全 文 ：第４０卷　第８期
２０１２年８月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４０ Ｎｏ．８
Ａｕｇ．２０１２
网络出版时间：２０１２－０７－１８　１１：１０
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１２０７１８．１１１０．０２７．ｈｔｍｌ
天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立
＊
张晓林１ａ，陆秀君１ａ，１ｂ，马蓓蓓１ａ，徐　凯２
（１沈阳农业大学ａ林学院，ｂ设施园艺省部共建教育部重点实验室，辽宁 沈阳１１０８６６；２沈阳市青年苗圃，辽宁 沈阳１１０８６６）
［摘　要］　 【目的】探索一套适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系，为研究其种子萌发过程中的蛋白表达
差异奠定基础。【方法】比较蛋白的不同提取方法（酚提取法、三氯乙酸－丙酮－酚提取法、三氯乙酸－丙酮法和Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
法）、ＩＰＧ胶条ｐＨ梯度（ｐＨ３～１１ＮＬ、ｐＨ３～１０和ｐＨ４～７）、裂解液中的尿素浓度（６，７，８，９ｍｏｌ／Ｌ）和分离胶浓度
（１０％和１２．５％）等条件，对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响，筛选适宜的双向电泳条件。【结果】以Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
法提取种子蛋白，在ＩＰＧ胶条ｐＨ为４～７、裂解液中尿素浓度为９ｍｏｌ／Ｌ、分离胶浓度为１２．５％的条件下，可以获得分
辨率高、背景清晰、重复性好的天女木兰种子蛋白双向电泳图谱。【结论】建立了适用于天女木兰种子蛋白的双向电
泳体系。
［关键词］　天女木兰；种子；双向电泳；蛋白质
［中图分类号］　Ｑ５０３ ［文献标识码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１２）０８－０２０７－０８
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ
Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉ　Ｋ．Ｋｏｃｈ　ｓｅｅｄｓ
ＺＨＡＮＧ　Ｘｉａｏ－ｌｉｎ１ａ，ＬＵ　Ｘｉｕ－ｊｕｎ１ａ，１ｂ，ＭＡ　Ｂｅｉ－ｂｅｉ　１ａ，ＸＫａｉ　２
（１ａＣｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，ｂ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ１１０８６６，Ｃｈｉｎａ；２　Ｓｈｅｎｙａｎｇ　Ｃｉｔｙ　Ｙｏｕｔｈ　Ｎｕｒｓｅｒｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，Ｌｉａｏｎｉｎｇ１１０８６６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ａ　ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　Ｋ．Ｋｏｃｈ　ｓｅｅｄｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗｉｌ　ｌａｙ　ａ　ｓｔｒｏｎｇ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｐｒｏ－
ｔｅｏｍｉｃｓ　ｏｆ　ｓｅｅｄ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　２－ＤＥ　ｇｅｌｓ　ｔｈａｔ　ｗｅｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ （Ｐｈｅｎｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ＴＣＡ－Ａｃｅｔｏｎｅ　Ｐｈｅｎｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ，ＴＣＡ－Ａｃｅｔｏｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
ｍｅｔｈｏｄ）ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ，ｔｈｅ　ｐＨ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｏｆ　ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐ（ｐＨ３－１１ＮＬ，ｐＨ３－１０ａｎｄ　ｐＨ４－７），ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ　ｕｒｅａ（６，７，８，９ｍｏｌ／Ｌ）ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｇｅｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（１０％ａｎｄ　１２．５％）ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ．【Ｒｅ－
ｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｃｌｕｄｅｄ　ｔｈｅ　ｆｏｌｏｗｉｎｇ　ｓｔｅｐｓ：ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　Ｋ．Ｋｏｃｈ
ｓｅｅｄ　ｂｙ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｐＨ４－７ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐｓ，ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｌｙ－
ｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　９ｍｏｌ／Ｌ　Ｕｒｅａ　ａｎｄ　ｒｕｎｎｉｎｇ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｗｉｔｈ　１２．５％ｇｅｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ
ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｉｓ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　２－ＤＥ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄｓ．【Ｃｏｎｃｌｕ－
ｓｉｏｎ】Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　２－ＤＥ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ’ｓｅｅｄ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ；ｓｅｅｄ；ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２－ＤＥ）；ｐｒｏｔｅｉｎ
　　天女木兰（Ｍａｇｎｏｌｉａ　ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　Ｋ．Ｋｏｃｈ）为木 兰科木兰属的落叶小乔木，是国家重点保护的珍稀
＊ ［收稿日期］　２０１１－１２－１９
［基金项目］　国家自然科学基金面上项目（３１０７０５６１）；辽宁省百千万人才资助项目（２００９９２１０７１）
［作者简介］　张晓林（１９８６－），男，天津人，在读硕士，主要从事林木生物技术研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｎ＿２５６８３９２１＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
［通信作者］　陆秀君（１９６６－），女，辽宁沈阳人，教授，博士，主要从事种子生理生化及苗木栽培研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｘｉｕｊｕｎ１９９３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
濒危植物，集观赏、天然香料提取和药用价值于一
身。由于种胚发育不完全、种子中含有萌发抑制物
质等因素，导致其种子具有深休眠特性，需特殊处理
４～５个月才可萌发［１－２］。到目前为止，关于天女木
兰种子休眠解除的机理尚不清楚。因此，运用蛋白
质组学理论研究其种子休眠解除的分子机理及萌发
阶段的生物学变化，对于从整体水平上探讨木兰属
植物种子休眠解除的分子机理具有重要意义。
双向电泳（２－ＤＥ）技术由Ｏ’Ｆａｒｒｅｌ［３］在１９７５年
建立，该技术将等电点和分子质量２个特性结合起
来分离蛋白，具有较高的灵敏度和分辨率，是研究蛋
白质组的核心技术［４］，已成为从复杂体系中检测和
分析蛋白质的一种强有力的生化手段［５］。目前，植
物蛋白质组学方面的研究对象主要是模式植物，如
拟南芥、小麦、水稻和玉米等［６－７］，近年在植物种子蛋
白质组学方面已经取得了一些重要成果［８－９］。
Ｍｅｃｈｉｎ等［１０］运用２－ＤＥ和ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技术鉴定了
玉米胚乳蛋白４９６个，初步建立了玉米胚乳蛋白质
表达图谱；Ｙａｎｇ等［１１］对水稻种子萌发不同时期蛋
白质组的变化进行了研究，共鉴定了１４８个差异蛋
白；Ｇａｌａｒｄｏ等［１２］运用蛋白质组学对拟南芥种子的
萌发过程进行了研究，共鉴定了７４个蛋白。此外，
有关与种子休眠相关蛋白质组及种子萌发相关蛋白
质组等方面的研究也有报道［１３－１４］。针对林木种子蛋
白质组及双向电泳技术的研究报道也较多。王一鸣
