全 文 ：2015 年 第 10 卷
第 6 期，110-120
生 态 毒 理 学 报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 10, 2015
No.6, 110-120
基金项目:国家自然科学基金资助项目(21107058;41373089)，环境污染过程与基准教育部重点实验室(南开大学)开放基金资助项目(KL-
PPEC-2013-01)
作者简介:赵丽红(1989-)，女，硕士研究生，研究方向为环境生物技术及生态毒理学，Email:lihongzhaonju@163.com;
* 通讯作者(Corresponding author)，E-mail: zhu.xiaoshan@sz.tsinghua.edu.cn
DOI: 10.7524/AJE.1673-5897.20150328005
赵丽红, 朱小山, 王一翔, 等. 纳米二氧化钛(nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的联合毒性效应[J]. 生态毒理学报，2015, 10(6):
110-120
Zhao L H, Zhu X S, Wang Y X, et al. The combined toxic effect of nanoscale titanium dioxide (nTiO2 ) and bisphenol A (BPA) on Scenedesmus obliquus
[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 110-120 (in Chinese)
纳米二氧化钛 (nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻 (Scenedes-
mus obliquus)的联合毒性效应
赵丽红1,2，朱小山1,2,!，王一翔1,2，晋慧2,3，王江新4，王超5，劳永民2，姜玥璐2，
陶益6，周进2，蔡中华2
1. 清华大学环境学院，北京 100084
2. 清华大学深圳研究生院海洋学部，深圳 518055
3. 清华大学生命学院，北京 100084
4. 深圳大学生命学院，深圳 518060
5. 香港高等科技教育学院，香港特别行政区
6. 清华大学深圳研究生院能源与环境学部，深圳 518055
收稿日期:2015-3-28 录用日期:2015-5-21
摘要:纳米二氧化钛(nTiO2 )在被人们广泛使用的同时，其潜在的环境影响也受到越来越多的关注。为深入探讨 nTiO2与环境
中现有污染物的相互作用及生物效应，以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)为受试生物，按照毒性单位法、相加指数法和混合毒
性指数法，研究了 nTiO2与双酚 A(BPA，一种常见的环境类雌激素)的联合毒性效应。结果显示，nTiO2与 BPA对 S. obliquus 生
长的 72 h半抑制浓度(EC50 )分别为 28.7 mg·L
-1与 1.81 mg·L-1。而 nTiO2与 BPA共存时，在不同毒性比(4:1，3:1，2:1，1:1，1:2 和
1:3)下，其联合毒性作用(以 BPA计)的 72 h EC50值分别为 2.198，1.58，1.153，0.428，0.306和 0.189 mg·L
-1。两者的联合毒性作用
不仅仅是简单的相加，而是随着两者毒性比的变化，由拮抗作用转变为相加作用，继而转变为协同作用。这表明，nTiO2进入环
境后与现有污染物的毒性比(浓度比)可能是其联合毒性作用模式的一个重要影响因素。
关键词:纳米二氧化钛;双酚 A;斜生栅藻;联合毒性
文章编号:1673-5897(2015)6-110-11 中图分类号:X171.5 文献标识码:A
The Combined Toxic Effect of Nanoscale Titanium Dioxide (nTiO2 )and
Bisphenol A (BPA)on Scenedesmus obliquus
Zhao Lihong1,2 , Zhu Xiaoshan1,2,* , Wang Yixiang1,2 , Jin Hui2,3 , Wang Jiangxin4 , Wang Chao5, Lao
Yongmin2, Jiang Yuelu2 , Tao Yi6 , Zhou Jin2 , Cai Zhonghua2
1. School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2. Division of Marine Science and Technology, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China
第 6期 赵丽红等:纳米二氧化钛(nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的联合毒性效应 111
3. School of Life Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China
4. School of Life Science, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China
5. The Technological and Higher Education Institute of Hong Kong，Hong Kong, China
6. Division of Energy and Environment, Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China
Ｒeceived 28 March 2015 accepted 21 May 2015
Abstract:Nanoscale titanium dioxide (nTiO2 ) has been widely used in industries such as electronics, optics, and
material sciences. However, increasing concerns have been raised in regards to its ecotoxicity and toxicity on the a-
quatic environment as well as to humans. In order to better understand the interactive effects of nTiO2 and the exist-
ing pollutants in the environment, the combined toxic experiments between nTiO2 and bisphenol A (BPA, a typical es-
trogen in aquatic environment) were carried out according to three joint toxicity evaluation methods (toxic unit, addi-
tive index and mixture toxic index), using green algae Scenedesmus obliquus as an experimental model. The results
showed that the separate 72 h EC50 of nTiO2and BPA for S. obliquus was 28.7 mg·L
-1 and 1.81 mg·L-1 , respective-
ly. When nanoparticles coexist with BPA, the 72 h EC50(showed by BPA) values in different toxic ratios (4:1, 3:1, 2:
1, 1:1, 1:2 and 1:3) were 2.198，1.58，1.153，0.428，0.306 and 0.189 mg·L-1 , respectively. The results tell us the com-
bined toxic effect was not simply one-step additive. Instead, it depends on the various toxic ratios pattern, the ob-
served toxic effects turned from antagonism to additive effect and then to synergism process. These results indicated
that the toxic ratios (concentration ratios) between nTiO2 and the existing pollutants in the environment would play a
key role for determining their combined toxic effects.
