全 文 :收稿日期:2009 - 04 - 29 录用日期:2009 - 05 - 24
基金项目:国家自然科学重点基金 (No. 20537020);北京科技大学冶金工程研究院基础理论研究基金;北京科技大学多学科交
叉项目
作者简介:杨晓静 (1983—),女,硕士研究生;* 通讯作者 (Corresponding author),E-mail : haiyan@sas.ustb.edu.cn
纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长的
抑制效应
杨晓静 2,陈灏 1,闫海 2,*,秦波 2
1. 中国科学院生态环境研究中心 环境水质学国家重点实验室,北京 100085
2. 北京科技大学应用科学学院生物科学技术系,北京 100083
摘要:纳米材料独特的理化性质使其得到了广泛的应用,但其可能带来的生物安全性问题引起了社会各界的广泛关
注 . 采用污染物藻类毒性测试的标准实验方法,研究了纳米二氧化钛(nano-TiO2)和单壁碳纳米管(SWCNTs)对普通
小球藻(Chlorella vulgaris)生长的抑制效应 . 结果表明,在 0.01~500mg·L -1 浓度范围内,nano-TiO2 对普通小球藻的生
长没有明显的抑制现象,而 SWCNTs 却对普通小球藻的生长存在明显的抑制效应,其 96h 半效应浓度(96h-EC50)为
261.5mg·L -1. 光学和电子显微镜观察发现,与 nano-TiO2 相比,SWCNTs 能够发生凝聚并吸附大量的普通小球藻细
胞,因此严重抑制了普通小球藻的正常生长 .
关键词:普通小球藻;纳米二氧化钛;单壁碳纳米管;毒性效应
文章编号:1673 - 5897(2010)1 - 038 - 06 中图分类号:X171.5 文献标识码:A
Effects of Nano -TiO2 and Single -Walled Carbon Nanotubes on the
Growth of Chlorella vulgaris
YANG Xiao-jing2,CHEN Hao1,YAN Hai2,*,QIN Bo2
1 . State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry , Research Center for Eco -Environmental Sciences , Chinese Academy of
Sciences , Beijing 100085
2. Department of Biological Science and Technology, University of Science and Technology Beijing , Beijing 100083
Received 29 April 2009 accepted 24 May 2009
Abstract:Nanomaterials have been widely used in many fields because of its unique physical and chemical properties.
The safety of nanomaterials on organisms is paid increasing attention by people. In this paper, a standard method of algal
bioassay for evaluating the toxicity of toxic chemicals was used and the inhibitory effects of nano -TiO2 and single -walled
carbon nanotubes (SWCNTs)on the growth of Chlorella vulgaris were investigated, respectively. Results showed that the
growth of Chlorella vulgaris could not be apparently affected by initial nano -TiO2 concentrations from 0.01mg·L -1 to
500mg·L -1. However SWCNTs could inhibit the growth of Chlorella vulgaris significantly and its 96h-EC50 was calculated
as 261.5mg·L-1 based on the experimental data. Compared with nano -TiO2, SWCNTs agglomerated and adsorbed a greater
amount of the cells of Chlorella vulgaris , which may be responsible for its higher inhibitory effect on the growth of
Chlorella vulgaris .
Keywords:Chlorella vulgaris;nano-TiO2;single-walled carbon nanotubes; toxicity
2010 年 第 5 卷
第 1 期,38-43
生 态 毒 理 学 报
Asian Journal of Ecotoxicology
Vol. 5, 2010
No. 1, 38-43
杨晓静等:纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长的抑制效应第 1 期
1 引言(Introduction)
20 世纪 80 年代以来,纳米技术和纳米材料迅
速发展,应用领域不断扩大,由此带来的生物安全
性已经成为国内外研究的热点 . 纳米材料是指几
何尺寸达到 100nm 以下水平,并具有特殊性能的
纳米效应材料(白春礼,2001). 由于纳米材料独特
的理化性质和强度高、电磁学性能好等优点,在电
子、磁学、光学、生物医学、药学、化妆品、能源、传
感器和催化等领域已被广泛应用(邹莉,2004). 纳
米材料可以通过各种途径进入环境及生物体内,
构成对环境和人体健康潜在的影响和风险,因此
纳米材料的生物学效应和环境安全问题不可忽
视,与之相关的毒理学研究十分重要(朱小山等,
2008).
