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苯噻草胺与玉米 DNA和狗尾草 DNA作用的研究
张正奇 ,王会玉 ,胡华 ,熊劲芳(湖南大学化学化工学院 ,湖南 长沙 410082)
摘要:提出了苯噻草胺用于旱地除草的新除草机理 , BTMPA嵌入旱地植物 DNA 双螺旋中 ,使 DNA 变性而抑制 DNA复制 , 造
成狗尾草等杂草细胞不能分裂 ,从而杀除杂草。用苯噻草胺旱地除草时 , 在植物体内的有效浓度为 5.4×10 -8mol L-5.4×10 -5
mol L, 最宜施药期为芽期至三叶期 , 最宜施药温度为 20℃-30℃。
关键词:DNA;BTMPA;玉米;狗尾草
中图分类号:Q781　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)05-0008-04
A New Mechanism for BTMPA to Eliminate Grass
ZHANG Zheng-qi ,WANG Hui-yu ,HU Hua ,XIONG Jin-fang
(College of Chemestry and Chemical Engineering , Hunan University , Changsha 410082 , China)
Abstract:In this paper , a new mechanism for BTMPA to eliminate grasses is advanced.BTMPA can intercalate a plant DNA and untwist the DNA
helix to denature the grass DNA , which inhibited the replication of DNA.So the grasses was eliminated.
Key words:DNA;BTMPA;zea;setaria
收稿日期:2004-12-13;修回日期:2005-04-18
基金项目:湖南省财政厅农业发展基金项目(2003-11032)
作者简介:张正奇(1944-),男 ,博士 ,教授 ,从事分子生物学和生物技
术药物研究 ,出版著作 2部 ,发表论文 170余篇。
　　我国是一个以农业为主的发展中国家。长期以来 , 农田
杂草是困扰农民 , 影响农业生产的主要问题之一 , 因而 , 除草
剂的研制与开发[1 ,2]对我国经济发展有着重大意义。在农药
新品种创研过程中 , 先导化合物的发现和优化是创制农药新
品种的关键 , 获取先导化合物的途径很多 ,其中 , 生物合理设
计[ 3]是当代农药创新研究的前沿。
苯噻草胺[ 2-(2-benzothiazolyloxy)-N-methyl-N-phe-
nyl-acetamide , I ,缩写为 BTMPA[ 4] ] 是近年在我国推广使用的
一种新型稻田除草剂 ,对稻田中常见的多种杂草有很强的杀
除作用。它属乙酰替苯胺类除草剂 , 由日本特殊农药公司开
发研制 , 主要作用于植物的根 、芽生长点原基 ,抑制细胞的分
裂 、伸长 ,导致茎叶部与根部的生长点异常胀大 , 植物生长受
到抑制 ,最终茎叶变黄枯萎 , 整株死亡[5] 。本实验室曾采用紫
外光谱法[6] 和伏安法[ 7 ,8] 研究了 BTMPA 与水稻 DNA 和稗草
DNA的相互作用 , 提出了由于苯噻草胺能在 DNA 分子表面和
RNA链上堆积 , 抑制 DNA复制 ,阻止 mRNA参与蛋白质合成 ,
从而杀除杂草的新除草机理[9] 。
苯噻草胺也可用于旱地除草。本文选择狗尾草为杂草代
表 ,用紫外光谱法研究了 BTMPA 与狗尾草 DNA和玉米 DNA
的相互作用 , 发现 BTMPA可嵌入旱地植物 DNA 双螺旋中 , 使
