全 文 ：。栽培与育种 ·
不同产地浙贝母的基因序列及生物碱含量比较
中国药科大学中药学院 (南京 21 0 35) 蔡朝 晖 李 萍 李松林
香港科技大学生物系生物技术研 究所 (香港 ) 董婷霞 詹华强
摘要 目的 :探讨道地药材形成的基因基础 。 方法 : 以 AS 和 A导 l为引物对 4个不同产地浙贝母的 SS rRN A 基
因间区进行了 I℃ R扩增和测序 ,并采用酸性染料比色法测定了它们的总生物碱含量及用柱前衍生化气相色谱法测
定了其中 2 个单体生物碱的含量 。 结果 : 不同产地浙贝母的 S S r R卜A 基因间区具有相同的碱基序列 , 均为 58 8 bp ;
它们的总生物碱含量相当 ,气相色谱结果也表明 ,它们含有相同的单体生物碱 , 只是各单体生物碱的含量不 同 。 结
论 :不同产地浙贝母的差异不是由碱基序列 , 而是由小环境因素引起的 。
关健词 浙贝母 道地药材 SS J 困 A 基因间区序列 生物碱
道地药材是我国传统药物的一大特色 , 特指那
些来源于特定产区的名优正品药材 。 中医多年的临
床经验及近代分析均表明 , 同一物种在不同地区 、 不
同生态条件下 , 质量差异较大 。 讲究道地药材是 我
国历代医家保证药材质量的成功经验 。 药材的道地
性已成为药学研究的热点 , 其中之一就是研究 形成
药材道地性的原 因 。 iM uz k iam 等 〔’ 〕对不 同产 地 的
以硫几么 Z艺“ 。 ar 价 的 总 DNA 用 R F I尹 法 进行了分析 ,
结果发现不 同居群 的样 品间没有 表现 出遗传多 态
性。
在高等植物 的真 核细胞 中 , 5 5 ~ 】,RN A 基因 以重
复排列的形 式存 在 , 它包 括一 个约 120 b p 的编码
区 ,中间被 10 一 7 0 饰 的间 区所分割〔2 一 5〕。 虽 然
S-S r RNA 基因高度保守 , 但 间区的序列在不 同的种
间甚至种内都有差 异 , 可 以用于研究物种间的遗传
多样性 。 道地药材是否在基因型上有所反映 , 本研
究以浙贝母为例通过对 5 5 ~ r RN A 基 因间区的测序加
以探讨 。 浙 贝母 为 百合科浙 贝母 外女i而ha t hu -n
倪娜 i iM q . 的干燥鳞茎 , 主要分布于江苏 、 浙江 、 安
徽 、湖北等省 ,具有清热化痰 、 开郁散结等功效 。 本
研究对不同产地浙贝母 的 5 5一出N A 基因间区的碱基
序列测定 ,并采用酸性染料 比色法测定总生物碱的
含量 ,柱前衍生化气相色谱法测定贝母碱 、去氢贝母
碱的含量 , 为研究道地药材的成 因提供一些基础资
料。
1 材料
不同产地的浙 贝母样 品分别采 自浙 江宁波樟
村、江苏南通 、 江苏南京中山植物园和中国药科大学
分部植物园 。 用于测定生物碱的样品均取自同一采
收时间的新鲜鳞茎 。 样品均经鉴定无误 。
2 方法
2
.
1 总 DNA 的提取 参 照文献闹并稍加修改 , 以
贝母叶片或鲜茎为材料 , ND A 提取液含 25 m M irT s -
中药材第解 卷第 3 期 2X() 1年 3 月
H C I( p H 8
.
0 )
、
s o n说 E D T A 、 0 . 5 % SsD 、 0 . 2% p一琉基
乙醇 、饱和酚 一氯仿 ( 1 : l) 抽提过的上清液 ,加 0 . 1倍
体积的 3 M 醋酸钠和 2 倍体积的 10 % 乙醇 以沉淀
DNA
,
14
,仪幻 q ) m , 4℃离心 20 m in 后弃上清液 , 室温
干燥 , 加适量水溶解 DNA 。 提取 的总 D NA 经 1% 琼
脂糖凝胶电泳 ,嗅化 乙锭染色后在紫外灯下观察拍
照 ( U . V 月 , l飞u l s il l u m ian ot r , 15 一 1(XX) D iig alt lm昭 in g 黝 s -
emt
,
A I户a I n no r o h C o q x朋 t i o n ) 。
2
.