Keywords:nTiO2; BPA; Scenedesmus obliquus; combined toxicity
人工纳米材料 (manufactured nanomaterials，
MNMs)是指至少有一维方向上的粒径处于纳米尺
度范围(1 ~ 100nm)，且具有高度均匀性的材料[1-2]。
MNMs 由于其尺寸较小，结构特殊，因此具备多种
优异的物理化学特性，如小尺寸效应，巨大的表面活
性，界面效应，量子效应等[3-4]。MNMs 已经在社会
生产和生活方面获得了广泛地应用。纳米二氧化钛
(nanoscale titanium dioxide，nTiO2)是当前产量最大的
MNMs 之一，已广泛应用于化妆品、医药、涂料、环
保等多个领域[5-8]。广泛的使用以及不断增加的产
量，使 nTiO2不可避免会进入到环境之中。近年来，
nTiO2已在表面径流及污水中被检测到
[9-10]，美国具
有代表性的十处污水处理厂进水中 nTiO2的浓度为
181 ~ 1 233 μg·L-1[11]。研究表明，nTiO2进入水环境
后不仅会对水生生物产生一定的毒性[12-20]，还与环
境中的现有污染物发生相互作用，对现有污染物的
迁移、转化、归趋以及相应的生物和生态效应产生影
响[12, 20-22]。例如，Zhu 等[21]发现 2 mg·L-1的 nTiO2可
以使三丁基锡 (TBT)对九孔鲍 (Haliotis diversicolor
supertexta)胚胎的毒性增加 20 倍。Tian等[22]也发现
了类似的现象，即 nTiO2的存在可使毛蚶(Scapharca
subcrenata)对菲(Phe)的累积相比 Phe单独存在时增
加 1.7倍，表明 nTiO2作为载体促进了双壳类动物对
Phe的吸收。在 Zhang 等[23]的研究中，nTiO2对重金
属 Cd 有很强的吸附性，且 nTiO2能使鲤鱼(Carp)对
Cd的累积较 Cd单独存在时增加 146%。但是上述
研究更多的关注单一纳米材料浓度(特别是无明显
生物效应)下对现有污染物毒性效应的影响[13, 24-26]，
未考虑到实际环境中 MNMs 与现有污染物之间复
杂多变的浓度比例及相互作用模式。为进一步探索
MNMs 与环境中现有污染物的相互作用及其生物
效应，本文选取典型 MNMs(nTiO2 )和有机污染物双
酚 A(BPA，一种常见的环境类雌激素)，采用三种经
典的联合毒性评价方法(毒性单位法、相加指数法、
混合毒性指数法)[27-32]，考察不同毒性比(浓度比)下
两者共存时对模式生物斜生栅藻 (Scenedesmus
obliquus)的联合毒性效应。研究结果为深入理解
MNMs 的潜在环境效应和健康风险，进一步提高
MNMs 的环境风险管理提供基础。
1 材料与方法(Materials and methods)
1． 1 实验材料及储备液
nTiO2白色粉末购自南京埃普瑞纳米材料有限
公司，平均粒径为 15 nm，锐钛矿型，纯度大于
99.5%。BPA购自 BIO Basic Inc(Canada)，纯度为 99.
