全 文 :动物医学进展,2015,36(12):72-76
Progress in Veterinary Medicine
朱砂七多糖对雏鸡十二指肠组织形态的影响
收稿日期:2015-06-04
基金项目:陕西省科技攻关项目(2014K02-05-01);陕西省农业财政项目(K332021402);西北农林科技大学2015年国家
级“大学生创新创业训练计划”项目(201510712020)
作者简介:安 乐(1990-),女,陕西蒲城人,硕士研究生,主要从事发育生物学研究。*通讯作者
安 乐,王 娜,刘美琴,高红霞,牟素菁,郭浩杰,刘建新,张为民*,卿素珠*
(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100)
摘 要:通过在雏鸡饮水中每天添加低(0.3g/kg)、中(0.5g/kg)、高(0.7g/kg)剂量的朱砂七多糖
(Polygonum cillinerve polysaccharide,PCP),运用常规组织学制片技术和染色方法分别观察了给药后7、
14、21d鸡十二指肠的组织学特点,肠壁黏膜层上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocytes,IEL)、柱状上
皮细胞间杯状细胞(goblet cels,GC)和肠壁结缔组织内肥大细胞(mast cels MC)的数量差异,研究了朱砂
七多糖对雏鸡十二指肠组织形态的影响。结果表明,PCP可使雏鸡十二指肠的绒毛高度增加、隐窝深度降
低、绒毛高度与隐窝深度比值加大;并可增加黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞以及肠壁肥大细胞的数量,表
明PCP具有促进雏鸡十二指肠组织发育及增强肠道黏膜免疫的作用。
关键词:朱砂七多糖;十二指肠;组织学;发育;雏鸡
中图分类号:S853.7 文献标识码:A 文章编号:1007-5038(2015)12-0072-05
近年来,针对中药多糖的免疫药理学研究成为
热点,已经证实,其具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病
毒、抗菌、抗辐射、抗衰老及抗寄生虫等多种生物活
性,对促进机体特异性免疫与非特异性免疫都有广
泛的影响;同时,多糖为天然产物,具有毒副作用小、
无残留、不产生耐药性等优点,因而应用前景广阔。
中药多糖作为生物反应调节剂,可以激活T/B淋巴
细胞 、巨噬细胞 、自然杀伤(NK)细胞等免疫细胞,
促进多种细胞因子的释放,促进抗体的生成,激活补
体系统等[1]。多糖除了具有上述生物活性外,研究
表明,有些植物多糖如芦荟多糖、大枣多糖及人参茎
叶多糖等还可促进动物肠道的发育[2-4]。
朱砂七为蓼科植物Polygonum cillinerve(Na-
kai)Ohwl的块根 ,属于“太白七药”之一,因其具有
显著的止血止泻、清热解毒和去风湿等功效而为民
间常用。现代药理学研究证实其含有大黄素、大黄
素葡萄糖苷和大黄素甲醚等蒽醌类物质。研究表
明,朱砂七水浸液对多种肠道及呼吸道病毒有较好
的广谱抗病毒功能;通过直接杀灭和抑制单纯疱疹
病毒对细胞的吸附、侵入而发挥体外抗该病毒的作
用[5];朱砂七中的总蒽醌对流感病毒有一定的抑制
作用[6]。近年来的研究发现蒽醌类化合物具有抑制
肿瘤的发生、促进肿瘤凋亡的作用[7]。而有关朱砂
七多糖的研究则报道较少,Cui J J等[8]的研究表明,
给小鼠饲喂朱砂七粗多糖能显著克服环磷酰胺诱导
的免疫抑制,通过提高免疫抑制模型小鼠的过氧化
酶、谷胱甘肽过氧化物酶、总氧化能力及过氧化氢酶
水平来预防免疫系统的氧化损伤。王晓梅等的研究
显示,朱砂七多糖在浓度为5mg/mL时,对 O-2和
·OH自由基清除率最高,分别为63%和48%,在浓
度为0.09mg/mL 时对亚硝酸盐的清除率最高
(67.03%),表明朱砂七多糖具有较强的抗氧化活
性[9]。本课题组的前期研究初步证实,PCP具有体
外抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的作用[10]。有关
朱砂七多糖对动物肠道组织发育及在疫病防治方面
的研究至今尚无报道,因此本试验就朱砂七多糖对
雏鸡十二指肠的组织发育及黏膜免疫相关细胞分布
的影响进行研究,为朱砂七资源的开发和综合利用
提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试多糖 朱砂七多糖,由本校动物医学院
中兽医学研究室制备并提供[13]。
1.1.2 试验动物与饲养管理 1日龄非免疫罗曼
公鸡160只,购自陕西省武功镇某孵化场,饲喂日粮
采用华秦911A蛋小鸡配合饲料为陕西华秦饲料有
限公司生产。采用立体笼养,自由采食和饮水。
1.1.3 主要试剂与仪器 苏木色精、甲苯胺蓝为上
DOI:10.16437/j.cnki.1007-5038.2015.12.015
