全 文 ：临 床 及 实 验 研 究
油菜花粉与蒿草花粉存在交叉反应的实验研究
许　 1 , 陈德宇2 , 吕晓雅1 , 李　燎1 , 陈文碧2
(1.泸州医学院附属医院皮肤科 , 四川　泸州　646000;2.泸州医学院寄生虫学教研室)
　　摘　要:目的:证实油菜花粉和蒿草花粉存在共同抗原决定簇和交叉反应 。方法:采用 SDS-PAGE电泳及考马
斯亮兰染色分析两种花粉蛋白质组份;用 Dot-ELISA交叉测定两种花粉豚鼠抗血清中 IgG 抗体 。结果:油菜花粉显
带 16条 , 分子量在9 ～ 97kDa之间;蒿草花粉仅显带 6条 , 分子量在 11 ～ 67kDa之间 。Dot-ELISA检测发现两种花粉
提取液均能与相应豚鼠抗血清发生反应 , 且两种花粉抗原与抗血清发生交叉反应 。结论:油菜花粉与蒿草花粉提取
液蛋白质组份差异较大 , 前者更复杂;但二者间存在共同抗原决定簇 , 可发生交叉过敏 。
关键词:油菜花粉;蒿草花粉;交叉反应;实验室诊断
中图分类号:R 363.1+4;R 392.8　　文献标识码:A　　文章编号:1002-1310 (2001)02-0003-02
Study On Cross-reaction Lying between Oilseed Rape Pollen Extract and Mugwort Pollen Extract
XU Yang , CHEN De-yu , LU Xiao-ya et al
(Department of Dermatology , Lu Zhou Medical College Affiliated Hospital , Lu zhou city , Sichuan province China)
Abstract:Objective:To approve there are commen antigen epitopes and cross-reaction lying between oilseed rape (Brassica campestris L.)pollen extract and
mugwort (Artemisia L.)pollen extract.Methods:Home-made oilseed pollen extract was prepared according to previous method.Both pollen protein components
were compared by SDS-PAGE and Coomassie Blue staining and Cuinea-pig serum IgG antibody immuned by these two pollen extracts were detected by Dot-
ELISA.Results:Both pollen protein electrophorograms were quite different from each other and without any protein of equal molecular weight.Oilseed rape pollen
extract showed sixteen bandswith molecular weight between 9～ 97kDa.Six of them were main bandswhose molecular weight was 97kDa , 71kDa , 62kDa , 45kDa ,
38kDa and 9kDa respectively.Only six bands were showed inmugwort pollen extract withmolecular weight region from 11～ 67kDa , and every bandwas quite clear.
Dot-ELISA results revealed that both Guinea-pig serum IgG antibody stimulated by these two pollen reacted with their corresponding pollen antigen, and anti-
oilseed rape pollen serum showed relatively lower titer.Meanwhile , not only anti-mugwort pollen serum obviously reacted with oilseed rape pollen antigen (serum
titer 1∶64), but anti-oi lseed rape pollen serum also reactedwith mugwort pollen antigen visibly (serum titer 1∶4).Conclusion:Although the protein components
of oilseed rape pollen extract and mugwort pollen extract are quite different from each other andoilseed rape pollen extract is relatively complex , they remain commen
antigen epitopes and cross-reaction.