2 CP R 扩增 50 川 CP R 反应混和液 中含有 10 又
CP R 缓 冲液 ( oeB 腼 n g e l , M a l l n h e i m ) 5 川
,核昔酸混和
液 (分别含 or l刊M DT p 、 C汗 、 竹 , 、 ATp ) 1 川 , 引物
A s
、
sA
一
1
,参照文献闭设计 , 并稍加修改 , 引物序列分
别为 A S : 5’ ~ C C A CT C 〔; I飞; Cl , r C G C 〔;G A G Ag TA C
T A
一
3
’和 A S 一 1 : 3 ’ - G GA CT C n 城 引X; C n ; ( ; T A I U A
cT G 以 一5 ’ ,浓度均为 0 . 伪 拼留闪 ,各取 2 . 5 川 , IU rar q
ND A 聚合酶 , 约 50 gn ND A 作为模板 。 反 应混合液
用石蜡油覆盖后 , 放置于 R o lx 洲三y d e C ar d ien t O4 中进
行 代 R 扩增 。 CP R 扩增的循环条件为抖℃ 5 而 n ~
94 ℃ l m i n , 5 3℃ Z m i n , 7 2℃ 3 im n , 共 3 0 个循环 ~
7 2℃ , or im n 。 CP R 产物在低温下保存 。
2
.
3 亚克隆和质拉 DNA 的制备 CP R 产物亚克隆
到 TA 克隆载体 pTA g (&R D xsS et l n 6
,
UK )
。 连接产物
转化入大肠杆菌 JN I的 株系细胞 中后 , 铺于 BL 平
板培养基中 。 通过颜色鉴别挑取白色的克隆在 3 司
BL 液体培养基中振荡培养过夜 , 碱裂解法进行质粒
DN A 的小量制备。 质粒 D NA 经 Bam IH 酸解 检查
后 , 选 取 有 代R 产 物 的 重 组 质 粒 用 W i az 司 T M
M i n i p比p s DNA p币if e iat on ysS tem ( P由rn e g a
,
M ad i s on
,
WI )试剂盒进行制备 。
2
.
4 D NA 测序 用 T 7 , 月 u e cn i n扩” 试剂盒 ( Ph a r -
~ ia) 对分离 到 的 双 链 质粒 DN A 进行测 序
。 用
lC us以 W软件进行排序 。
2
.
5 总生物碱含量测定 酸性染料 比色法阁 。
1 57
·
DOI : 10. 13863 /j . i ssn1001 -4454. 2001. 03. 001
2 3 4
5 64 b P冲
图 1 不同产地 F . 功“动`任应的 s -s rRN A 基因
间区 P C R 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
1
. 采 自南京中山植物园 2. 采 自江 苏南通 3. 采 自南京中
国药科大学分部 4. 采 自浙江宁波
A B C
图 2 不同产地 F . 彻动明喊 中单体
生物碱的气相色谱分析
采 自中国药科大学分部 B . 采 自江苏南通
采 自浙江 宁波 1. 贝母碱
AC
2
.
6 单体生物碱含量测 定 柱前衍生化气相色谱
法〔 9〕。
3 结果
3
.
1 不 同产地浙贝母的 CP R 扩增及测序 从 电泳
结果 (图 )l 看 出 , 不同产地浙贝母总 DN A 扩增 出的
5 5
一
d州 A 基 因间区片段有相似的长度 , 并且有很强
的专一性 。 对 CP R 产物克隆后测序 , 每个样品至少
测定 3 个克隆以避免 代 R 扩增可能带来的误差 , 测
序结果经 lC us 回 W软件排序 ,结果表明它们的序列
完全相 同 (见表 l ) 。 此序列 己登 录到 晓 n Ban k 上 ,
登录号为 A F 19 4 5 7 。 除去 5 5 - r RN A 基因编码 区 , 间
区片段长度为 5 8 bp , A 、 T 、 G 、 C 四个碱 基的含量分
别为 26 . 7% 、 34 . 2 % 、 2 . 1% 、 17 % , A + T 含量较高 。
3
.