DNA解链变性而抑制 DNA复制 , 从而杀除旱地杂草。
1　材料与方法
1.1　仪器
WFZ-34A紫外-可见分光光度计(天津光学仪器厂);超
低温冰箱(-86℃, 丹麦);8504R高速冷冻离心机(德国);恒温
水浴箱(±0.1℃,美国);GENEGENIUS 全自动凝胶成像分析系
统(英国);JP-821(C)新极谱仪及 JM-01 悬汞电极(江苏电分
析仪器厂)。
1.2　试剂
75μg ml玉米 DNA(或狗尾草 DNA)溶液:用于提取 DNA 的
玉米(Zea mays L.)种子购自长沙种子公司;狗尾草(setaria属 ,
S .viridis(L.)Beauv.)种子采自长沙湘江岸上;苗系本室培养。
称取适量本实验室提取并经紫外光谱检验和琼脂糖凝胶电泳
鉴定仅有一个条带的纯玉米 DNA 或狗尾草 DNA , 用 pH7.4 的
磷酸盐缓冲溶液溶解;2.0×10-3mol L BTMPA溶液:称取苯噻
草胺(98.5%, 湖南海利集团)0.0294g , 溶于 30ml-40ml无水乙
醇(AR ,湖南师范大学试剂厂)中 ,稀释至 50ml。其他浓度取此
液稀释。
1.3　实验方法
移取 pH7.4 的磷酸盐缓冲溶液 2.0ml于 10ml比色管中 ,
稀释至一定体积 , 加入适量的 BTMPA 溶液 , 混匀 , 再加入一定
量的玉米 DNA或狗尾草 DNA , 用去离子水稀释至刻度 ,轻轻混
匀 ,放置60min 后在紫外分光光度计上以不含 DNA 的空白溶
液作参比 , 记录 200nm-350nm 范围内的吸收曲线 , 读取最大
吸收波长和 280nm 处的吸光度。
2　结果与讨论
2.1　纯玉米 DNA 的紫外吸收光谱
玉米 DNA系本实验室采用文献[ 10] 方法提取而得 , 其紫外
吸收曲线示于图 1 , 可见 ,与专业生物技术公司制得的 DNA 的
吸收曲线一致[ 11] 。
图 1　DNA的紫外吸收光谱
2.2　狗尾草 DNA 的紫外吸收光谱
第 15卷第 5 期:8
2005年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.5:8
Oct.2005
采用己报道的植物 DNA 提取方法提取狗尾草 DNA 时, 均
难得到高纯 DNA。我们对文献[10]方法进行了改进[ 12] ,得到的
狗尾草 DNA的紫外吸收光谱同玉米 DNA 的光谱(图 1),琼脂糖
凝胶电泳结果仅显示一个条带, 纯度高 ,符合本项研究要求。
2.3　BTMPA浓度对 DNA 紫外吸收的影响
BTMPA浓度对玉米 DNA和狗尾草 DNA 紫外吸收特性的
影响列于表1。表1 中的相对吸光度(relative absorbance , RABS)
定义如下:
RABS=BTMPA存在下的 DNA 吸光度不含 BTMPA的 DNA吸光度 (1)
由表 1实验结果可得出如下结论:①苯噻草胺用作旱地除草
剂时有效浓度范围为 5.4×10-8mol L-5.4×10 -5mol L;浓度
小于5.4×10-8mol L时 BTMPA不能杀除杂草;浓度大于5.4×
10 -5mol L时玉米 DNA受到损伤 , 造成药害。在有效浓度范围
内 , BTMPA是一种选择性除草剂 ,能选择性地与狗尾草等杂草
DNA作用 , 而与玉米 DNA 没有明显作用。这与生产实际相符
合。 ②BTMPA 浓度大于 1.07×10-4mol L时 ,狗尾草 DNA最大
吸收波长紫移 9-10nm , 表明 BTMPA 与 DNA 形成了复合物。
③BTMPA用于旱地除草与用于水田除草的除草机理不同。
BTMPA 与水稻 DNA 和稗草 DNA 作用后吸光度值减少 , 表明
BTMPA 与水稻 DNA 和稗草 DNA 的作用模式是堆积作用[ 6] , 本