等［１５］发现，采用１７ｃｍ胶条、１００μｇ蛋白质上样量、
银染方法，可以得到有１　２０９个蛋白点的桃果实双
向电泳图谱，适用于桃果实的蛋白质组学分析；李
蕾［１６］在对无核荔枝种子的研究中，利用 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
提取法，并在提取液中加入质量分数１０％交联聚乙
烯吡咯烷酮（ｐｖｐ４０），可以得到较清晰的蛋白质图
谱；刘浩［１７］研究发现，酚提取法更适用于龙眼种子
蛋白质组学的研究；Ｌｉｕ等［１８］利用双向电泳技术，比
较了麻风树种子胚和胚乳中蛋白质的差异；Ｔｏ－
ｍａｓｚ［１９－２０］在蛋白质组水平上先后报道了欧洲山毛榉
和挪威枫种子的休眠解除机理。但目前尚未见对天
女木兰蛋白质组学的研究报道。
植物组织中所含的色素、酚、有机酸、酯类及其
他次级代谢产物，会严重干扰蛋白质的提取和电泳
结果，进而加大植物蛋白质组学研究的难度，因此，
在制备蛋白质样品时，应尽可能去除这些严重影响
双向电泳结果的干扰物［２１］。目前蛋白质的提取方
法很多，但由于样品的多样性，并没有一种适用于各
种样品的通用方法。为此，本试验探索了蛋白质提
取方法、等电聚焦（ＩＥＦ）胶条ｐＨ范围、裂解液中的
尿素浓度和分离胶浓度对天女木兰种子蛋白双向电
泳结果的影响，建立了天女木兰种子蛋白的双向电
泳体系，以期为研究天女木兰种子萌发过程中蛋白
质的差异表达奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
供试天女木兰种子采自沈阳农业大学植物园。
１．２　主要仪器和试剂
Ｍａｎｉｆｏｌｄ胶条槽、Ｅｔｔａｎ　ＩＰＧｐｈｏｒⅢ等电聚焦
仪、ＳＥ　６００Ｒｕｂｙ垂直电泳仪、Ｍｕｌｔｉ　ＴｅｍｐⅢ温度控
制仪，均为ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ公司产品；ＵＭＡＸ　Ｐｏｗｅｒ
ｌｏｏｋ　２１００ＸＬ扫描仪，购自ＵＭＡＸ公司。
ＩＰＧ胶条、两性电解质，购自ＧＥ公司；二硫苏
糖醇（ＤＴＴ）、３－［（３－胆固醇氨丙基）二甲基氨基］－１－
丙磺酸（ＣＨＡＰＳ）、四甲基乙二胺（ＴＥＭＥＤ）、碘乙
酰胺、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、乙二胺四乙酸（ＥＤ－
ＴＡ）、聚氧乙烯辛基苯基醚（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）、三羟甲
基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），购自Ｓｉｇｍａ公司；尿素、硫脲、交
联聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰＰ）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯
酰胺、十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ）、过硫酸铵（ＡＰ）、β－巯
基乙醇、Ｔｒｉｓ饱和酚、磷酸三丁醇酯（Ｔｒｉｂｕｔｙｌｐｈｏｓ－
ｐｈｉｎｅ，ＴＢＰ），均购自 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；其余试剂均为
国产分析纯，所有溶液均用超纯水配制。
１．３　天女木兰种子蛋白的提取方法
１．３．１　酚提取法　参照Ｓａｒａｖａｎａｎ等［２２］的方法并
略有改进。取３ｇ天女木兰种子，去掉外种皮后在
液氮中迅速研磨成粉末；加入１０ｍＬ预冷的提取液
（含质量分数 １％ ＰＶＰＰ，０．７ ｍｏｌ／Ｌ 蔗糖，０．１
ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，０．５ ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．５ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，体积分数２％β－
巯基乙醇），４℃放置１５～３０ｍｉｎ，加入等体积酚，４
℃放置３０ｍｉｎ。４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ；酚相
移出后，用提取液重提２～３次；加５倍体积的０．１
ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵甲醇（－２０℃预冷），－２０℃放置１ｈ
或过夜；４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，加入
５倍体积预冷的体积分数８０％丙酮（含体积分数
０．０７％β－巯基乙醇）清洗，充分混匀后于－２０℃静
置３０ｍｉｎ，４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，重
复６次，冷冻干燥后于－７０℃保存备用。
１．３．２　三氯乙酸（ＴＣＡ）－丙酮－酚提取法　参照
Ｗｅｉ等［２３］的方法并略有改进。取３ｇ天女木兰种
子，去掉外种皮后在液氮中迅速研磨成粉末；加入