近年来,国内外已对单壁碳纳米管(SWCNTs)、
纳米二氧化钛(nano-TiO2)等纳米材料的毒性效应
进行了深入研究(Nel et al . , 2006; Smart et al . ,
2006; Hurt et al . , 2006; 汪冰等,2005; 诸颖和李文
新,2008). 研究表明,SWCNTs 不仅可导致大鼠肺
组织损伤和肉芽肿的形成 (Lam et al . , 2004;
Warheit et al. , 2004),而且可引起小鼠肝脏组织蛋
白质的氧化损伤和大鼠主动脉内皮细胞的损伤
(赵明明等,2008; 林治卿等,2006). nano -TiO2 可
导致小鼠肺部组织的纤维化并有可能诱发肺癌
(朱融融等,2006),沉积在肺部的 nano-TiO2 颗粒
在体液和血液的带动下,可进一步转运至心脏、肝
脏和肾脏等器官,引起相应的毒性症状(王江雪
等,2008).
微细藻类作为水生态系统中主要的初级生产
者,可以通过光合作用固定二氧化碳合成有机物,
对整个水生态系统的平衡和稳定具有至关重要的
作用 . 在微细藻类中,小球藻在淡水、海水中均有
分布,是人类最早筛选分离出的微细藻类 . 小球藻
具有生态分布广和生长周期短等特点,可以作为
典型的实验藻种来直接观察细胞水平上的中毒症
状,是较理想的水环境生态毒理学研究的实验生
物(谢艳等,2008).
作为一种新型污染物,纳米材料可进入各种受
纳水体,对水生生态系统各级生物产生影响 . 目前
有关纳米材料对哺乳动物、鱼类等高端生物的毒
性已有大量研究(Lam et al . , 2004; 玉晓微等,
2009),但对作为水生初级生产力的微细藻类的毒
性效应研究报道极少,因此本文初步研究了
SWCNTs 和 nano-TiO2这两种重要的纳米材料对普
通小球藻生长的毒性效应,这对于评价纳米材料
的生态风险及安全性具有重要的意义 .
2 材料与方法(Materials and methods)
2.1 实验材料
普通小球藻(Chlorella vulgaris Beij)购自中科
院武汉水生生物研究所 . nano-TiO2为锐钛型(粒度
为 20 ~30nm),由北京赛特瑞试剂公司提供;
SWCNTs(直径<2nm,长度 0.5 ~50μm),由深圳市
纳米港有限公司提供 .
2.2 培养条件
采用水生 4 号培养基 (周永欣和章宗涉,
1989),初始 pH 值调为 7.0. 将小球藻藻种接种到
培养基中,连续传代培养 3 次待进入对数生长期
时进行实验 . 实验所用容器为 100mL 三角瓶,培养
量为 30mL,每组设 3 个平行样 . 小球藻培养温度
为 25℃,光照强度为 4000Lux,光暗比 12h:12h . 每
天摇瓶 2 次 . 实验所用培养基和器皿等均经过
121℃、20min 高温高压灭菌,然后在洁净工作台内
经过 20min 的紫外线杀菌后使用 . 实验开始后每
天定时取样,在光学显微镜放大 400 倍下通过血球
计数板计数藻细胞浓度 .
2.3 毒性实验
纳米材料各浓度组采用水生 4 号培养基配制,
接种前超声波充分振荡 .
采用有毒化学品对藻类毒性测试的标准实验
方法,确定纳米材料抑制普通小球藻生长的 96h 半
效应浓度 (96h -EC50)(周永欣和章宗涉,1989).
nano-TiO2实验:初始藻密度 1.9×106个·mL-1;浓度
系列:0、0.01、1、50、100、500mg·L -1;培养时间
96h. SWCNTs 实验:初始藻密度 2.1×106 个·mL -1;
初步实验纳米材料初始浓度配制呈几何级数增
加,根据 96h 实验结果采用直线内插法初步计算出
纳米材料抑制普通小球藻生长的 96h-EC50. 正式实
验纳米材料的浓度以初步实验确定的 96h -EC50 为
中心,各向两边以等差数列的形式延伸 2 个浓度,
共 1 组对照(0mg·L -1)和 5 组浓度(150、200、250、
300、350mg·L -1)进行;培养时间 96h. 每天定时取
样,在光学显微镜放大 400 倍下通过血球计数板计
39
生 态 毒 理 学 报 第 5 卷
数藻细胞浓度 . 以藻细胞浓度为指标,采用机率单
位法得到纳米材料的剂量反应方程,通过此方程
计算出 96h -EC50,并对计算出的 96h -EC50 进行 X2
检验 .
2.4 电镜实验
取培养 96h 的各实验组藻液 5mL,8000rpm 离
心 10min,弃上清,加入 2.5%戊二醛固定 2h,
8000rpm 离心 5min,弃上清 . 用磷酸盐缓冲液清洗
3 遍,每次 8000rpm 离心 5min 弃上清,然后加入
5mL 无菌水,充分混匀,在锡纸上滴加 10μL 样品,
自然晾干 . 真空干燥箱内 40℃干燥 6h . 干燥好的
样品用导电胶粘附在电镜样品台上喷碳,在 SEM
扫描电镜上进行观察 .