112 生 态 毒 理 学 报 第 10卷
0%。其余试剂均为国产优级纯或分析纯，纯度均高
于99.0%。玻璃仪器在使用前均用 10%浓硝酸浸泡
48 h，并用去离子水冲洗干净，高温高压(121 ℃ ,15
min)灭菌后待用。
取 1 g nTiO2溶于 100 mL OECD 201 藻类培养
基[33]中，超声 10 min 后静置 5 min，反复 3 次，配成
10 g·L-1的 nTiO2母液备用。称取 5 g BPA溶解至 50
mL二甲基亚砜(DMSO)中，配成 100 g·L-1的 BPA储
备液。实验前用 OECD 201 藻类培养基逐级稀释各
储备液以获得所需的实验液。
1.2 nTiO2的透射电镜 (transmission electron micro-
scope，TEM)检测
分别用 OECD 201 藻类培养基稀释 nTiO2与
BPA储备液，使两者混合后的浓度分别为 50 mg·L-1
与 2 mg·L-1。将该混合样品，置于摇床上(SHIPING
SPH-310A, Shanghai)，转速为 150 r·min-1。分别于 0
h及 72 h，用移液器移去 1 mL 样品至含碳膜铜网
上，并放置于 40 ℃烘箱内干燥，干燥后，用透射电镜
(TEM，FEI Tecnai G2 F30，美国)观察 nTiO2的团聚状
态、粒径、晶型、形貌等特征。
1． 3 受试生物及其培养
受试生物选用模式生物斜生栅藻(Scenedesmus
obliquus)。S. obliquus 由南开大学环境科学与工程
学院环境生物研究室提供，并参照 OECD 201 标准
方法进行培养。培养温度为 26 ℃，光照强度约为
4 000 ± 200 lux，光暗比为 14:10。为与毒性实验保持
一致，S. obliquus 的培养在摇床(SHIPING SPH-310A,
Shanghai)上进行，转速为 150 r·min-1。
1． 4 nTiO2与 BPA的单独毒性实验
实验方法参照朱小山等[34]的研究。首先配制
藻试验液:取对数生长期长势旺盛的藻，用新鲜无菌
OECD 201培养基稀释至 2 × 104cell·mL-1，待用。然
后配制 nTiO2/BPA试验液:同样用新鲜无菌 OECD
201培养基逐级稀释 nTiO2/BPA母液，得到一系列
不同浓度的试验液，使其浓度为实验浓度的 2 倍。
将藻试验液与一系列 nTiO2/BPA试验液等体积混
合，配成系列 nTiO2/BPA测试液(终体积 100 mL)，其
中 S. obliquus 的初始浓度为 1 × 104 cell·mL-1。在
nTiO2测试液中，nTiO2浓度分别为 0 (对照)，0.5，1，
2.5，5，10，50，100 mg·L-1。在 BPA测试液中，BPA的
浓度为 0(对照)，0.2，0.5，1,5，10，25 mg·L-1。BPA测
试液中含有体积比最高为 0.01%的 DMSO 助溶剂。
预实验表明，该浓度 DMSO对 S. obliquus 的生长没
有显著影响。
测试液培养条件与文献[34]类似。为避免不同
光照的影响，每隔 2 h 调整锥形瓶的位置以确保受
光均匀。实验期间，每隔 24 h于超净工作台取一定
量藻液按血球计数法测定藻细胞浓度。实验持续
72 h。实验结束后，依据 OECD 标准方法[33]计算不
同处理中藻类的生长抑制率，并计算 72 h EC50。
1． 5 nTiO2与 BPA的联合毒性实验
Bliss[27]最早提出了联合作用理论，他将联合毒
性作用分为了相加联合作用、独立联合作用、协同作
用以及拮抗作用。联合毒性模式又被学者相继补充
和完善。目前，常用的联合毒性作用类型分为:简单
相加、协同作用、部分相加、单独作用、拮抗作
用[27-28]。本文主要采用毒性单位法 (TU)、相加指数
法(AI)、混合毒性指数法(MTI)3 种常见的联合毒性
评价方法考察不同毒性比下 nTiO2与 BPA 对 S.