８０２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷
３０ｍＬ预冷的丙酮溶液（含质量分数１０％ ＴＣＡ和
体积分数０．０７％β－巯基乙醇）。４℃下１５　０００　ｇ离
心３０ｍｉｎ，弃上清，加入５倍体积的体积分数８０％
甲醇（含０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵），４℃下１５　０００　ｇ离心
３０ｍｉｎ，弃上清；用５倍体积预冷的体积分数８０％丙
酮（含体积分数０．０７％β－巯基乙醇）清洗沉淀，直至
蛋白质全部散开，４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ；干
燥，室温或３０℃至少孵化１０ｍｉｎ（去除丙酮）。在干
燥的蛋白质中加入等体积或等质量的苯酚和ＳＤＳ
提取液（含质量分数２％ＳＤＳ，质量分数１％ ＰＶＰＰ，
０．７ｍｏｌ／Ｌ 蔗糖，０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ，０．５ｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ
７．５ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，５０ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＰＭＳＦ，体积分数２％β－巯基乙醇），混匀后于４℃放
置５ｍｉｎ；４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ；移出酚相到
新管，加入５倍体积的０．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸铵甲醇（－２０
℃预冷），在－２０℃贮藏１ｈ或过夜。４℃下１５　０００
ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清；用体积分数１００％甲醇清洗
沉淀１次，充分混匀后于－２０℃静置３０ｍｉｎ，４℃下
１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，再用体积分数８０％ 丙
酮（含体积分数０．０７％β－巯基乙醇）洗１次，充分混匀
后于－２０℃静置３０ｍｉｎ，４℃下１５　０００　ｇ离心３０
ｍｉｎ，弃上清，冷冻干燥后于－７０℃保存备用。
１．３．３　三氯乙酸（ＴＣＡ）－丙酮法　参照Ｄａｍｅｒｖａｌ
等［２４］的方法并略有改进。取３ｇ天女木兰种子，去
掉外种皮后在液氮中迅速研磨成粉末；加入３０ｍＬ
预冷的丙酮溶液（含质量分数１０％ ＴＣＡ和体积分
数０．０７％β－巯基乙醇），充分混匀后，－２０℃静置
３０ｍｉｎ或过夜；４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上
清；加入５倍体积预冷的体积分数８０％丙酮（含体
积分数０．０７％ β－巯基乙醇）清洗，充分混匀后于
－２０℃静置３０ｍｉｎ，４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，
弃上清，重复６次，冷冻干燥后于－７０℃保存。
１．３．４　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法　参照Ｌｉｕ等［１８］的方法并略有
改进。取３ｇ天女木兰种子，去掉外种皮后在液氮
中迅速研磨成粉末；加入１０ｍＬ 提取液（含２０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐＨ　７．５Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５０ｍｍｏｌ／Ｌ 蔗糖，１０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ　ＰＭＳＦ，１ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＤＴＴ，体积分数１％ Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００），于４℃放置３０
ｍｉｎ，４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃沉淀；加入４倍
体积的质量分数５０％ＴＣＡ，充分混匀后－２０℃放置
１ｈ，期间振荡２次。４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃
上清，加入５倍体积预冷的体积分数８０％丙酮（含体
积分数０．０７％β－巯基乙醇）清洗，充分混匀后于－２０
℃静置３０ｍｉｎ，４℃下１５　０００　ｇ离心３０ｍｉｎ，弃上清，
重复６次，冷冻干燥后于－７０℃保存备用。
１．４　裂解液中尿素浓度的筛选
称取５ｍｇ蛋白干粉至５００μＬ裂解缓冲液中，
裂解液中尿素浓度分别设为６，７，８和９ｍｏｌ／Ｌ，其
他成分（２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，质量分数０．００１％ 溴酚蓝，
体积分数２％ＩＰＧ　Ｂｕｆｆｅｒ，质量分数４％ＣＨＡＰＳ，体