3 结果与分析(Results and analysis)
3.1 nano-TiO2对普通小球藻生长的影响
不同 nano -TiO2 浓度下,普通小球藻生长至
96h 的藻细胞浓度如图 1 所示 . 由图 1 可见,在
0.01~500mg·L -1 浓度范围内,nano -TiO2 对普通小
球藻的生长没有产生明显的有规律性的抑制效
应,藻细胞浓度均维持在 1.7×106个·mL-1左右 .
3.2 SWCNTs 对普通小球藻生长的影响
初步实验采用直线内插法得到 SWCNTs 抑制
普通小球藻生长的 96h-EC50 约为 250mg·L -1,在此
基础上,进一步研究了 SWCNTs 对普通小球藻生
长的抑制效应,结果如图 2 所示 . 由图可见,随
SWCNTs 浓度的升高,普通小球藻藻密度显著降低
(p<0.05). 当浓度为 300mg·L -1 时,普通小球藻的
生长受到明显的抑制 .
根据图 2 计算得到的 SWCNTs 浓度对数(x)、
细胞浓度、抑制率和机率单位(y)等指标见表 1,将
SWCNTs 浓度对数(x)与机率单位(y)进行一元线
性回归,得到如下剂量反应方程:y =2.7733x -
1.7042,R2=0.9909. 当机率单位为 5 时,通过上述
方程计算得到 SWCNTs 抑制普通小球藻生长的
96h-EC50为 261.5mg·L-1.
为了验证计算所得到的 96h-EC50的可靠性,对
上述剂量反应方程进行 X2 检验,结果见表 2. 查
X2 表,当自由度为 3 时,X 20.05 = 7.82,而 X2 计算值
为 0.59,X 20.05 > X2,故上述剂量反应方程符合精度
要求,计算得到的 96h-EC50真实可靠 .
3.3 纳米材料抑制普通小球藻生长的显微观察
为了进一步研究纳米材料抑制普通小球藻生
长的过程和机理,我们分别在光学和电子显微镜
下对纳米材料和普通小球藻相互作用的现象进行
了观察 . 在光学显微镜放大 400 倍下,普通小球藻
细胞呈圆形分散分布(图 3a),SWCNTs 会发生一
表 1 单壁碳纳米管抑制普通小球藻生长的实验结果
Table 1 Result of inhibition effect of SWCNTs on the
growth of Chlorella vulgaris
SWCNTs浓度
/(mg·L-1)
浓度对数
(x)
细胞浓度/
(×104个·mL-1) 抑制率/%
机率单位
(y)
0 — 2138 0 —
150 2.176 1625 23.98 4.29
200 2.301 1302 39.06 4.72
250 2.398 1082 49.36 4.97
300 2.477 920 56.96 5.18
350 2.544 820 61.64 5.31
40
杨晓静等:纳米二氧化钛和单壁碳纳米管对普通小球藻生长的抑制效应第 1 期
定的凝聚形成较大的颗粒(图 3b). 当 SWCNTs 与
普通小球藻同时存在时,发现在团聚的 SWCNTs
周围吸附了大量的普通小球藻细胞,形成了更大
的颗粒物(图 3c). 而 nano-TiO2基本呈现分散分布
且不发生团聚(图 3d),当与普通小球藻同时存在
时,二者也基本呈现分散分布状态,没有形成大颗
粒的凝聚现象(图 3e).
电镜观察结果与光学显微镜观察结果基本一
致 . 普通小球藻细胞呈圆形分散分布(图 4a),
SWCNTs 发生凝聚形成较大的颗粒(图 4b),当
SWCNTs 与普通小球藻共存时,在团聚的 SWCNTs
颗粒周围吸附了大量的普通小球藻细胞,形成了
更大的颗粒物(图 4c). 而 nano-TiO2与普通小球藻
同时存在时,虽然普通小球藻周围也存在一些
nano-TiO2(图 4d),但基本呈现分散分布,没有形成
由上述两种物质组成的较大颗粒(图 4c). 因此
SWCNTs 吸附大量的普通小球藻细胞形成较大的
颗粒,影响了普通小球藻的光合作用及代谢可能
是 SWCNTs 对普通小球藻生长抑制程度远高于
nano-TiO2的主要原因 .