obliquus 的联合毒性效应。上述 3 种方法均规定污
染物各自的 EC50为 1 个毒性单位(即 1 TU)，则对浓
度为 C的污染物而言，其在实验中的毒性单位为 C/
EC50。在本实验中，为考察不同毒性比下 BPA 与
nTiO2的联合毒性作用，设置 BPA与 nTiO2的毒性比
由大到小依次为 4:1，3:1，2:1，1:1，1:2 和 1:3。在每一
种毒性比内，依据污染物浓度的高低，分别设置 7 个
浓度组合(表 1)，考察各浓度组合对 S. obliquus 的生
长抑制情况，计算在该毒性比下的 EC50。得到不同
毒性比下的 EC50后，根据文献方法 (见下文)，评价
BPA与 nTiO2的联合毒性效应。
联合毒性实验中，不同毒性比中不同浓度组合
nTiO2与 BPA混合对 S. obliquus 的生长抑制实验过
程与 1.4类似。只是，提前用 OECD 201藻类培养基
配好不同浓度组合 nTiO2与 BPA(浓度加倍)的混合
液，然后与藻试验液等体积再混合，得到 nTiO2与 BPA
联合测试液。测试液培养条件与 EC50计算同 1.4。
1． 6 联合毒性评价方法
几种联合毒性评价方法简述如下:
1)毒性单位法(TU)[29-30]
TUi = Ci/EC50 i
TU =∑TUi
TU0 = TU/max(TUi)
Ci为化合物 i的浓度;EC50 i为化合物 i半抑制浓
度。运用此公式对混合物的联合作用判断标准为:若
TU=1，那么化学物之间呈相加作用;若 TU > TU0，化
学物之间呈拮抗作用;若 TU<1，化合物呈协
第 6期 赵丽红等:纳米二氧化钛(nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的联合毒性效应 113
表 1 纳米二氧化钛(nTiO2)与双酚 A(BPA)在不同毒性比下的浓度组合
Table 1 The different concentration groups of nTiO2 and BPA at different toxic ratios
毒性比
Toxic ratios
(BPA:nTiO2 )
浓度组合
Concentration groups
4:1
BPA(mg·L-1 ) 0.181 0.362 0.724 1.448 2.896 5.792 11.584
nTiO2 (mg·L
-1 ) 0.718 1.435 2.870 5.740 11.480 22.960 45.920
3:1
BPA(mg·L-1 ) 0.113 0.226 0.453 0.905 1.810 3.620 7.240
nTiO2 (mg·L
-1 ) 0.598 1.196 2.392 4.783 9.567 19.133 38.267
2:1
BPA(mg·L-1 ) 0.113 0.226 0.453 0.905 1.810 3.620 7.240
nTiO2 (mg·L
-1 ) 0.897 1.794 3.588 7.175 14.350 28.700 57.400
1:1
BPA(mg·L-1 ) 0.113 0.226 0.453 0.905 1.810 3.620 7.240
nTiO2 (mg·L
-1 ) 1.794 3.588 7.175 14.350 28.700 57.400 114.800
1:2
BPA(mg·L-1 ) 0.113 0.226 0.453 0.905 1.810 3.620 7.240
nTiO2 (mg·L
-1 ) 3.588 7.175 14.350 28.700 57.400 114.800 229.600
1:3
BPA(mg·L-1 ) 0.057 0.113 0.226 0.453 0.905 1.810 3.620
nTiO2 (mg·L
-1 ) 2.691 5.381 10.763 21.525 43.050 86.100 172.200
同作用;若 TU = TU0，化合物之间为独立作用;若
TU0 > TU >1,化合物呈现部分加和作用。
2)相加指数法(AI)[32]
TUi = Ci/EC50 i TU =∑TUi
当 TU1.0时，AI = (1/TU)-1
当 TU1.0时，AI = TU(-1) +1
当 AI大于零为大于相加作用，而小于零表示小
于相加作用，等于零等于相加作用。
3)混合毒性指数法(MTI)[31]
TUi = Ci/EC50i
TU =∑TUi
TU0 = TU/max(TUi) MTI =1-logTU/logTU0
若MTI <0，化合物之间呈拮抗作用;若 MTI =
0，化合物之间呈现独立作用;若 0
生浓度相加作用;若 MTI > 1,化合物之间发生超加
和作用或者协同作用。
1． 7 数据分析
采用 OECD 201标准方法计算 72 h EC50。采用
SPSS 20.0 对数据进行方差分析 (one way ANOVA)
及 Turkey’s test分析，P < 0.05 表示有显著性差异。
采用 Origin进行相应图片的绘制。
2 实验结果(Ｒesults)
2.1 nTiO2的 TEM检测
通过 TEM观察，发现 nTiO2进入 S. obliquus 培
养基后，发生团聚，形成较大的聚集体(图 1A)，其水
力半径在微米级别以上。但是仍然可以发现很多依
然以纳米尺寸存在的粒子(图 1C)。不仅如此，nTiO2
虽然发生团聚，但其团聚体呈现松散状态，团聚体的
边缘呈现不规则的形状，边缘依旧存在纳米尺寸粒
子(图 1A、B)，依旧可以表现出纳米尺寸效应。
2． 2 nTiO2对 S. obliquus 的单独毒性
在考察 nTiO2与 BPA的联合毒性前，应首先明
图 1 TEM检测 nTiO2进入 S. obliquus 培养基后的团聚状态
Fig. 1 Aggregation of nTiO2 suspended in S. obliquus culture medium observed by TEM
114 生 态 毒 理 学 报 第 10卷
确 nTiO2与 BPA 各自对 S. obliquus 的毒性效应。
nTiO2单独暴露对 S. obliquus 的生长抑制具有明显
的剂量-效应关系(图 2，3)。低浓度(0.5，1，2.5，5 mg·
L-1 )处理组中 S. obliquus 的生长与对照相比，没有显
著差异;在 1 mg·L-1和 2.5 mg·L-1处理组中甚至观察
到藻细胞的浓度较对照组有一定程度的增加。这与
我们的前期研究结果类似，可能与藻类对污染物的
“毒性兴奋”效应有关[35]。但是在高浓度(10，50，100
mg·L-1 )处理组，nTiO2显著抑制了 S. obliquus 的生长
速率，且随着浓度的增加，抑制效应越明显。根据
OECD标准方法[33]，进一步将实验浓度的对数与抑
制百分数进行一元线性回归，可得到 nTiO2对 S.