Key words:Oilseed rap pollen;Mugwortpollen;cross-reaction;laboratory diagnosis
　　油菜是重要的经济作物之一 , 花期长 , 花粉产量大 , 与
人类接触机会较多。 近年来 , 随着油菜耕种面积的不断增
加 , 油菜花粉的致敏性受到重视。 1996 年英国一项调查发
现:部分异位性皮炎患者与油菜花粉过敏有关 , 但单一油菜
花粉过敏者非常少见〔1〕。1998年 Focke等研究发现油菜花粉
与桦树花粉和黑麦草花粉有交叉反应。但未发现油菜花粉与
蒿草花粉存在共同抗原决定簇和交叉反应〔2〕。本文以油菜花
粉与致敏性肯定的蒿草花粉变应原作对照 , 分析二者蛋白质
组分的差异 , 检测豚鼠免疫血清中 IgG 抗体 , 旨在探讨两种
花粉间是否存在共同抗原决定簇及交叉反应, 从交叉过敏这一
角度为油菜花粉的致敏性提供实验依据。现将结果报告如下:
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　油菜花粉变应原浸液的制备　参照张庆松等介绍的方
法〔3〕 。在油菜花盛开季节自泸州市郊采集油菜花 , 晾干后分
离花蕊及花粉 , 用组织匀浆器研磨粉碎后 , 过 80目/mm2 尼
龙网筛除去粗渣 。再经乙醚脱脂后 , 按 1∶20加甘油 CoCa提
取液 。置冰箱 4℃冷浸 72h , 并经常摇荡和搅拌 。以 1500转/
分 (rpm)离心 15min , 取上清液置 8 ～ 15kDa透析袋中透析浓
缩后 , 调 PH为 7.0 , 经滤菌膜抽滤除菌即为自制油菜花粉变
应原浸液 , 浓度 14%, 置冰箱-20℃备用 。
1.1.2　蒿草花粉变应原浸液购自北京协和医院变态反应科。
1.1.3　标准分子量蛋白购自上海华舜生物工程有限公司 。
1.1.4　豚鼠两只 , 雄性 , 200±50克 , 由泸州医学院动物科
提供 。
1.2　方法
1.2.1　聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)　按 Laemmli的
方法〔4〕 , 采用不连续系统进行垂直平板电泳 , 对两种花粉变
应原浸液进行蛋白质组分分析 。浓缩胶浓度 4.8%, 分离胶
3皮肤病与性病　2001年第 23卷　第 2期
收稿日期:2000—04—07
浓度12%, 经稳压电泳 6h后用考马斯亮兰染色 。
1.2.2　抗血清制备　按照多途径注射免疫方法〔5〕 。分别用两
种花粉粗抗原与等量福氏完全佐剂混合物免疫两只豚鼠 , 每
周免疫一次 , 每次总量 0.3ml , 四周为一免疫程 。第六周用
不加佐剂的等量抗原肌肉内加强注射一次 , 第七周断头取血
分离血清 。免疫前心脏穿刺取血 , 分离血清作为阴性对照 ,
置-20℃保存备用 。
1.2.3　间接 Dot-ELISA检测两种花粉抗血清中 IgG抗体　参
照Hawkes的方法〔4〕 , 在抗原滴加方法上稍加改进 。将 NC膜
(浙江黄岩人民化工厂生产)夹于两张清洁滤纸间 , 用小试
管底部加压打印后 , 于 PH7.4的 PBS液中平衡 2h。分别用两
种花粉抗原点样 20孔 (2μl/孔), 4℃湿盒孵育过夜 。次日常
规小牛血清封闭 、洗涤 、吹干 。分别用两种抗血清与两种花
粉抗原作交叉测定 , 每组 10孔 , 共 4组 , 每组设一阴性对
照 。每孔滴加 20μl倍比释释待检血清 。阴性对照孔加 1∶1稀
释的阴性对照血清 20μl , 置 37℃湿盒孵育 2h。取出 NC 膜 ,
常规洗涤吹干 。每孔滴加 20μl HRP-SPA (上海荣盛生物试
剂厂生产 , 工作浓度 1∶400), 置 37℃湿盒孵育 2h 。取出 NC
膜 , 同前洗涤 3次后置二胺基联苯胺 (DAB)底物液中 (临
用时加入 30%双氧水 50μl)作用至显色 , 迅速用自来水冲
洗 , 冷风吹干 , 观察结果 。
2　结果
2.1　两种花粉提取液经 SDS-PAGE及考马斯亮兰染色后显