海蓝季科技发展有限公司产品;碱性品红和伊红为
Solarbio公司产品;LEICA RM 2126型旋转石蜡切
片机为徕卡仪器有限公司生产;Motic数码显微镜
为厦门麦克奥迪实业有限公司生产;电热恒温水浴
锅为北京市长风仪器仪表公司生产;GTK-2002自
动摊片烤片机为西安瑞丰仪器设备有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理 1日龄罗曼公鸡常规饲
养1周后,随机分为4组,每组40只,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组
为朱砂七多糖试验组,第Ⅳ组为空白对照组。每天
清晨在鸡空腹时,分别在第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的饮水中每
天加入生药含量分别为低(0.3g/kg)、中(0.5
g/kg)、高(0.7g/kg)剂量的朱砂七多糖,让鸡自由
饮用。空白对照组(IV组)不加药液,让鸡自由饮
水。
1.2.2 样品采集 分别于给药后的7、14、21d,每
组随机选取6只雏鸡,颅面动脉放血致死,迅速取十
二指肠,用新配制的生理盐水冲洗,放入Bouin′s液
中固定48h以上。
1.2.3 十二指肠组织形态观察 固定好的十二指
肠组织按常规组织学方法制备石蜡切片,肠管连续
横切,制得3套切片,分别行 HE染色、PAS染色和
肥大细胞甲苯胺蓝染色。肠道形态观察参照Flem-
ing等[11]的方法进行,具体步骤:挑选五张染色清晰
的切片,每张切片选取10根最长且走向平直、伸展
良好的绒毛,通过 Motic数码显微图像处理系统进
行定量分析,测量其绒毛高度(vilum heigh,VH)
及与之相连的隐窝深度(crypt depth,CD),并计算
绒毛高度与隐窝深度之比值(VH/CD)。十二指肠
黏膜上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,
IEL)、杯状细胞(goblet cel,GC)和肥大细胞(mast
cel,MC)数量的统计参考文献[12]介绍的方法进行。
1.2.4 数据统计分析 所得数据均以平均值±标
准差(珚x±SD)表示,用SPSS 17.0统计软件的 One
Way Anova程序进行统计,比较各组雏鸡十二指肠
绒毛高度、隐窝深度及二者比值的差异,以及肠壁组
织内黏膜免疫相关细胞(IEL、GC和 MC)数量的差
异,以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果
2.1 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠发育的影响
镜下可见,雏鸡十二指肠组织结构清晰、分层明
显,黏膜上皮和固有层向肠腔突出形成指状的肠绒
毛(图1)。给药后7d,各剂量PCP组和对照组雏鸡
十二指肠绒毛分布均匀、排列整齐,隐窝较浅;给药
后14d,各剂量的PCP组雏鸡十二指肠绒毛高度明
显增大,其隐窝深度均小于对照组(图1);给药后
21d,各组雏鸡的肠壁进一步变粗,管径增大,其组
织学结构与14d时的相近。
经 Motic数码显微图像处理系统测量各组雏鸡
的绒毛高度(VH)及与之相连的隐窝深度(CD),并
计算绒毛高度与隐窝深度的比值(VH/CD),统计结
果见表1。7d时低、中、高剂量PCP组绒毛高度均
显著高于对照组(P<0.05),仅高剂量PCP组隐窝
深度显著低于对照组(P<0.05),低、中剂量PCP组
绒毛高度与隐窝深度比值分别显著(P<0.05)和极
显著高于对照组(P<0.01);14d时低、中剂量PCP
组绒毛高度显著高于对照组(P<0.05),高剂量
PCP组绒毛高度极显著高于对照组(P<0.01);低、
中剂量PCP组隐窝深度分别显著(P<0.05)和极显
著低于对照组(P<0.01),而中、高剂量PCP绒毛高
度与隐窝深度比值均极显著高于对照组 (P<
0.01);21d时低、中、高剂量PCP组绒毛高度均极
显著高于对照组(P<0.01),低、中剂量PCP组隐窝
深度分别显著(P<0.05)和极显著低于对照组(P<
0.01),中、高剂量PCP组绒毛高度与隐窝深度比值
均显著高于对照组(P<0.05)。
2.2 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠黏膜上皮内淋巴
细胞和杯状细胞数量的影响
通过 HE染色切片的观察,黏膜上皮内杯状细
胞呈高脚玻璃杯状、核位于细胞基部,胞质呈空泡
状;黏膜上皮内淋巴细胞则散布于柱状细胞之间,细
胞核圆形、大而深染;PAS染色后,杯状细胞胞质呈
紫红色,结合两种染色观察结果,统计各组雏鸡十二
指肠黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞的数量(表
2)。7d时低、中、高剂量PCP组黏膜上皮内淋巴细
