinguish the selected strain from wild type morphologically.Effective method for
the distinguishing is suggested to search on genetic level.So far , genetic information in hands was very limited.Fin-
gerprinting analysis could be a good alternative to reveal the differences between the selected strains and wild types in
further genetic study of G.lemaneiformis .
In this study , ISSR(Inter Simple Sequence Repeats)markers were applied to analyzing the relations between a
wild population in Qingdao of Shandong and two cultivated populations in Lianyungang of Jiangsu , the latter was from
our lab-selected strain to confirm the genetic background of the cultivated populations.An ISSR fingerprint of selected
strains was constructed to offer an available tool for G.lemaneiformis germplasm verification.According to the ISSR
246　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
data , 118 loci were obtained with 16 selected primers after amplification.The genetic identities for thewild and culti-
vated populations were 0.7301 and 0.7189 respectively;and 0.9375 between two cultivated populations.The genetic
distance between the wild and cultivated were 0.3146 and 0.3300 respectively;and the one between two cultivated
populations was 0.0645.Cluster analysis based on ISSR genetic distances was conducted by UPGMA method using
TFPGA software , both wild and cultivated populations of G.lemaneiformis fall into one group which separated from
Gracilaria tenuistipitata var.liui (outgroup);in G.lemaneiformis group , two cultivated populations were clustered
together into one group and separated from the wild population.These results indicated that relationship between wild
and cultivated G.lemaneiformis is very close , the selected strains of G.lemaneiformis original from its wild popula-
tions.Twelve specific loci of wild G.lemaneiformis yielded by seven ISSR primers (S858 , S848 , S873 , S857 ,
SP3 , S884 and S864)could be used for its germplasm identification.The specific loci yielded by each of the seven
ISSR primers can distinguish the selected strain from the wild population.A DNA fingerprint of G.lemaneiformis
based on ISSR data with primer S848 was constructed.It is valid for identification of wild and selected populations of
G.lemaneiformis , especially for those cultivated for many years.
Key words　　Gracilaria lemaneiformis , Rhodophyta , Relationship analysis , Germplasm identification , Finger-
print , ISSR
2005水产科技论坛
暨第 13届基因 、基因族 、同工酶国际研讨会
主办单位:中国水产科学研究院
协办单位:中国科学院遗传与发育生物研究所 、上海水产大学
支持单位:国家自然科学基金委员会 、中国生物技术发展中心 、世界渔业中心 、国际生物科学联合会中国
委员会 、韩国国立水产科学院
时间地点:2005年 9月 17日—21日 ,上海市
2005 水产科技论坛暨第 13届基因 、基因族 、同工酶国际研讨会将于2005年 9月 17日至 21日在中
国上海召开。
基因 、基因族 、同工酶国际研讨会是具有较高影响力的国际系列性会议 ,每两年举办一次。第 13届
研讨会的主题是基因组研究进展及其对 21世纪生物学的意义 ,主要讨论近年来基因分子生物学领域和
同工酶研究领域的最新研究进展和发展趋势 。本届研讨会将展示世界各国专家在本领域的最新研究成
果。包括干扰 RNA 、分子伴侣和折叠蛋白 、转基因学 、生物信息学 、同工酶和水生生物的分子生物学等方
面的内容。为了促进生物技术在水产科研中的应用 ,2005 水产科技论坛将与此次研讨会一并召开。水
产科技论坛是一个国际性论坛 ,本届论坛的主题是生物技术对水产业的促进作用 ,研讨内容包括水产养
殖生物基因组研究 、水产生物种质资源保护与种群结构分析 、水生生物繁殖与发育分子机理 、生物技术
在水产生物遗传育种以及水产养殖病害防治中的应用 、利用生物技术开发海洋药物及海洋活性物质等
方面的研究进展 。
本次研讨会后将在国外出版会议专集 ,与会者请尽早寄来论文摘要以便选择出版。
报名函请寄至:
100039 ,北京市永定路南青塔 150号村中国水产科学研究院学术会秘书处
电话:010-68673919　传真:010-68673918　E-mail:forum@cafs.ac.cn
或寄至:100080 ,北京中关村2707信箱中科院遗传发育所薛国雄先生
电话及传真:010-64861683　E-mail:icggfichina@sina.com
详情请到中国水产科技信息网(www.cafs.ac.cn)上查询。
3期 李文红等:龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)选育品系及其野生型的 ISSR指纹分析 247