obliquus生长的剂量-效应方程和EC50值 (表2 )。经
图 2 不同浓度 nTiO2随不同时间对 S. obliquus细胞数目的影响
Fig. 2 Effect of different concentrations of nTiO2
on S. obliquus cells number as exposure time changes
图 3 不同浓度 nTiO2对 S. obliquus 的生长抑制效应
注:A表示 S. obliquus 72 h生长曲线下所包围的面积。
Fig. 3 The inhibition effects of nTiO2 on the growth
of S. obliquus
Note:A, The area under the growth curve.
计算，nTiO2对 S. obliquus 的 72 h EC50为 28.7 mg·
L-1，该数值略高于 Sadia 等[36]的实验结果(72 h EC50
为21.2 mg·L-1 )，但两者都在已报道的 nTiO2对藻类
毒性范围之内[37]。此外，根据文献[38]的方法，计算
得出 nTiO2对 S. obliquus 生长的 72 h最低效应浓度
(LOEC)为 10 mg·L-1。
2． 3 BPA对 S. obliquus 的单独毒性
不同浓度 BPA对 S. obliquus 生长的抑制效应见
图 4，5。与 nTiO2的毒性类似，随着浓度增大，BPA
对 S. obliquus 的生长抑制作用逐渐增强，呈现明显
的剂量—效应关系。暴露 72 h后，在实验的最
表 2 各实验组对 S. obliquus 生长抑制的剂量 －效应相关关系及半效应浓度
Table 2 The dose-effect correlation and 72 h EC50 of nTiO2 or BPA in different experiment
groups on the growth of S. obliquus
实验组
Experiment groups
回归方程
Regression equation
相关系数
Correlation coefficient
EC50 (BPA)
/(mg·L-1 )
EC50 (nTiO2 )
/(mg·L-1 )
single nTiO2 y = 0.368x-0.036 0.795 -- 28.7
single BPA y = 0.411x + 0.394 0.935 1.81 --
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 4:1 y = 0.4673x + 0.3402 0.8867 2.198 8.71
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 3:1 y = 0.5025x + 0.3997 0.9689 1.58 8.35
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 2:1 y = 0.5036x + 0.4689 0.9888 1.153 9.14
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 1:1 y = 0.4406x + 0.6623 0.917 0.428 6.79
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 1:2 y = 0.3556x + 0.683 0.9899 0.306 9.70
毒性比 toxic ratio (BPA:nTiO2 ) = 1:3 y = 0.3816x + 0.7759 0.9561 0.189 8.99
注:y表示 S. obliquus 受抑制的百分率，single nTiO2组中的 x表示 nTiO2水溶液的对数浓度 lgC，其余各组均以水溶液中 BPA的浓度的对数值表
示。--表示没有进行该项检测。
Note:y indicates the inhibition percent of Scenedesmus obliquus; x in the group of nTiO2 only indicate the lgC of nTiO2 suspensions and x in the other
groups indicate the lgC of BPA. -indicates there is no detection.