胞数量均显著高于对照组(P<0.01);14d时中、高
剂量PCP组黏膜上皮内淋巴细胞数量分别显著(P
<0.05)和极显著(P<0.01)高于对照组;21d时
低、中、高剂量PCP组黏膜上皮内淋巴细胞数量均
极显著高于对照组(P<0.01)。7d时中、高剂量
PCP组黏膜上皮内杯状细胞数量分别是极显著(P
<0.01)和显著(P<0.05)高于对照组;14d时中剂
量PCP组黏膜上皮杯状细胞数量显著(P<0.05)高
于对照组;21d时中、高剂量PCP组黏膜上皮内杯
状细胞数量分别显著(P<0.05)和极显著(P<
0.01)高于对照组。
2.3 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠肠壁肥大细胞数
量的影响
经甲苯胺蓝染色后,肥大细胞呈圆形或卵圆形,
核呈空泡状或淡蓝色,胞质内充满蓝紫色颗粒。十
37安 乐等:朱砂七多糖对雏鸡十二指肠组织形态的影响
二指肠壁中肥大细胞主要位于黏膜固有层和黏膜下
层,肌层之间有零星分布。对各组雏鸡十二指肠壁
中肥大细胞分布进行计数(表3)。7d时低、中、高
剂量PCP组肠壁肥大细胞数量与对照组差异不显
著;14d时中、高剂量PCP组肠壁肥大细胞数量均
显著高于对照组(P<0.05);21d时低剂量PCP组
肠壁肥大细胞数量显著高于对照组(P<0.05),而
中、高剂量PCP组肠壁肥大细胞数量则均极显著高
于对照组(P<0.01)。
A~D.分别为对照组及低、中、高剂量PCP组雏鸡十二指肠组织结构
A-D.Indicate chicken duodenum histology of control group,low-dose,middle-dose and high-dose PCP,respectively
图1 给药后14d各组雏鸡十二指肠组织学结构(100×)
Fig.1 The histological structure of chicken duodenum on days 14after the PCP treatment(100×)
表1 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠绒毛高度、隐窝深度及二者比值的影响 (珚x±SD)
Table 1 Effects of PCP on the vilum height(VH),the crypt depth(CD)and the ratio of vilum height to crypt depth(VH/CD)
in chicken duodenum(珚x±SD)
项目Item 组别 Groups 7d 14d 21d
绒毛高度/μm
VH
对照组Control group 1026.15±60.71 1156.20±69.98 1179.98±83.86
PCP低剂量Low-dose PCP 1114.78±50.13* 1289.43±140.93* 1455.63±123.17**
PCP中剂量 Middle-dose PCP 1102.23±79.95* 1288.02±175.54* 1455.90±67.74**
PCP高剂量 High-dose PCP 1184.55±55.71* 1488.54±139.28** 1583.21±100.76**
隐窝深度/μm
CD
对照组Control group 120.51±8.59 127.64±22.51 116.30±11.81
PCP低剂量Low-dose PCP 113.99±16.74 119.61±7.25* 102.49±9.39*
PCP中剂量 Middle-dose PCP 113.27±14.33 105.21±33.66** 94.38±14.24**
PCP高剂量 High-dose PCP 105.24±12.11* 123.99±12.18 113.96±18.94
绒毛高度与隐窝深度比值
VH/CD
对照组Control group 8.56±0.90 12.04±1.85 11.57±1.07
PCP低剂量Low-dose PCP 10.81±1.38* 13.22±1.99 12.67±2.19
PCP中剂量 Middle-dose PCP 11.37±1.35** 15.47±2.44** 13.15±2.93*
PCP高剂量 High-dose PCP 9.85±1.34 19.65±3.10** 17.21±3.67*
注:“*”表示与对照组相比差异显著(P<0.05);“**”表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。
Note:Compared with the control group,“*”means significant difference(P<0.05);and“**”means extremely significant difference(P<
0.01).