积分数１％ ＴＢＰ，质量分数１％ ＤＴＴ，体积分数１％
鸡尾酒）不变。涡旋混匀后，３０ ℃ 下水浴 ３ｈ，
１３　０００　ｇ常温离心１０ｍｉｎ，取上清。蛋白质定量参
照Ｂｒａｄｆｏｒｄ［２５］的方法，测定５９５ｎｍ下的样品吸光
值，计算裂解液中蛋白质的浓度。
１．５　双向等电聚焦电泳
采用１１ｃｍ（ｐＨ３～１１ＮＬ）ＩＰＧ胶条进行等电聚
焦，上样量和上样体积分别为２００μｇ和２００μＬ，根
据测定的裂解液中的蛋白浓度，向胶条槽中加入含
有２００μｇ蛋白样品的裂解液，并用未溶解蛋白的裂
解液补齐至２００μＬ。将胶条胶面朝下放入胶条槽
中，加入适量覆盖油，防止水化液蒸发，盖上胶条槽
盖；水平置于Ｅｔｔａｎ　ＩＰＧｐｈｏｒⅢ等电聚焦仪上，选择
适合天女木兰种子蛋白分离的ＩＰＧ胶条ｐＨ 梯度，
分别对ｐＨ　３～１１ＮＬ、ｐＨ　３～１０、ｐＨ　４～７的ＩＰＧ
胶条的分离效果进行比较，设置参数如表１所示。
表１　天女木兰种子蛋白的双向等电聚焦电泳参数
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｐａｒａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
聚焦程序
Ｆｏｃｕｓ　ｐｒｏｇｒａｍ
电压／Ｖ
Ｖｏｌｔａｇｅ
升压方式
Ｗａｙｓ　ｔｏ　ｂｏｏｓｔ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ
时间／ｈ
Ｔｉｍｅ
作用
Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
Ｓ１　 ５０ 快速Ｆａｓｔ　 １２ 水化 Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ
Ｓ２　 １００ 快速Ｆａｓｔ　 ３ 除盐 Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ
Ｓ３　 ２５０ 快速Ｆａｓｔ　 ３ 除盐 Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ
Ｓ４　 ５００ 快速Ｆａｓｔ　 ３ 除盐 Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ
Ｓ５　 １　０００ 快速Ｆａｓｔ　 １ 除盐 Ｄｅｓａｌｉｎａｔｉｏｎ
Ｓ６　 ６　０００ 线性Ｌｉｎｅ　 ３ 升压Ｂｏｏｓｔ
Ｓ７　 ６　０００ 快速Ｆａｓｔ　 ３０　０００Ｖｈ 聚焦Ｆｏｃｕｓ
Ｓ８　 ５００ 快速Ｆａｓｔ　 ２４ 稳定Ｓｔａｂｌｅ
９０２第８期 张晓林，等：天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立
１．６　胶条平衡
ＩＰＧ胶条等电聚焦后，将胶条表面的矿物油吸
净，转入水化盘，采用两步平衡法，在平衡液Ⅰ（含６
ｍｏｌ／Ｌ尿素，质量分数２％ＳＤＳ，体积分数２０％甘
油，０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８），质量分数２％二
硫苏糖醇）和平衡液Ⅱ（含６ｍｏｌ／Ｌ尿素，质量分数
２％ＳＤＳ，体积分数２０％甘油，０．０５ｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
（ｐＨ８．８），质量分数２．５％碘乙酰胺）中各平衡１５
ｍｉｎ，并在摇床上缓慢摇动。平衡结束后将胶条表
面的液体吸净备用。
１．７　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳与染色
平衡后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，将平衡好的胶条
移至玻璃板之间的胶面上，放入ＳＥ　６００Ｒｕｂｙ垂直
电泳仪中进行电泳，先５ｍＡ／胶３０ｍｉｎ，然后２５
ｍＡ／胶４ｈ，待示踪溴酚蓝移至凝胶底部边缘时停止
电泳。比较１０％和１２．５％分离胶的蛋白点分离效
果，采用硝酸银染色法对凝胶进行染色。
１．８　图像扫描与数据分析
用ＵＭＡＸ　Ｐｏｗｅｒ　ｌｏｏｋ　２１００ＸＬ扫描仪采集凝
胶图像，用ＰＤＱｕｅｓｔ７．３．１ｓｏｆｔｗａｒｅ软件对电泳图谱
进行分析。
２　结果与分析
２．１　不同提取方法对天女木兰种子蛋白双向电泳
结果的影响
蛋白样品质量的好坏直接影响着双向电泳结果
的分辨率和可靠性，因此蛋白样品制备是取得良好
双向电泳结果的关键步骤之一。图１显示，在相同
的电泳条件下，用４种方法均获得了天女木兰种子
蛋白质的双向电泳图谱。
图１　不同提取方法对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响
Ａ．酚提取法；Ｂ．三氯乙酸－丙酮－酚提取法；Ｃ．三氯乙酸－丙酮法；Ｄ．Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ．Ｐｈｅｎｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｂ．ＴＣＡ－Ａｃｅｔｏｎｅ　Ｐｈｅｎｏｌ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｃ．ＴＣＡ－Ａｃｅｔｏｎｅ　ｍｅｔｈｏｄ；Ｄ．Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｍｅｔｈｏｄ
　　采用酚提取法获得４２２个蛋白点，三氯乙酸 （ＴＣＡ）－丙酮－酚提取法获得６８７个蛋白点，三氯乙
０１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷
酸（ＴＣＡ）－丙酮法获得８７７个蛋白点，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法
获得９８２个蛋白点。在４种方法中，以Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法
的双向电泳效果最好，获得的蛋白点最多，且蛋白点
形状规则，背景清晰，横纵条纹较少；用三氯乙酸
（ＴＣＡ）－丙酮法获得的蛋白点比 Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法略少，
且背景颜色较深；酚提取法获得的蛋白点最少，且纵
条纹干扰严重，蛋白点并未有效分离；三氯乙酸
（ＴＣＡ）－丙酮－酚提取法相较酚提取法有了较大改
进，蛋白点明显增多，但比Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ略少，且碱性端
有明显的拖尾现象，蛋白点也未能有效分离。由此
可见，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法是提取天女木兰种子蛋白的较适
宜方法。
２．２　裂解液中尿素浓度对天女木兰种子蛋白双向
电泳结果的影响
由图２可知，采用４种尿素浓度的裂解液均获
得了较清晰的蛋白图谱，其中裂解液Ａ（尿素浓度６
ｍｏｌ／Ｌ）有８８０个蛋白点，裂解液 Ｂ（尿素浓度７
ｍｏｌ／Ｌ）有８９２个蛋白点，裂解液 Ｃ（尿素浓度８
ｍｏｌ／Ｌ）有９４７个蛋白点，裂解液 Ｄ（尿素浓度９
ｍｏｌ／Ｌ）获得的蛋白点最多，有９８２个。４种裂解液所
获得的蛋白点数相差不多，但裂解液Ａ、Ｂ、Ｃ的蛋白点
均不及裂解液Ｄ的蛋白点分散，并且裂解液Ｄ的电泳
图谱比其他３种裂解液更清晰。因此，最适合天女木
兰种子蛋白质的裂解液中尿素浓度宜为９ｍｏｌ／Ｌ。
图２　裂解液中尿素浓度对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响
Ａ．裂解液Ａ；Ｂ．裂解液Ｂ；Ｃ．裂解液Ｃ；Ｄ．裂解液Ｄ
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ．Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　Ａ；Ｂ．Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｂ；Ｃ．Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｃ；Ｄ．Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　Ｄ
２．３　ＩＰＧ胶条ｐＨ 范围对天女木兰种子蛋白双向
电泳结果的影响
图３显示，采用ｐＨ３～１０的ＩＰＧ胶条，多数蛋
白点主要集中在中间区域，酸性端和碱性端蛋白点
分布较少，且中间区域的蛋白点非常密集，未能有效
分开；采用ｐＨ３～１１ＮＬ的ＩＰＧ胶条，在ｐＨ３～８内
的蛋白点被有效分离，相对ｐＨ３～１０胶条蛋白点分
布较均匀。因此，ｐＨ４～７的ＩＰＧ胶条适于对天女
木兰种子蛋白进行双向等电聚焦电泳。
１１２第８期 张晓林，等：天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立
图３　ＩＰＧ胶条ｐＨ范围对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐＨ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｏｆ　ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
２．４　分离胶浓度对天女木兰种子蛋白双向电泳结
果的影响
１０％和１２．５％分离胶浓度对天女木兰种子蛋
白双向电泳的影响结果见图４。由图４可以看出，
用１０％分离胶会导致天女木兰种子的部分小分子
蛋白丢失，且蛋白点主要分布在胶面的下部；用
１２．５％分离胶能使天女木兰种子的小分子蛋白完全
散开，且蛋白点均匀分布在整个胶面内，背景清晰，
没有重叠的蛋白点。表明分离天女木兰种子蛋白的
分离胶的最适浓度为１２．５％。
图４　分离胶浓度对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响
Ａ．１０％分离胶；Ｂ．１２．５％分离胶
