全 文 ：第 29 卷第 3 期 湖北民族学院学报(自然科学版) Vol． 29 No． 3
2011 年 9 月 Journal of Hubei University for Nationalities(Natural Science Edition) Sep． 2011
收稿日期:2011 － 05 － 03．
基金项目:国家民委科研项目(08HB06) ;湖北民族学院大学生创新项目(2010)．
作者简介:李慧(1985 － ) ，女，硕士，主要从事植物生理学研究;* 通讯作者:丁莉 (1967 － ) ，女，教授，主要从事植物生理学研究．
恩施州川续断的 RAPD分析
李 慧1，蒲 鑫1，武 芸2，丁 莉1*
(1．湖北民族学院 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000;
2．湖北省生物资源保护与利用重点实验室(湖北民族学院) ，湖北 恩施 445000)
摘要:采用 RAPD分子标记技术对恩施州 8 个不同产地的川续断进行了遗传多样性研究．从 50 个引物筛选出
5 个条带清晰、多态性明显并且重复性好的的引物，共扩增出 53 条 DNA片段，利用 NTSYS软件进行聚类分析，以相
似系数 0． 85 为标准，可将所有品种分为 3 类，第Ⅰ大类包括建始县龙坪、利川市元堡、恩施市鱼塘坝上坝、恩施市
鱼塘坝硒矿区、巴东县绿葱坡;第Ⅱ包括鹤峰县太平乡和鹤峰县五里坪;恩施市双河独立分为一类．本研究可为川
续断的鉴别提供一定参考和依据．
关键词:道地药材;川续断;RAPD;聚类
中图分类号:Q949． 781． 5 文献标识码:A 文章编号:1008 － 8423(2011)03 － 0274 － 04
RAPD Analysis of Dipsacus asper from Enshi
LI Hui1，PU Xin1，WU Yun2，DING Li1*
(1． School of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi 445000，China ;
2． Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Heibei Province
(Hubei University for Nationalities) ，Enshi 445000，China)
Abstract:Genetic diversity of Dipsacus asper of eight different areas in Enshi by using RAPD molecular
markers． 5 among 50 primers were selected to amplify about 53 segments DNA． Cluster analysis using NT-
SYS software，a similar coefficient of 0． 85 as the standard，all varieties can be divided into three catego-
ries． GroupⅠincluding Longping，Yuanbao，Yutangba embankments，the Se mine enriched area of Yutang-
ba，Lvcongpo;GroupⅡincluding Taiping and Wuliping;Shuanghe of Enshi City is divided into a class of
independent． This study can provide a reference and basis for the identification of Dipsacus asper．
Key words:genuine regional drug;Dipsacus asper;RAPD;Clustering
川续断为双子叶植物纲菊亚纲川续断目川续断科植物．因产地湖北五峰县、鹤峰县的品质优良，资源丰
富，常被称作“五鹤续断”，是常用的中药之一，具有补肝益肾，续接筋骨，抗骨质疏松，止血安胎等功效．川续
断中含有挥发油、生物碱、多糖、蛋白质和多种重金属离子等主要有效成分．关于川续断植物的研究主要集中
在道地历史考证、有效成分及药理作用等，分子生物学方面的研究甚少［1 － 2］．另外，在对川续断进行研究时，
发现不同产地的植株之间光合能力和同工酶方面存在差异［3 － 4］，从分子水平探讨其是否存在遗传方面差异
尚未见研究．
为了发掘新的川续断种质资源，培育川续断新品种，本试验以恩施州 8 个不同产地的川续断单株为研究