出较多的蛋白质条带 。二者带谱明显不同 , 未见相同分子量
条带 。油菜花粉显带 16条 , 分子量在 9 ～ 97kDa 之间 。其中
主带 6 条 , 分子量分别为 97kDa 、 71kDa 、 62kDa 、 45kDa 、
38kDa和 9kDa 。蒿草花粉显带 6条 , 分子量分别为 67kDa 、
65kDa 、 40kDa、 30kDa、 26kDa和 11kDa。其中 40kDa及 30kDa
组分条带较宽 , 染色较深 。含量较高 , 为主带 。
2.2　间接 Dot-ELISA 检测结果发现两种花粉抗原分别能与
相应豚鼠抗血清中 IgG抗体发生特异性结合 。其中蒿草花粉
抗血清滴度高达 1∶128;油菜花粉抗血清滴度较低 , 仅 1∶32。
同时还发现不仅蒿草花粉抗血清与油菜花粉抗原明显发生结
合 (血清滴度 1∶64), 而且油菜花粉抗血清也与蒿草花粉抗
原发生可见的反应 (血清滴度 1∶4)。
3　讨论
油菜具有较大的经济价值 , 世界各地广泛种植 。因此 ,
油菜花粉成为近年来国外对致敏花粉的研究热点之一 。Singh
等曾用 SDS-PAGE及考马斯亮兰染色发现自制油菜花粉提取
液显带 14条 , 银铵染色显带 50多条〔7〕 。提示油菜花粉蛋白
质组分较多 。本实验用 SDS-PAGE及考马斯亮兰染色发现自
制油菜花粉提取液显带 16条 , 分子量在 9 ～ 97kDa 之间 。其
中主带 6 条 , 分子量分别为 97kDa 、 71kDa 、 62kDa、 45kDa 、
38kDa和 9kDa 。此结果与 Singh等的结果相似 。其中显带的差
异应考虑与油菜花粉种株间的差异有关 。与油菜花粉相比 ,
蒿草花粉抗原组份明显较少 , 仅显带 6条 。本实验发现油菜
花粉与蒿草花粉豚鼠抗血清分别能与相应花粉抗原发生反
应 。表明两种花粉均具有抗原性 , 能刺激豚鼠产生 IgG抗体 。
同时也说明本自制油菜花粉蛋白质提取液较好地保存了油菜
花粉的蛋白质成分和抗原性 。
Focke等的研究曾发现过敏患者血清中能与油菜花粉结
合的 IgE抗体未显示与蒿草花粉发生结合 , 因而认为油菜花
粉与蒿草花粉不存在共同抗原决定簇和交叉反应〔2〕。但本实
验发现油菜花粉和蒿草花粉与豚鼠抗血清产生明显的交叉反
应 , 表明油菜花粉与蒿草花粉存在共同抗原决定簇 , 可产生
交叉过敏 。两种结果差异的原因可能是:本实验选用较敏感
的免疫动物和有效的免疫途径制备肯定的油菜花粉抗血清 ,
采用敏感的 Dot-ELISA法检测血清中较稳定的 IgG 抗体 , 而
不是易衰变的 IgE抗体 , 最终出现了可见的交叉反应。提示
油菜花粉与蒿草花粉存在共同抗原决定簇 。同时 , 本结果与
Focke等研究结果的差异也应考虑与不同种株油菜花粉的差
异有关 。油菜花粉组份多 , 在免疫豚鼠时 , 存在抗原间的免
疫竞争抑制效应 , 致使油菜花粉抗血清滴度较低 (仅 1∶32),
而其中针对蒿草花粉的共同抗原决定簇的抗体滴度更低 (1∶
4)。尽管交叉反应滴度较低 , 但油菜花粉与蒿草花粉存在共
同抗原决定簇和交叉反应的发现 , 却为油菜花粉这种尚未得
到普遍认识的致敏花粉的致敏性提供了又一佐证。可以认
为 , 这两种季节明显不同的花粉可通过交叉反应 , 使油菜花
粉过敏或蒿草花粉过敏失去原本明显的季节性而出现常年过
敏的复杂情况 。因此具有重要的理论意义 。本实验以动物免
疫血清代替患者血清探讨油菜花粉致敏性 , 较好地避免了患
者血清中存在多种花粉抗体的干扰 , 为特定花粉的致病性研
究提供了新途径 。进一步的研究可通过免疫印迹实验 , 探索
油菜花粉与蒿草花粉共同抗原决定簇的特异性条带及其与交
叉过敏的关系 。
参考文献
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4 J Dermatology and Venereology , 2001, Vel 23, No.2