第 6期 赵丽红等:纳米二氧化钛(nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的联合毒性效应 115
图 4 不同浓度 BPA随不同时间对 S. obliquus 细胞
数目的影响
Fig. 4 Effect of different concentrations of BPA on
S. obliquus cells number as exposure time changes
低浓度(0.2 mg·L-1 )暴露组，尽管 BPA对藻的生长无
显著抑制作用，但仍然观测到藻平均丰度的明显降
低;而高浓度(25 mg·L-1 )BPA甚至已完全抑制了 S.
obliquus 的生长。按照标准方法，计算得到 BPA浓
度与 S. obliquus 生长抑制率之间的关系方程以及
EC50值(表 2)。BPA对 S. obliquus 的 72 h EC50为1.81
mg·L-1，与已报道的 BPA对绿藻的 96 h EC50(1.0 ~ 3.
1 mg·L-1 )[39]保持一致。
2.4 nTiO2与 BPA对 S. obliquus 的联合毒性效应
本文从实际情况出发，考虑到环境中存在纳米
材料与环境污染物的不同浓度比例，考察不同毒性
比下不同浓度组合 BPA与 nTiO2对 S. obliquus 的生
长抑制作用，并采用毒性单位法、相加指数法、混合
毒性指数法 3种方法评价了 BPA与 nTiO2的联合毒
性效应。不同毒性比下，各浓度组对 S. obliquus 的
毒性效应如图 6 所示。结果显示，不同毒性比下的
EC50(以 BPA表示，表 2)各不相同，最高值和最低值
间，相差将近 12倍。最高值出现在毒性比 4:1实验
组，EC50 = 2.198 mg·L
-1，明显大于单独 BPA 时的
EC50;而最低值(EC50 = 0.189 mg·L
-1 )出现在毒性比
1:3组，显著小于单独 BPA时的 EC50。不同毒性比
下以 nTiO2表示的 EC50同样各不相同(表 2)，最高值
出现在毒性比 1:2实验组，EC50 = 9.70 mg·L
-1，而最
低值出现在毒性比 1:1组，EC50 =6.79 mg·L
-1。实验
中以 nTiO2表示的所有 EC50，均明显小于单独 nTiO2
时的 EC50。实验结果表明，不同毒性比下混合物的
毒性差异较大。根据联合毒性评价方法，当 BPA与
nTiO2毒性比为 4:1和 3:1时，两者对 S. obliquus 的联
合毒性作用为拮抗;但是当两者的毒性比为 2:1，1:1，
1:2，1:3时，联合毒性作用却呈现为协同作用(表 3，
图 7)。纳米材料和现有污染物联合作用后发生的
种种变化，无疑给现有环境监测理念和技术及设备
产生挑战，也对纳米材料的环境风险评估带来新的
亟需解决的问题。
图 5 不同浓度 BPA对 S. obliquus 生长抑制效应
注:A表示 S. obliquus 72 h生长曲线下所包围的面积。
Fig. 5 The inhibition effects of BPA on the growth
of S. obliquus
Note:A: The area under the growth curve.
表 3 不同毒性比下 BPA与 nTiO2对 S. obliquus 的联合毒性评价结果及相关参数
Table 3 The parameters of combined toxicity evaluation methods
and toxic mode of BPA and nTiO2 under different toxic ratios
毒性比
Toxic ratios
(BPA to nTiO2 )
毒性单位法(TU)
TU TU-1 TU0 TU-TU0
相加指数法(AI) 混合毒性
指数法(MTI)
联合作用模式
Combined toxic mode
4:1 1.52 0.52 1.25 0.27 -0.518 -0.870 拮抗 antagonism
3:1 1.17 0.17 1.33 -0.16 -0.166 0.465
拮抗/部分相加
antagonism/partly addtive
2:1 0.96 -0.04 1.5 -0.54 0.047 1.196 协同 synergism
1:1 0.48 -0.52 2 -1.52 1.083 2.06 协同 synergism
1:2 0.51 -0.49 1.5 -0.99 0.97 2.67 协同 synergism
1:3 0.42 -0.58 1.33 -0.91 1.39 4.03 协同 synergism
116 生 态 毒 理 学 报 第 10卷
图 6 不同毒性比下不同浓度组合(BPA + nTiO2)对 S. obliquus 生长抑制效应
注:A表示 S. obliquus 72 h生长曲线下所包围的面积;A~ F分别表示 BPA与 nTiO2毒性比分别
为 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3时的生长抑制效应。
Fig. 6 The inhibition effect of BPA (nTiO2 ) on the growth of S. obliquus at different toxic ratios
Note:A, The area under the growth curve; the toxic ratios of BPA to nTiO2 was 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 respectively from A to F.