实验结果的吸光度值增加 ,据此可以推测 , 苯噻草胺可能嵌入
旱地植物 DNA 双螺旋中 ,与 DNA形成了复合物。
表 1　BTMPA浓度对玉米和狗尾草 DNA 吸光度的影响
(pH7.4;20℃;反应时间 60min;7.5μg ml DNA)
BTMPA浓度
×106mol L
玉米
λmax(nm)　　RABS
狗尾草
λmax(nm)　　RABS
0.0054 259 0.99 259 1.09
0.054 259 0.99 259 1.12
0.54 259 0.97 258 1.15
5.40 259 0.99 259 1.18
54.0 259 1.06 259 1.28
107 260 1.09 250 1.33
179 251 1.20 249 1.76
2.4　DNA对 BTMPA紫外吸收的影响
为了验证 BTMPA-DNA复合物的形成 , 实验研究了 BTM-
PA-狗尾草 DNA 体系中 BTMPA 的吸光特性。苯噻草胺在
217nm 有一最大吸收峰。在 BTMPA 溶液中加入狗尾草 DNA ,
Amax值随 DNA 浓度的增加而增大;作用时间对该体系中 BTM-
PA 吸光度的影响示于图 2 , 2h 后吸光度值达到最大且趋于平
稳。这些实验结果是 BTMPA与狗尾草 DNA 形成了复合物的
佐证。复合物的形成致使 BTMPA分子吸光面积增加 , 从而提
高了 BTMPA的光吸收能力。
图 2　时间对 BTMPA-狗尾草DNA体系中 BTMPA吸光度的影响
pH7.4;2.7×10-7mol L BTMPA;5.6μg ml DNA;217nm.
2.5　BTMPA-狗尾草 DNA体系伏安特性
BTMPA-狗尾草 DNA体系伏安曲线示于图 3。在 pH4.4
的醋酸盐缓冲溶液中 ,狗尾草 DNA 不产生伏安峰(图 3a);BT-
MPA于-1.28V 左右呈现一伏安峰 P1(图 3b);在 BTMPA溶液
中加入狗尾草 DNA后 , 于-1.53V左右出现一新峰 P2(图 3c),
且 P1峰高降低 , 这是 BTMPA嵌入狗尾草 DNA 双螺旋中 ,与狗
尾草 DNA形成了复合物的又一佐证。
图 3　苯噻草胺-狗尾草 DNA 体系半微分伏安曲线
pH 4.4;反应时间 15min;室温;
a.7.0μg ml狗尾草 DNA;b.5.0×10-5mol L BTMPA;c.7.0μg ml 狗尾
草 DNA , 5.0×10-5mol L BTMPA.
2.6　狗尾草 DNA 的变性
图 4a是 BTMPA 浓度对狗尾草 DNA 吸光度的影响 , 苯噻
草胺浓度在 5.4×10-9mol L-5.4×10 -5mol L时 , 狗尾草 DNA
的吸光度值随 BTMPA 浓度增大而缓慢增加;当 BTMPA浓度大
于 1.07×10 -4时 , 吸光度值随 BTMPA 浓度增大而迅速增加。
图 4b 是狗尾草 DNA热变性曲线。曲线 a 和曲线 b 相对照 , 可
证实苯噻草胺使狗尾草 DNA 解链变性。其变性机理可能如
下:苯噻草胺分子中含有苯骈噻唑环 , 它与嘌呤的结构十分相
似 ,可以嵌入狗尾草 DNA 双螺旋中 , 同时引起 DNA 构象发生
变化 , 原本紧密刚性的双螺旋结构开始变得松散 , 链上碱基外
露 , 而苯噻草胺的噻唑环上 S 原子的电负性大于嘌呤碱基中
的 N原子 , 可以破坏 DNA 碱基间的氢键 ,使双链 DNA 解开 , 导
致紫外吸光度值增加。由于 DNA 解链变性而抑制了 DNA 的
复制 , 造成杂草细胞不能分裂和伸长 ,致使整株死亡 。
图 4　狗尾草 DNA变性曲线
a.BTMPA对狗尾草 DNA 吸光度的影响;pH7.4;λmax;5.4μg mlDNA;
M:BTMPA 浓度(mol L);M 0:5.4×10-9mol L BTMPA;
b.狗尾草DNA热变性曲线.
