全 文 ：表 5　各处理经济效益对比
处理
(株 /hm2)
收入(元 /hm2)
商品薯 非商品薯 茎叶 合计
成本(元 /hm2)
物质 人工 合计
纯收入
(元 /hm2)
比对照
增加(%)
90000 23526 2058 954 26538 3960 3645 7605 18933 -
75000 27432 1872 1215 30519 3510 3510 7020 23499 23.9
60000 23166 2106 1060 26338 3060 3375 6435 19903 4.9
45000(CK) 19602 3850 1363 24815 2610 3240 5850 18965 -
　　注:1.商品薯 1.8元 /kg;非商品薯 0.6元 /kg;茎叶 0.1元 /kg;2.物质成本包括薯苗 、肥料和农药
反而降低了甘薯的经济效益。因此 ,为获取迷你型
甘薯的最佳经济效益 ,应做到合理密植 ,在本试验条
件下 ,以 75 000株 /hm2 为宜 ,能获得较好的经济
效益。
参考文献
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向日葵甜菜碱醛脱氢酶的电子克隆与分析
易乐飞　王 萍　孟 鹏
　　摘　要　采用电子克隆技术获得了向日葵甜菜
碱醛脱氢酶基因的 cDNA序列(HaBADH)。该序列
长 1901bp,编码一个由 503个氨基酸残基组成的蛋白
质。 HaBADH与其他物种的 BADHs在蛋白质水平上
表现较高的相似性 ,在进化上与同科的甘菊 BADH蛋
白距离较近。HaBADH蛋白具有醛脱氢酶家族高度
保守的十肽和与酶功能有关的氨基酸残基 Cys。
关键词 　向日葵;甜菜碱醛脱氢酶;BADH;电
子克隆
高盐环境严重影响植物的生长和发育 ,为了对
抗高盐环境 ,植物通常会在细胞内主动积累一些小
分子有机化合物 ,如多元醇类 、糖类 、氨基酸及其衍
生物等 ,以维持渗透平衡和体内水分。甘氨酸甜菜
碱被认为是最好的渗透调节剂 ,除了参与细胞的渗
透调节外 ,还具有在渗透胁迫条件下稳定生物大分
子结构和功能的作用 。因此 ,参与甜菜碱生物合成
的甜菜碱醛脱氢酶(betainealdehydedehydrogenase,
BADH)受到了人们的高度重视 [ 1] 。目前已在多种
作者简介:易乐飞 ,讲师 ,主要从事分子遗传学研究 ,淮海工学院海洋
生物技术重点建设实验室 , 222005,江苏连云港
王萍(通讯作者),孟鹏 ,通讯地址同第 1作者
收稿日期:2007-10-20
植物中克隆了该酶的 cDNA序列 ,然而尚无向日葵
(Helianthusannuus)的甜菜碱醛脱氢酶 cDNA序列
(HaBADH)的相关报道 ,本试验利用电子克隆技术
和网络数据资源[ 2] ,克隆了 HaBADH,并对其序列进
行了分析 。
1　材料与方法
1.1　HaBADH的电子克隆技术路线
以甜菜的 BADH氨基酸序列(CAA41377)作为
查询序列 ,使用 tBlastn程序 [ 3]检索 GenBank中向日
葵 EST库 。将检索到的相似性最高并且含有醛脱
氢酶保守结构的 EST序列作为种子序列 , 使用
Blastn程序[ 3]检索向日葵 EST库 ,将检索到的 EST
序列用 CAP3程序 [ 4]组装和延伸 ,重复检索 、延伸步
骤直到不能延伸为止 。将所有检索到的 EST进行
拼接 ,最后获得了 HaBADH。
1.2　编码蛋白的相似性和三级结构分析
以推导的氨基酸序列对 GenBank中的非冗余
的蛋白质数据库进行 Blastp分析 ,判断该蛋白是否
为新序列 ,并推导蛋白功能。利用 ProtParam进行编
码蛋白的各种基本理化特性分析 [ 5] 。使用 ClustalW
程序进行氨基酸序列的多序列比对[ 6] 。
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作物杂志　Crops 2007.6DOI :10.16035/j.issn.1001-7283.2007.06.015
2　结果与分析
2.1　HaBADH的电子克隆与序列分析
用 CAA41377对向日葵的 dbEST进行 tBlastn分
析 ,发现有 1条 EST(DY913436)与之高度相似 ,并且
含有醛脱氢酶高度保守的十肽 ,以及与酶功能相关的
半胱氨酸残基。再以该 EST序列为种子序列检索向
日葵 dbEST,收集符合聚类条件的 EST(聚类条件是
两条 EST序列的重叠区超过 40nt,且该区域的碱基一
致性大于 94%[ 7] ),然后将这些 EST拼接成 contig。
用该 contig代替上述种子序列进行重新检索 、拼接 ,
直至获得的序列长度不能用此法继续延伸为止。最
后共获得了 7条 EST序列(BU027116、CD845744、
CD851241、 DY908069、 DY909487、 DY913436 和