表2 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量的影响 (珚x±SD)
Table 2 Effects of PCP on number of intraepithelial lymphocytes(IEL)and goblet cels(GC)
in duodenum epithelium mucosa of chickens(珚x±SD)
项目Item 组别 Groups 7d 14d 21d
上皮内淋巴细胞
IEL
对照组Control group 12.80±1.64 19.00±1.58 24.80±1.92
PCP低剂量Low-dose PCP 15.00±1.58* 20.00±1.58 27.40±1.14**
PCP中剂量 Middle-dose PCP 16.40±1.14* 21.00±1.58* 28.20±1.30**
PCP高剂量 High-dose PCP 17.20±1.30* 22.00±1.58** 30.00±1.58**
杯状细胞
GC
对照组Control group 19.00±1.58 20.00±1.58 23.00±1.22
PCP低剂量low-dose PCP 20.00±1.58 21.00±2.92 25.00±1.58
PCP中剂量 Middle-dose PCP 22.80±1.92** 23.80±2.39* 27.00±2.55*
PCP高剂量 High-dose PCP 21.80±1.92* 21.20±2.49 28.00±1.58**
注:细胞计数方法:以统计100个黏膜上皮柱状细胞间IEL和GC的数量为准。“*”表示与对照组相比差异显著(P<0.05);“**”表示与对
照组相比差异极显著(P<0.01)。
Note:Cel counting method:the number of GC and IEL were counted between 100columnar cels in epithelium mucosa.Compared with control
group,“*”means significant difference(P<0.05),and“**”means extremely significant difference(P<0.01).
47 动物医学进展 2015年 第36卷 第12期(总第270期)
表3 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠肠壁肥大细胞数量的影响 (珚x±SD)
Table 3 Effect of PCP on number of mast cels in chicken duodenum wals(珚x±SD)
组别 Groups 7d 14d 21d
对照组Control group 314.20±7.26 348.60±7.23 446.20±10.76
PCP低剂量low-dose PCP 321.20±5.50 354.80±4.60 460.00±8.06*
PCP中剂量 Middle-dose PCP 319.60±6.23 374.00±4.47* 481.00±11.09**
PCP高剂量 High-dose PCP 317.60±7.54 400.40±8.44* 497.00±10.70**
注:“*”表示与对照组相比差异显著(P<0.05);“**”表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。
Note:Compared with the control group,“*”means significant difference(P<0.05),and“**”means extremely significant difference(P<
0.01).
3 讨论
3.1 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠黏膜形态的影响
动物小肠肠壁的黏膜及黏膜下层共同向管腔突
出形成环形的褶皱、皱襞上有许多根指状突起-小肠
绒毛,而肠绒毛的表面是密集微绒毛组成的纹状缘,
这些结构极大地增大了小肠黏膜的吸收表面积。因
此,小肠组织结构的完整性是其消化吸收功能的生
理学基础,其中小肠的绒毛高度、隐窝深度、肠壁厚
度及绒毛表面积已成为衡量小肠消化吸收功能的重
要指标。绒毛变短,说明肠黏膜上皮吸收细胞数量
减少,其对营养物质的消化和吸收能力降低;肠隐窝
是由肠绒毛基部上皮下陷至固有层内形成的管状结
构,其深度的变化提示隐窝细胞生长速度的快慢,在
一定程度上影响消化和吸收机能[13]。而绒毛高度
与隐窝深度的比值可综合反映小肠黏膜的吸收功能
状况,比值下降表示黏膜受损,提示机体消化吸收功
能降低,影响动物的生长发育;比值上升则表明黏膜
状态有所改善,机体消化吸收功能增强,促进机体生
长发育[14]。
研究表明,有些植物多糖可促进动物肠道组织
的发育。乔家运等人研究了仔猪日粮中添加芦荟多
糖(aloe vera polysaccharide,AVP)后对肠道形态的
影响,结果表明,日粮中添加芦荟多糖后可提高十二
指肠段、空肠前段和空肠后段的绒毛高度[2]。王留
等研究大枣多糖对保育猪肠道微生物菌群及肠道组
织形态的影响,结果表明,饲料中添加大枣多糖
1 000mg/kg和1 500mg/kg时能够促进肠道内双
歧杆菌和乳酸杆菌的繁殖,并可通过显著增加仔猪
小肠各段的绒毛长度和降低肠道的隐窝深度提高肠
道的消化吸收能力[3]。张勇等[15]报道证实在雏鸡
饲料中添加不同剂量的黄芪多糖能增加肉鸡十二指
肠绒毛高度、降低隐窝深度。本研究结果表明,饮水