2.7　BTMPA对不同生长期玉米和狗尾草DNA紫外吸收的影响
苯噻草胺对不同生长期玉米 DNA 和狗尾草 DNA 紫外吸
收的影响示于图 5。由图5 可知 , 无论是玉米还是狗尾草 , BT-
MPA对芽期至三叶期的DNA紫外吸收的影响均大于种子和成
株 ,在这段时间内 ,玉米 DNA 吸光度值增加幅度小于 5%, 而
狗尾草 DNA吸光度值增加幅度在 22%-28%之间 , 可见芽期
至三叶期是 BTMPA的最适宜施药时间。生产中也是在这段时
间内施药的。狗尾草芽期至三叶期的 DNA吸光度值增加幅度
大于种子和成株 , 可能与 DNA 的空间结构有关[12] , 有待进一
92005年 10 月　　　　　　　　　　　　　　苯噻草胺与玉米 DNA 和狗尾草 DNA 作用的研究　　　　　　　　　　　　　　
步研究。
图 5　BTMPA对不同生长期DNA吸光度的影响
pH7.4;5.4μg ml DNA;260nm;1.0×10-5mol L BTMPA
a:狗尾草;b:玉米.
2.8　时间对 BTMPA-DNA体系吸光度的影响
时间对 BTMPA-DNA 体系吸光度的影响示于图 6 和图7。
由图6 可知 , 当 BTMPA 浓度低于 5.4×10 -9mol L 时 , 狗尾草
DNA的吸光度值随时间变化很小;当 BTMPA 浓度在 5.4×
10 -8mol L-5.4×10-5mol L之间时 , 狗尾草 DNA 的相对吸光
度随时间逐渐增大 , 表明时间越长 , 除草效果越好 。在图 7
中 , BTMPA浓度在 5.4×10 -9mol L-5.4×10-6mol L 之间时 ,
玉米 DNA 吸光度值随时间变化不大;BTMPA 浓度为 5.4×
10 -5mol L时 , 4h以后 , 时间增加 , 玉米 DNA 吸光度值增大 , 表
明产生了药害。综合图 6 和图 7 实验结果 , BTMPA旱地除草
时在植物体内 BTMPA 的合适浓度为大于 5.4×10-9mol L , 小
于 5.4×10 -5mol L。
图 6　时间对 BTMPA-狗尾草DNA体系吸光度的影响
5.4μg ml DNA;260nm;pH7.4;BTMPA(mol L)
a ,5.4×10-5;b , 5.4×10-6;c , 5.4×10-7 ;d , 5.4×10-8 ;e , 5.4×
10-9.
图 7　时间对 BTMPA-玉米DNA体系吸光度的影响
5.4μg ml DNA;260nm;pH7.4;BTMPA(mol L)
a ,5.4×10-5;b ,5.4×10-6;c ,5.4×10-7;d ,5.4×10-8;e ,5.4×10-9.