材料，采用 RAPD技术进行了聚类分析，从而研究材料间的遗传学差异，旨在为今后进一步开发利用川续断
提供参考［5］．
1 材料与方法
1． 1 试验材料
供试材料来源见表 1．
表 1 供试材料来源
Tab． 1 Materials and origin
编号 种名 品名 来源 编号 种名 品名 来源
1 Dipsacus asper 川续断 建始县龙坪乡 5 Dipsacus asper 川续断 巴东县绿葱坡
2 Dipsacus asper 川续断 利川市元堡乡 6 Dipsacus asper 川续断 恩施市双河
3 Dipsacus asper 川续断 恩施市鱼塘坝上坝 7 Dipsacus asper 五鹤续断 鹤峰县太平乡
4 Dipsacus asper 川续断 恩施市鱼塘坝硒矿区 8 Dipsacus asper 五鹤续断 鹤峰县五里坪
1． 2 试剂与仪器
Taq DNA聚合酶购自 Promega(上海) ;dNTPs(2． 5 mmol /L each) ;Tris base 为武汉天源生物技术有限公
司分装的 Amresco;RAPD随机引物购自上海生工生物工程有限公司，琼脂糖产于 spain 的 Biowest Agarose;
DL3000 DNA Marker购自上海雷浩信息科技有限公司，其他试剂均为国产分析纯生化试剂．
飞鸽牌 GL －16G － A高速冷冻离心机，BIORAD 凝胶成像系统，BeckmanD /U530 紫外分光光度计，新飞
BCD －219 冰箱 V，Biohit proline移液枪，美国 ABI2720 型 PCR 扩增仪，DYY － 10C 型电泳仪(北京市六一仪
器厂) ，HH －2 数显恒温水浴锅．
1． 3 基因组 DNA提取与浓度检测．
以 CTAB法提取上述材料，参照李合生等的方法［5］．
取上述方法提取的基因组 DNA 30 μL，稀释 100 倍，在紫外分光光度计上测 A230、A260、A280，根据 DNA浓
度(μg /mL)= 50 × OD260 nm ×稀释倍数，确定 DNA母液浓度，进而按 50 ng /μL进行稀释．
1． 4 PCR扩增与产物检测
反应采用 20 μL的 PCR体系，其中模板 DNA浓度 为 50 ng /μL，引物浓度为 1． 0 μmol /L，Mg2 +浓度为 2．
5 mmol /L的，dNTP各 0． 2mmol /L，Taq酶 1． 0 U，39℃的退火温度在 ABI2720 型 PCR扩增仪中进行反应．反应
程序为:94℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s，39℃退火 40 s，72℃延伸 2 min，43 个循环;最后 72℃延伸 10 min，
4℃保存．得到的产物经 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳，EB中染色 30 min，凝胶成像系统照相保存．
1． 5 数据分析
对扩增后电泳带的总数及多态性带数进行统计，按照 Nei［6］的公式，根据材料间谱带的数目，求出各自
材料间的相似系数:R = 2Nxy /(Nx + Ny) ;其中 R为材料 x和 y的相似系数，Nxy代表材料 x和 y经 RAPD扩增
后所共有的条带数目，Nx 和 Ny 分别代表 x和 y材料分别具有的总扩增条带数．并根据在某一位点形成谱带
记为 1，某一位点未形成谱带记为 0，构建 8 个产地续断基于 RAPD扩增的谱带原始二态数据矩阵，利用 NT-
SYS(2． 01)软件进行聚类分析．
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA提取结果
采用 CTAB法提取的 DNA条带较均一，无降解弥散的现象．说明 CTAB 法适合五鹤续断基因组 DNA的
提取，这与其他研究结果一致［7］．
2． 2 RAPD扩增结果
通过对 RAPD反应体系各重要因素的优化，从 50 条随机引物中筛选出了扩增条带丰富、多态性好的 5
条引物序列，并发现这些序列的 G /C含量都在 50%以上(见表 2)．图 1、2 为引物 P7、P9 对 8 份材料的扩增
结果． RAPD统计结果表明，5 条引物总共扩增出 53 条电泳谱带，得到的 DNA 片断大小为 300 ～ 2 500 bp．其
中，引物 P7 扩增的带中，所有材料在 1000 bp和 1600 bp处有共有带，其余条带均为多态性带．综合各引物的
扩增带，得到 8 份材料川续断的分子识别表(见表 3)． 引物 P9 扩增出的 14 条带中，所有材料在 DNA 片段