图 7 TU、TU0、AI、MTI值随不同毒性比的变化
Fig. 7 Changes of TU，TU0，AI and MTI values
with the different toxic ratios
3 讨论(Discussions)
MNMs 与环境中现有污染物的相互作用及其
联合毒性效应，日益受到关注。大量研究表明，
MNMs 的存在能影响污染物在水生生物体内的富
集及其相应的生物毒性[21,40-44]。例如，碳纳米材料富
勒烯能影响有机污染物，如阿特拉津、甲基对硫磷、
多氯联苯和菲在生物体内的累积和毒性效应[40-41];
nTiO2和 nFe3O4能加重重金属 Cd 对细胞的 DNA单
链损伤[42-43]，nTiO2还强化 Cd 和 As 在鲤鱼体内的生
物累积[23, 45] , 增强阿特拉津和氟甲矾霉素对蛋白核
小球藻的毒性[44]。我们的前期研究结果显示，nTiO2
能吸附海水中的三丁基锡(TBT)、多环芳烃菲(Phe)
和多溴联苯醚(PBDEs)等污染物，增加它们在底栖生
物中的富集，并强化 TBT 的毒性效应[21, 46-47]。但是，
并非所有的研究都呈现MNMs对其他污染物的毒
第 6期 赵丽红等:纳米二氧化钛(nTiO2 )与双酚 A对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的联合毒性效应 117
图 8 nTiO2 吸附在藻细胞的两端(左);nTiO2团聚在藻细胞周围(中);右图由中图放大得到。
显微镜放大倍数为:400 ×。红箭头标注为 nTiO2，圆圈包围的是藻细胞。
Fig. 8 nTiO2 absorbed on the both ends of S. obliquus (left); nTiO2 got together and surrounded the algae cells (middle);
The middle picture zoomed to the right. Microscopic magnification: 400 × . The red arrows point to the nTiO2
and the red circle surround the algae cells.
性“强化”;相反，亦有研究指出，MNMs 的存在导致
了其他污染物的毒性“弱化”。例如，nTiO2的存在
降低了 Cd对羊角月牙藻(Pseudokirchneriella subcapi-
tata)[13]，铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)和莱茵衣
藻(Chlamydomonas reinhardtii) [24]的毒性，也部分降
低了 Cr(VI)对斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的毒
害作用[48]。还有研究发现，nTiO2先提高了 Zn
2 +对
蓝藻 (Anabaena sp.)的毒性，但是随着实验体系内
nTiO2浓度的增加，Zn
2 +对 Anabaena sp.的毒性逐渐
降低并最终恢复正常[49]。上述研究当中，几乎每个
研究人员都认为 MNMs 对其他污染物的吸附作用
是其影响污染物生物效应的原因。但是，不同的甚
至相反的研究结果，喻示除吸附作用外可能存在其
他的影响因素。实际上，已有的研究往往关注单一
或少数纳米材料浓度(特别是无明显生物效应)下对
现有污染物毒性效应的影响[13, 24-26]，未考虑到实际
环境中 MNMs 与现有污染物之间复杂多变的浓度
比例及其相互作用模式。本实验中，我们采用毒性
单位法、相加指数法和混合毒性指数法尝试评价了
不同毒性比下不同浓度组合的 BPA与 nTiO2的联合
毒性效应。结果显示，nTiO2与 BPA的联合毒性与
两者的毒性比(浓度比)之间存在紧密的联系:在实
验范围内，随着毒性比由大到小(4:1 到 1:3)，nTiO2相
对含量增大，两者的联合毒性作用由拮抗作用转变
为部分相加，再转为协同作用。即 nTiO2对 BPA的
影响由毒性弱化逐步过渡到毒性强化。例如，当
BPA的浓度为 0.2 mg·L-1时，其单独对 S. obliquus 的
抑制率约为 19%，加入 nTiO2后，随着毒性比由大到
小(4:1 到 1:3)，即 nTiO2相对含量增大，BPA 对 S.