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｌｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　２－ＤＥ　ｍａｐｓ　ｏｆ　Ｍ．ｓｉｅｂｏｌｄｉｉ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ．Ｇｅｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１０％；Ｂ．Ｇｅｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　１２．５％
３　讨　论
３．１　蛋白提取方法对天女木兰种子蛋白双向电泳
结果的影响
本研究发现，用三氯乙酸（ＴＣＡ）－丙酮－酚法提
取天女木兰种子蛋白相比酚提取法有了较大改进，
蛋白点明显增多，这是由于三氯乙酸（ＴＣＡ）－丙酮－
酚提取法中所加入的提取液消除了样品中多糖的影
响，阻止了蛋白与多糖的相互作用；但三氯乙酸
（ＴＣＡ）－丙酮－酚提取法的操作步骤繁琐、耗时，相比
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法 蛋 白 有 一 定 损 失。由 于 三 氯 乙 酸
（ＴＣＡ）－丙酮法的蛋白样品中杂质较多，核酸含量
高，因此在银染时核酸也一并被染色，使第２向背景
颜色加深。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法提取液中的ＥＤＴＡ通过与
维持蛋白酶活性必需的金属离子螯合，抑制了金属
蛋白酶的活性，获得的双向电泳效果较好，蛋白点最
多，背景清晰，杂质较少，适用于后续分析；且其重复
性高，蛋白点数量维持在９００～１　０００个；但在其双
向电泳图上有２个高丰度蛋白点，这些高丰度蛋白
必然会掩盖具有相似等电点和分子质量的低丰度蛋
白，而低丰度蛋白往往是在生命活动中起重要作用
的蛋白，因此仍需寻找改进方法，如通过试剂盒或参
２１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷
考植物叶片去除Ｒｕｂｉｓｃｏ的ＰＥＧ分级方法，以去除
高丰度蛋白对低丰度蛋白的遮掩。
３．２　裂解液中尿素浓度对天女木兰种子蛋白双向
电泳结果的影响
为了取得良好聚焦的第１向分离，样品蛋白必
须充分解聚，并完全溶解。不管样品是否是较粗的
裂解物还是经过了样品沉淀过程，样品裂解液必须
含有某些成分，以确保在进行第１向等电聚焦前，使
样品完全溶解和变性。这往往包括尿素以及多种去
污染剂。尿素是一种中性的促溶剂，由于它破坏了
蛋白的疏水键和离子键，使蛋白质解折叠并充分伸
展而暴露出疏水中心，提高了样品的溶解度［２６］，因
而在双向电泳的第１向中被用作变性剂。研究发
现，裂解中的硫脲可以进一步提高溶解度，特别是偏
疏水性的蛋白质（如膜蛋白），兼性离子去污剂
ＣＨＡＰＳ的使用可以溶解经过变形剂处理而暴露出
的蛋白质疏水基团，能够确保蛋白质完全溶解并能
防止蛋白质通过疏水作用而发生聚合［２７］。在变性
剂和去污剂中加入还原剂ＤＴＴ，可以使蛋白样品中
的二硫键断裂肽链都处于还原状态［２８］。因此，今后
还应该就裂解液中硫脲、ＣＨＡＰＳ、ＤＴＴ等浓度的变
化对蛋白样品溶解度的影响进行研究。
３．３　ＩＰＧ胶条不同ｐＨ 梯度对天女木兰种子蛋白
双向电泳结果的影响
采用ｐＨ梯度不同的３种ＩＰＧ胶条对同一样品
进行分离，得到的蛋白点分布有明显差别。天女木
兰种子蛋白在极酸性端和极碱性端蛋白分布较少，
使用ｐＨ３～１１ＮＬ　ＩＰＧ胶条能简单分析种子中蛋白
质的性质，而使用ｐＨ４～７ＩＰＧ胶条能检测出等电
点相近的蛋白点，极大地提高了蛋白点的分辨率和
分析精度。因此，需根据样品中目的蛋白的分布来
选择ＩＰＧ胶条的ｐＨ梯度，对于未知蛋白样品，为最
大限度地捕获蛋白质信息量，应先用宽ｐＨ 范围的
ＩＰＧ胶条进行分离，对于蛋白点分布密集或无法有
效分离的区域，可选用窄范围的ｐＨ 胶条进一步分
离。
３．４　分离胶浓度对天女木兰种子蛋白双向电泳结
果的影响
分离胶浓度影响着蛋白质点分离的程度和清晰
度，浓度过大会造成部分蛋白点重叠，浓度过低会造
成小分子质量蛋白丢失［２９］。常见的凝胶有均一胶
和梯度胶，均一胶（单一浓度的丙烯酰胺）可以很好
地分离分子质量范围较窄的蛋白质样品，凝胶灌制
重复性好；而梯度胶在分析分子质量范围很宽的蛋
白质时具有优势，随着凝胶浓度的升高凝胶孔径缩
小，分离的蛋白点更为清晰。尽管梯度胶广泛应用
于分子质量范围较宽的复杂样品分离，但用梯度胶
得到的结果无法与选用适当浓度的均一胶所得结果
相比。因此在遇到复杂样品时，可以先用梯度胶对
样品作全面比较，之后用均一胶对感兴趣的区域进
行分离。因此，无论对于大分子蛋白质还是小分子
蛋白质，都可以在同一块凝胶上得到很好的结果。
４　结　论
本研究结果表明，采用Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法提取天女木
兰种子蛋白，在裂解液中尿素浓度为９ｍｏｌ／Ｌ、ＩＰＧ
胶条ｐＨ梯度为４～７、第２向分离胶浓度为１２．５％
时，可以获得分辨率高、背景清晰、重复性好的双向
电泳图谱，因此该条件是适用于天女木兰种子蛋白
质的双向电泳条件。
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４１２ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４０卷