4 讨论(Discussion)
通常认为纳米材料的毒性与纳米颗粒的粒径
和比表面积有关,粒径越小,比表面积越大,与细
表 2 剂量反应方程的 X2检验
Table 2 The X2 test of the linear dose-response equations
SWCNTs浓度对数
(x) 机率单位(y) 反应率(p)
对照反应率
(k) 实际反应率(r)/% kp r-kp (r-kp)
2/[kp(1-p)]
2.176 4.331 0.25 100 23.98 25 -1.02 0.055
2.301 4.677 0.37 100 39.06 37 2.06 0.182
2.398 4.946 0.48 100 49.36 48 1.36 0.074
2.477 5.166 0.56 100 56.96 56 0.96 0.037
2.544 5.351 0.64 100 61.64 64 -2.36 0.242
X2 0.59
41
生 态 毒 理 学 报 第 5 卷
胞接触的区域越多,更有利于纳米颗粒的吸收和
转运,更容易引起细胞膜结构的改变,纳米材料毒
性效应也就越大(Teeguarden et al., 2007). SWCNTs
有较大的比表面积,由于其具有独特的表面化学
和电输运特性,可能引发电子转移导致细胞结构
损伤、功能紊乱甚至坏死 (Lam et al. , 2006).
SWCNTs 会引起巨噬细胞的染色质浓缩、细胞器缩
小、细胞质中小泡缩小变形等现象,并可能与细胞
凋亡有关(孟幻等,2006). 另外,SWCNTs 表面带
有大量具有强氧化还原性质的电子簇,可能会与
细胞表面的载体通道、各种受体结合,使蛋白质的
结构发生变化,导致羰基含量增多;进入细胞的
SWCNTs 也可能与酶结合使酶失活,还有可能通过
二次氧化或还原产生大量的有害自由基从而改变
组织内蛋白质的结构,破坏细胞内有序结构和正
常的代谢功能(冯晶等,2006).
nano-TiO2 具有很强的吸附能力和良好的光学
催化特性,因为纳米颗粒大小与生物分子相差不
大,其被生物体摄取后很容易进入到细胞中,因此
造成毒性效应 . Lu 等(2003)用 nano-TiO2培养大肠
杆菌,结果发现大肠杆菌细胞壁被降解,出现细胞
膜损伤,细胞的通透性受到破坏,引起细胞内容物
外流,最终导致细胞死亡 . 目前,对 nano-TiO2 的生
物毒性作用机制尚未完全了解,但其具有的光学
催化特性、活性氧簇 ROS 的产生及体内氧化应激
反应的增强可能是其最主要的致毒作用机制(Nel
et al. , 2006). 当用波长小于 400nm 的紫外线照射
nano-TiO2 时,在水溶液环境下,nano-TiO2 颗粒表
面会产生具有强氧化能力的自由基 -·OH 和 O2·-,
而羟基自由基可以与 DNA 发生反应生成 8 -羟基
鸟苷,导致 DNA 的解旋和氧化损伤,进而抑制细
胞的生长(朱融融等,2005).
虽然纳米材料对微生物和动物细胞毒性及机
理方面已有大量研究报道,但对生态系统初级生
产力微细藻类的毒性研究方面却报道很少 . 本研
究通过采用有毒化学品对藻类毒性测试的标准实
验方法,比较了 nano-TiO2 和 SWCNTs 对普通小球
藻生长的抑制效应,结果表明在 500mg·L-1范围内
nano -TiO2 对普通小球藻生长的抑制效应不明显
(图 1),而 SWCNTs 却可显著抑制普通小球藻的生
长,其 96h-EC50 为 261.5mg·L -1(图 2),SWCNTs 对
普通小球藻生长的抑制毒性效应远大于 nano -
TiO2. 进一步通过光学和电子显微镜观察发现,
nano-TiO2在水体中基本呈现分散分布且不发生团
聚,当与普通小球藻同时存在时,虽然在小球藻细
胞周围也吸附少量的 nano-TiO2,但仍然没有形成
大颗粒的凝聚现象(图 3 和图 4),因此对普通小球
藻的光合作用及代谢影响较小 . 与之相反,
SWCNTs 在水体中会发生凝聚现象形成较大的颗
粒,在与普通小球藻共存时,会吸附大量的小球藻
进而形成更大的颗粒(图 3 和图 4),因此阻碍了普
通小球藻吸收光和代谢的效率,进而严重抑制了
普通小球藻的生长 . 研究表明,活性氧 ROS 的生
成和氧化应激反应也是碳纳米管细胞毒性的重要
方 式 (Nel et al . , 2006; Lam et al . , 2006),在
SWCNTs 对小球藻生长抑制过程中 ROS 和氧化应
激是否起作用值得进一步研究 .
大量研究表明,纳米材料的小尺寸效应和其诱
导产生的氧化应激反应是其细胞毒性产生的主要
原因(Nel et al. , 2006),本研究结果显示,在一定
环境条件下所形成的颗粒大小及对细胞的吸附作
用可能也是影响其细胞毒性效应的原因之一 .
通讯作者简介:闫海(1962—),男,博士,教授,博士生导
师,北京科技大学应用科学学院生物技术系主任,主要
研究方向为微细藻类和微生物的环境生物技术 .
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