2 不 同产地浙贝母的生物碱含量 测定采 自中
国药科大学分部 、 南通和 宁波三个产地的浙 贝母生
物碱含量 ,结果见表 2 和图 2 。 从表 2 看出 , 三个产
地的浙贝母总生物碱含量相 当 , 最高和最低 两个产
地的含量仅相差 0 . 0 18 % , 生物碱 的组成也 基本一
致 (色谱图特征相似 ) , 主要 为贝母碱 ( ve irt ic en )和去
氢贝母碱 ( ve irt ic on en ) (图 2 ) , 但单体生物碱的含量
差别较大 。
4 讨论
传统认为浙江宁波为浙贝母 的道地产 区 。 对采
表 1 不同产地浙贝母的 S S r RN A 基因间区碱基序列
(下划线部分为 S -S r RN A )
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表 2 3个不同产地浙贝母生物碱含 t
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来源
中国药科大学分部
贝母碱 m『g 去氢贝母碱 m岁 g 总生物碱含量%
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浙江宁波 0 . 7 12 士 0 .
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56 1
自浙江宁波 、 江苏南通和南京的原植物形态特征和
药材性状观察 , 发现它们的差异布幽 、 。 这些产地样
品的 5 5~ r RNA 基 因间区的测序结果表明它们具有相
同的基因型 。 三个产地的浙贝母总生物碱含量及组
成相同 ,但单体生物碱的含量差 别较大 。 影响生物
质量的因素有遗传因素 (基 因控制 )和环境因素 。 不
中药材第 24 卷第 3 期 2仪 ) 1年 3 月
同产地浙 贝母具有相同的基因型 , 由此推测单体生
物碱含量的差异可能是 由于局 部的环境 因素引起 。
要想明确浙贝母道地性 的合理性 , 还有待药效学 比
较的进一步研究 。
注 :本研究为江苏省 自然科学基金课题 ( BK如伪 5)
参 考 文 献
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甘草及黄茂种子的醋酸薄膜电泳研究
甘肃中医学院 (兰州 73 (D为 ) 李 明 杨 韬 楚惠媛 周天照 王 颖 郑建峰 `
摘要 利用醋酸纤维素薄膜电泳技术可对甘草和黄茂种子进行鉴别 。 不同种或同种 (野生 、栽培 )种子的电泳
图谱也有差异 。 用 98 % 的浓硫酸处理甘草和黄蔑种子 ,萌发率随处理时间而不同 ,萌发过程中蛋白质谱带数目也
有变化 。
关键词 甘草 黄蔑 种子 萌发 醋酸纤维素薄膜电泳
甘草和黄菜的种子均为硬实性 ,吸水困难 , 而成
为影响产量的重要因素之一 。 这两种种子的处理和
萌发实验已有报道 〔’ 〕 ,而利用醋酸纤维素薄膜 电泳
/ 技术 ,进行品质检验 、 鉴别还未见报道 。 本项工作所
做的种子萌发及醋酸纤维薄膜电泳试验 , 旨在 为甘
草 、黄茂种子的栽培及品质检验提供理论依据 。
, 材料及方法
中药材第抖 卷第 3期 2X( ) 1年 3月
纂
甘草 q 炸净刀人ha aur 肠sn o iF cs h
. 野 生孙子来源
于庆阳地 区宁县太 昌乡 , 栽培种及膜荚黄蔑 sA t ar -
蒯琳 砒励
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( iF hs
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) B g
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. 、蒙古黄茂 Ast 码卯l。
硼吓必ar ~ us
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l谬ha ilc 。 的种子 。 均采 自甘肃
庆阳地区中药材种植场 。
1
.
, 种子 萌发试验
挑选颗粒饱满 的种子 , 置人 10 血 烧杯 , 缓慢
159
.