100、600、800、1600、1800、2000、2300 bp处均有共同的条带，在 DNA片段 400 bp处，只有建始县龙坪、鹤峰县
572第 3 期 李 慧:恩施州川续断的 RAPD分析
太平乡和鹤峰县五里坪在这个位点上形成条带(图 1、2) ，其他产地的续断在这个位点上均未形成带．
表 2 筛选出的引物及其序列
Tab． 2 Sequece of selected arbitrary primers
引物 引物序列(5 － 3)扩谱条带数 G/C含量 /% 引物 引物序列(5 － 3)扩谱条带数 G/C含量 /%
P7 AGTCGGATCC 9 60 P9 CAGTCACGAC 14 60
P16 TAGCTCATGC 11 50 P45 GGCAGGCAAG 7 70
P47 ACGAGAGGCA 12 60
表 3 不同产地续断的多态性带数、特异位点
Tab． 3 Number of Polymorphlc Bands，Special Bands of Different DNA
产地 总谱带数 可与其他产地区别的位点 产地 总谱带数 可与其他产地区别的位点
建始县龙坪乡 25 1 900 bp 利川市元堡乡 25 —
恩施市鱼塘坝上坝 25 — 恩施市鱼塘坝硒矿区 23 —
巴东县绿葱坡 24 — 恩施市双河乡 19 —
鹤峰县太平乡 23 1 500 bp 鹤峰县五里坪 23 —
2． 3 相似系数的分析
由表 4 可见，8 个产地基于 RAPD扩增反应得到的条带之间相似系数差异较小，波动的幅度在 0． 81 ～ 0．
96，说明材料间亲缘关系较近，变异较小．
表 4 续断基因型相似系数对称性矩阵
Tab． 4 Similar coetlieient Matrix of Dipsacus asper petaphyllum
编号
相似系数
1 2 3 4 5 6 7 8
1 1． 000
2 0． 960 1． 000
3 0． 920 0． 960 1． 000
4 0． 917 0． 917 0． 958 1． 000
5 0． 898 0． 939 0． 980 0． 936 1． 000
6 0． 864 0． 864 0． 864 0． 905 0． 884 1． 000
7 0． 875 0． 875 0． 875 0． 913 0． 852 0． 810 1． 000
8 0． 958 0． 917 0． 917 0． 913 0． 894 0． 810 0． 913 1． 000
图 3 基于 RAPD的续断聚类分析图
Fig． 3 Dendrogram by cluster analysis of Dipsacus asper by RAPD
2． 4 个体水平的聚类分析
由图 3 可以看出，利用 RAPD 方法，根据相似系
数的聚类结果，在聚类距离 0． 85 左右，可将 8 份川
续断材料分为三大类．第Ⅰ大类包括川续断 1 号(建
始县龙坪)、川续断 2 号(利川市元堡)、川续断 3 号
(恩施市鱼塘坝上坝)、川续断 4 号(恩施市鱼塘坝硒
矿区)、川续断 5 号(巴东县绿葱坡) ;第Ⅱ包括川续
断 7 号(鹤峰县太平乡)和川续断 8 号(鹤峰县五里
坪) ;川续断 6 号(恩施市双河)独立分为一类．
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3 讨论
RAPD分子标记技术因为具有可供选择标记数量多、无器官和发育时期的特异性等优点，已被广泛应用
于生物的遗传多样性及亲缘关系研究，特别适用于近缘属级以下(包括近缘属间)的研究［8］．
从本研究的 RAPD电泳图谱可以看到，8 个不同产地的川续断材料的主要谱带基本一致，说明它们的亲
缘关系很近，但次谱带间又存在着较细微的差异，说明存在一定的遗传多样性．根据遗传关系聚类分析，地理
位置很近的恩施市鱼塘坝上坝、恩施市鱼塘坝硒矿区和恩施市双河的川续断没有分成一类，可能是由于前两
者处于硒矿区，而硒在植物生长中有很重要的作用［9 － 10］． 除此之外，本实验的分类结果基本以地理分布为
主，地理位置越接近的，亲缘关系越近，之间的差异就较小，所以不同的生境是影响川续断不同性状的主要原
因之一．另外，在对不同产地的续断的过氧化物同工酶研究中，将 8 份材料分为了 2 大类，与本研究的分类结
果基本一致，说明这种分析方法是可行的．
利用分子生物学方法研究恩施州内的川续断的种质资源，从分子水平揭示其亲缘关系的远近，不仅可以
为川续断的系统选育和引种栽培提供理论依据，还可以为进一步研究川续断种质资源的起源和进化问题提
供参考．
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772第 3 期 李 慧:恩施州川续断的 RAPD分析