中添加朱砂七多糖7d后,各试验组雏鸡十二指肠
的绒毛高度均显著高于对照组,高剂量PCP组隐窝
深度显著低于对照组,低、中剂量PCP组绒毛高度
与隐窝深度比值显著高于对照组;给药14d和21d
后,各试验组雏鸡十二指肠的绒毛高度显著提高,隐
窝深度则显著降低,绒毛高度与隐窝深度比值显著
增大,表明添加PCP在一定程度上能促进雏鸡十二
指肠对营养物质的吸收,有利于雏鸡的生长发育。
3.2 朱砂七多糖对雏鸡十二指肠壁组织内黏膜免
疫相关细胞分布的影响
肠道黏膜及黏膜下层有大量的淋巴细胞和肥大
细胞存在,它们与黏膜上皮内杯状细胞一起发挥重
要的黏膜免疫功能,其中肠黏膜柱状上皮内淋巴细
胞作为最早接触外来抗原的免疫活性细胞,承担关
键的黏膜免疫屏障的角色[16],该种细胞数量的增加
提示机体的肠道黏膜免疫功能状态有所提高;杯状
细胞的主要功能是分泌黏液(成分主要为黏蛋白),
对小肠黏膜上皮具有保护和润滑作用,此外,黏液成
分中的黏蛋白以及柱状细胞分泌的复合糖蛋白结合
形成黏膜表面的细胞衣(糖衣),后者与膜分子构型
中的蛋白质、脂质牢固嵌合,形成黏膜表面一道重要
的物理屏障。肥大细胞广泛存在于机体各处的结缔
组织中,除了参与机体的过敏和炎症反应外,在先天
性免疫和获得性免疫中也发挥着重要作用,因此肥
大细胞也是机体中一种重要的免疫活性细胞[17]。
有研究显示,日粮中添加黄芪多糖可显著增加罗非
鱼肠道黏液细胞和上皮内淋巴细胞的数量,表明饲
料中添加黄芪多糖可以提高罗非鱼机体的特异性免
疫功能[18]。黄其春等的研究显示,日粮中添加
2g/L和2.5g/L的银杏叶提取物可显著提高十二
指肠上皮内淋巴细胞、肥大细胞以及杯状细胞的数
量而有助于增强肉仔鸡十二指肠的黏膜免疫功
能[19]。本试验结果显示,添加低、中、高剂量的朱砂
七多糖7、14、21d后,可显著增加雏鸡十二指肠黏
膜上皮内淋巴细胞数量;添加PCP 7d后,中、高剂
量组雏鸡十二指肠黏膜上皮内杯状细胞数量显著高
于对照组,添加14d后,各剂量PCP组黏膜上皮杯
57安 乐等:朱砂七多糖对雏鸡十二指肠组织形态的影响
状细胞数量均显著高于对照组,添加21d后,中、高
剂量PCP组黏膜上皮内杯状细胞数量显著增高。
添加PCP 14d时,中、高剂量PCP组肠壁肥大细胞
数量均显著高于对照组,而添加21d后各剂量PCP
组肠壁肥大细胞数量均显著高于对照组。说明
PCP可通过增加雏鸡十二指肠壁组织黏膜免疫相
关细胞(IEL、GC和 MC)数量提高其黏膜免疫屏障
功能。
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Effects of Polygonum cillinerve Polysaccharides on
Duodenum Histology of Chickens
AN Le,WANG Na,LIU Mei-qin,GAO Hong-xia,MOU Su-jing,
GUO Hao-jie,LIU Jian-xin,ZHANG Wei-min,QING Su-zhu
(College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi,712100,China)
Abstract:To evaluate the effect of Polygonum cillinerve polysaccharides(PCP)on duodenum histology,
the chickens were administrated with low dose(0.3g/kg),middle dose(0.5g/kg),and high dose(0.7
g/kg)of PCP by drinking water supplementation respectively,then the histological structure of duode-
num,distribution of both intraepithelial lymphocytes(IEL),goblet cels in mucosa and mast cels in whole
intestinal wal were observed by using common histological technologies on days 7,14and 21after the PCP
treatment.The results showed that PCP could increase the vilum height(VH)and the ratio of vilum
height to crypt depth(VH/CD),and decrease the crypt depth(CD).In addition,PCP could increase the
number of intraepithelial lymphocytes(IEL),goblet cels(GC)in mucosa and mast cels(MC)in whole
intestinal wal.The results indicated that PCP possessed the role of prompting duodenum development and
enhancing intestinal mucosal immunity in chickens.
Key words:Polygonum cillinerve polysaccharide;duodenum;histology;development;chicken
67 动物医学进展 2015年 第36卷 第12期(总第270期)