2.9　温度对 BTMPA-DNA体系吸光度的影响
温度对 BTMPA-狗尾草 DNA 体系吸光度的影响列于表
2。由表 2可知 , 用 BTMPA进行旱地除草的最适温度为 20℃-
30℃。狗尾草从发芽至三叶期之间也正在这段温度范围。
表 2　温度对狗尾草 DNA 吸光度的影响
(5.4×10-6mol L BTMPA;7.5μg ml DNA;pH7.4;反应时间 60min)
温度(℃) RABS
15 1.24
20 1.35
25 1.40
30 1.38
35 1.32
2.10　2-氨基苯骈噻唑和萘对狗尾草 DNA吸光度的影响
实验研究了与 BTMPA分子结构类似的 2-氨基苯骈噻唑
和萘对狗尾草 DNA吸光度的影响。图 8 是 2-氨基苯骈噻唑
对玉米和狗尾草 DNA紫外吸收的影响 , 由图 8 可知 , 2-氨基
苯骈噻唑加入后 , 玉米 DNA 的Amax没有明显变化 , 且紫外吸收
光谱的形状和λmax 没有变化 , 而狗尾草 DNA 的 Amax在1.5h后
增加 30%。此实验结果证实苯噻草胺分子中的苯骈噻唑环插
入了狗尾草 DNA 分子中 , 破坏 DNA 分子碱基间的氢键 , 使双
链解开 , 导致紫外吸光度增加。
图 8　2-氨基苯骈噻唑对狗尾草DNA吸光度的影响
5.0×10-5mol L 2-氨基苯骈噻唑;pH7.44;5.4μg ml DNA
a:狗尾草;b:玉米
为了进一步印证苯噻草胺中的苯骈噻唑环嵌入了狗尾草
的 DNA 分子中 ,我们试验了萘对狗尾草和玉米 DNA的作用(图
9)。由图9 可知 , 萘对狗尾草DNA和玉米DNA 的紫外吸收均没
有明显影响。萘与2-氨基苯骈噻唑及苯噻草胺中苯骈噻唑环
的结构相似 ,接近平面结构, 可插入到 DNA 分子中 , 但由于萘分
子中没有电负性元素 ,即使嵌入了 DNA 分子 ,也不能破坏 DNA
分子中碱基间的氢键 ,因而不能使 DNA 解链变性。
图 9　萘对狗尾草 DNA 吸光度的作用
pH7.4;5.4×10-5mol L 萘;5.4μg ml DNA;a:狗尾草;b:玉米.
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农杆菌介导法获得转反义磷脂酶 Dγ基因大麦
吕维涛1 ,刘芳1 ,崔德才2 ,赵檀方1(1.山东农业大学农学院 ,山东 泰安 271018;2.山东农业大学生命科学院 , 山东 泰安 271018)
摘要:在含有反义磷脂酶 Dγ基因(PLDγ)的根癌农杆菌介导下 ,以自然状态下生长的大麦作受体进行转基因实验。对获得的
T1 代种子进行抗生素筛选 、PCR和 PCR-Southern杂交鉴定 , 证实反义 PLDγ基因已整合到大麦基因组中。通过对转基因植株的
耐盐性鉴定 ,获得了一批可耐 0.7%NaCl的植株。
关键词:大麦;农杆菌;转化;反义磷脂酶 Dγ
中图分类号:Q785　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)05-0011-03
Production of Transgenic Barley with Anti-PLDγ
Gene Via Agrobacterium Tumefaciens
LV Wei-tao1 ,LIU Fang1 ,CUI De-cai2 ,ZHAO Tan-fang1
(1.College of Agronomy , Shandong Agricultural University , Taian 271018;2.College of Life Science ,Shandong Agricultural University , Taian 271018, China)
Abstract:Antisense phospholipase Dγ(PLDγ)gene was introduced into Barley457 growing in the field by Agrobacterium Tumefaciens.The seeds of
T1 plantlet were harvested and selected in culture medium containing 70mg l kanamycine.By PCR and PCR-Southern analysis , anti- PLDγgene
has been integrated into barley genome.Tests showed that the transgenic plants can grow well on the culture medium with 0.7%NaCl.