DY916195),拼接后获得了 HaBADH(图 1)。
该 cDNA序列的第 1个 ATG密码子下游的 +4
位是 G, -3位是 G,且第 1个 ATG上游的 3个读码
框中都存在多个终止密码子 ,再结合推导的氨基酸
序列 N端同源性比较结果 ,可以认定第 1个 ATG是
该基因的起始密码子 [ 8] 。在 3′UTR中第 1871 ～
1878位存在 Poly-A加尾信号 [ 9] ,而且其后还有由
两个核苷酸组成的 CA结构。因此 ,可以认为本试
验电子克隆的 HaBADH是完整的 。其 5′UTR长
272nt, 3′UTR长 117nt,在 cDNA的第 273 ～ 1784bp
处存在长 1512bp的开放阅读框(图 1),编码蛋白质
长 503个氨基酸残基 。
图 1　向日葵的甜菜碱醛脱氢酶 cDNA序列及推导蛋白的氨基酸序列
46
作物杂志　Crops2007.6
2.2　编码蛋白的序列分析与相似性分析
编码蛋白预测的分子量大小为 54.7kDa,其碱
性氨基酸(K、R)、酸性氨基酸(D、E)、疏水性氨基酸
(A、I、L、F、W、V)和极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)含
量分别为 57个 、64个 、201个和 98个 , 等电点为
5.64。在 259 ～ 266氨基酸处存在保守的醛脱氢酶
谷氨酸活性位点(LELGGKSP),在 287 ～ 298处存在
保守的醛脱氢酶半胱氨酸性位点 (FwTNGQIC-
SATS)。以编码蛋白对 GenBank中的非冗余的蛋白
质数据库进行 Blastp分析 ,结果发现甘菊 、人参 、拟
南芥 、千穗谷 、高山离子芥 、油菜和各种滨藜等十几
种植物的 BADH与该蛋白序列具有极高的相似度 ,
但在向日葵的蛋白质数据库没有找到与之高度相似
的序列 。所以可以肯定 ,本试验电子克隆的序列是
一条新序列 ,且推导的蛋白就是向日葵的甜菜碱醛
脱氢酶(HaBADH)。
序列比对结果表明 HaBADH与其他物种的
BADH无论在核酸水平还是在蛋白质水平上都表现
较高的相似性 ,表明 , BADH基因家族具有较高的保
守性。 HaBADH的氨基酸序列在进化上与同属菊科
的甘菊 BADH距离较近。不同植物间 BADH的长
度相差不大 ,最长的为细叶结缕草的 BADH,为 507
个氨基酸残基;最短的为海榄雌的 BADH,长 496个
氨基酸残基。 HaBADH与甘菊 、水稻和大肠杆菌的
序列一致性(identity)分别为 89%、73%和 36%;若
考虑功能相似性氨基酸之间的保守替换 (A=G=
P=S=T、H=R、 F=W=Y和 I=L=M=V),那么
HaBADH与它们的序列相似性 (similarity)分别为
96%、86%和 56%。
3　讨论
除了与其他物种的 BADH存在较高的相似性
外 ,推导的 HaBADH还含有一些与酶功能密切相
关的保守氨基酸残基 。在蛋白质序列的 257 ～ 266
之间 ,存在一个高度保守的十肽序列 VTLELGGK-
SP,该结构在醛脱氢酶家族中是高度保守的 ,这些
残基可能包含 NAD+结合位点及酶催化位点 ,而且
在保守的十肽序列后第 28位还含有与酶功能密
切相关的醛脱氢酶家族高度保守的氨基酸残基
Cys[ 1] 。保守的 Glu106位于 BADH的表面 ,它携
带的负电荷在维持酶的结构完整性中发挥作
用 [ 10] 。所有这些相似性和保守性表明了 HaBADH
可编码活性蛋白 ,且该蛋白执行的功能与其他植
物的一致 。
在已报道的 BADH氨基酸序列中 ,存在两种有
关该酶蛋白定位的信号肽。一种是 N-端信号肽 ,
其氨基酸序列为 QLFIDGE,被认为是定位于叶绿体
的信号 ,但该信号肽缺乏典型性;另一种是 C-端信
号肽 ,氨基酸序列为 SKL,是定位于过氧化物酶体中
的信号。从目前的研究结果看 ,将具有 C-端信号
肽 SKL的 BADH定位于过氧化物酶体已无争议 ,但
对具有不典型 N-端信号肽的 BADH定位问题尚有
争论 [ 1] 。本试验获得的 BADH氨基酸序列 9 ～ 15
位和 501 ～ 503位 ,同时具有 N-端信号肽和 C-端
信号肽 , 这种现象比较少见 。目前 , 仅在人参的
BADH中发现了同时具有 N-端信号肽和 C-端信
号肽的现象。因此 HaBADH在细胞中的具体定位
尚有待于进一步的研究 。
本试验利用电子克隆技术 ,成功地克隆了向日
葵甜菜碱醛脱氢酶 cDNA序列 ,推导出来的氨基酸
序列与其他植物的高度一致 。这表明试验获得的
cDNA序列是有效的。与传统的基因克隆相比 ,电
子克隆显现出了明显的优势 。随着更多生物测序的
开展以及各类数据库的不断完善 ,电子克隆技术必
将成为植物新基因克隆的重要手段。
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作物杂志　Crops 2007.6