obliquus 的抑制率由 7% (弱化)上升到 64% (强化)，
毒性增加超过 9倍。可见 BPA与 nTiO2共存时浓度
的比值在很大程度上决定着两者的联合毒性效应。
上述现象可能与不同毒性比 (浓度比 )下，
nTiO2、BPA与 S. obliquus 三者之间的相互作用有
关。溶液中如果仅有 BPA时，BPA的浓度决定其生
物毒性的大小。当溶液中加入少量的 nTiO2时，由
于其对 BPA的吸附，导致溶液中 BPA的含量减少，
由 BPA引起的毒性作用降低，而此时溶液中 nTiO2
含量较低，不足以引起对 S. obliquus 的毒性，因此，
整体的联合毒性作用模式表现为拮抗。研究表明，
nTiO2对 BPA 的吸附作用很快，5 min 即可吸附
40%，60 min内即可吸附平衡[7]。nTiO2对 BPA之间
的吸附作用，此时可能主要起到“消减”作用。继续
加入 nTiO2，溶液中 BPA的含量进一步降低，由 BPA
导致的毒性作用进一步降低，但同时，溶液中 nTiO2
的含量增加，与藻细胞发生相互作用，有部分吸附在
藻细胞的表面，如图 8所示，导致 S. obliquus 的局部
BPA浓度过高，增强了对 S. obliquus 的毒性，因此，
此时的联合毒性作用表现为相加或部分相加作用。
若向体系中进一步加入 nTiO2，溶液中的 BPA含量
可能降至很低，其对 S. obliquus 的毒性作用进一步
下降，但是此时 nTiO2含量较高，可能发生(1)吸附有
大量 BPA的 nTiO2团聚在的表面，吸附态 BPA可导
致细胞表面局部 BPA浓度过高，高浓度 BPA的毒性
作用显著增强，呈现协同作用;(2)生物体细胞膜孔
径、核膜孔径以及离子通道大都处于纳米级[50]，小
118 生 态 毒 理 学 报 第 10卷
粒径的 nTiO2会通过这些通道直接进入细胞内，吸
附有 BPA的 nTiO2可能通过被动或主动运输作用进
入细胞内[51-53]，导致细胞内 BPA和 nTiO2的含量增
高，此时 nTiO2对 BPA的吸附主要起到“富集”作用。
由于 BPA 和 nTiO2 都会引发细胞内的氧化应
激[54-56]，其联合毒性作用呈现协同作用;(3)双酚 A
能胁迫藻细胞产生活性氧自由基[55]，破坏细胞膜，
改变细胞膜通透性，从而导致藻细胞易于受到污染
物的损伤。nTiO2附着在藻体表面后本身也可能破
坏细胞表面结构、造成氧化胁迫等[56]。因此，吸附
有 BPA的 nTiO2团聚在 S. obliquus 的表面后，可能
发生 BPA和 nTiO2并肩作战，相互促进对藻的毒性，
呈现协同作用;(4)上述几种联合作用机制可能同时
发生，交互作用，最终导致协同作用的发生。
为评价 BPA和 nTiO2的联合毒性效应，考虑到实
际环境中多变的污染物浓度比例，本研究采用毒性单
位法、相加指数法、混合毒性指数法三种联合毒性评
价方法考察了 BPA和 nTiO2在不同毒性比不同浓度
组合对 S. obliquus 的联合毒性效应。结果发现，与已
有研究仅是强调毒性强化或仅是强调弱化不同，本实
验同时出现MNMs 对其他污染物毒性的强化与弱化
作用。在实验范围内，随着毒性比由大到小(4:1 到 1:
3，以 BPA计，nTiO2相对含量逐渐增大)，两者的联合
毒性作用由拮抗作用转变为部分相加，再转为协同作
用。由于不同的毒性比对应着两者的不同的浓度比，
表明浓度比可能是MNMs 与其他污染物联合毒性作
用效应的决定因素之一。不同浓度比下，MNMs 与其
他污染物的联合作用机制，可能与 MNMs、污染物以
及毒作用受体三者之间的相互作用有关，其复杂的内
部毒理作用机制还需进一步深入研究。
目前环境标准多是对环境中单一污染物的含量
提出限制，并未考虑到环境中日益增多的 MNMs 的
潜在环境风险。我们的实验结果显示，MNMs 与环
境污染物之间具有复杂的联合毒性作用，MNMs 的
环境暴露既可能导致对其他污染物的“浓度富集”
和“毒性强化”，也可能起到“浓度消减”和“毒性弱
化”。因此，有必要加强 MNMs 生态毒理学的研究，
弄清其毒性机制，同时应探索 MNMs 与环境污染物
的联合毒性作用及其机理，结合实际环境状态，建立
健全更加完善合理的环境标准。
通讯作者简介:朱小山(1977-)，男，环境科学博士，副研究员，
主要研究方向为环境科学与生态毒理学，发表论文 60余篇。
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