Key words:barley;Agrobacterium Tumefaciens;transformation;antisense phospholipase Dγgene
收稿日期:2005-05-21;修回日期:2005-07-12
作者简介:吕维涛(1981-),男 ,硕士生 ,专业方向:作物遗传育种 , E-
mail:lvweitao1981@eyou.com。
　　大麦为世界上仅次于小麦 、水稻和玉米的主要禾谷类作
物 ,无论种植面积还是产量都居第 4 位 ,在世界农业生产中具
有重要意义。大麦具有营养价值高 , 生育期短 、早熟 、丰产和
适应性广等特点 ,因此在某些高寒 、干旱和盐碱地区至今仍然
是主要的粮食作物。近年来 ,随着国民经济的发展 , 特别是随
着啤酒工业 、饲料工业和瘦肉型猪饲养业的兴起与发展 , 大麦
日益商品化 ,在育种目标上要求高产优质多抗 ,进一步重视抗
(耐)性育种 。大麦病害主要是网斑病 、黄花叶病 、白粉病等 ,
大麦抗源资源有限 , 因此选育新的抗源资源对于大麦育种具
有十分重要的意义[ 1] 。
磷脂酶 D(PLD)是植物的一种主要磷脂酶。 PLD不仅可以
水解磷脂 ,影响细胞膜的结构和稳定性 , 而且磷脂的水解产物
IP3、DAG、PA 和乙醇胺还可以作为第二信使 , 参与信号传递过
程 ,触发细胞内与抗性有关的“程序化反应” , 如:抗逆性和抗
病性等。所以 , PLD是一种既具有水解作用又具有信息传递作
用的双重作用酶 , 在植物生长过程中起重要作用[2] 。植物在
机械损伤 、冷害 、干旱 、高盐 、营养不良 、病虫害等逆境条件下
PLD的活性增加 ,磷脂降解 、膜通透性改变 ,造成植物伤害甚至
死亡[ 3-6] 。如果能在一定范围内抑制 PLD 的活性 , 则有可能
改变植物对逆境的反映 , 减少伤害。随着对 PLD 基因与 PLD
酶研究的深入 , 已成功获得毛白杨[ 3] 、烟草 、拟南芥[ 4] 的转化
植株 , 从而获得了许多有特殊性状的转基因植株及其后代。
转反义 PLDγ基因的拟南芥植株和野生型的相比 , 衰老明显延
迟 ,抗寒性和耐盐能力明显提高。
鉴于以上思考 ,本实验希望通过转反义 PLDγ选育出抗逆
性显著提高的大麦新种质。为了获得较高的转化效率和方便
操作 ,笔者对农杆菌介导法进行了改良 , 利用自行构建的载体
成功地将反义 PLDγ基因转入大麦 , 并对其进行了分子生物学
鉴定和耐盐初选。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　大麦材料:选用材料为山东农业大学自育的二棱大麦
新品系 457。
1.1.2　质粒:转化用质粒 PKYLX7 的简要图谱见图 1。
1.1.3　菌株:农杆菌菌株 EHA105。
1.2　方法
采用农杆菌介导和自然生长状态下的大麦作受体进行基
因转化的方法。
图 1　表达载体 PKYLX7质粒图谱
Fig.1　Diagram of plant expression vector
Anti -PLDγ:反义磷脂酶Dγ基因;Rbc3′:二磷酸核酮糖羧化酶小亚基
E9基因 3′末端终止子;NPTⅡ:新霉素磷酸转移酶基因。
1.2.1　含反义 PLDγ基因的农杆菌培养液与浸染液的制备
用液体 LB 培养基 100ml 加利福平(30mg l)、卡那霉素
(70mg l)和四环素(6.5mg l)180r min 的条件下振荡培养含反义
PLDγ基因的农杆菌 20h 左右。 待农杆菌生长至对数生长期 ,
将菌液倒入离心管离心 , 倒掉上清液 ,加入悬浮液(含 5%蔗糖
和 0.04%的吐温-80)重新悬浮沉淀 ,用作悬浮液。
1.2.2　农杆菌法转基因:在大麦挑旗期选取旗叶叶耳距在
0.1-1.0cm 的孕穗用注射器将含有反义磷脂酶 Dγ基因的菌
液注入大麦幼穗 , 待菌液从幼穗顶端溢出为止 ,注射 100 穗并
第 15卷第 5 期:11
2005 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.15 , No.5:11
Oct.2005