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裸燕麦不同外植体愈伤组织诱导及再生植株变异研究



全 文 :内蒙古农业科技 l的5年 第 6期
裸燕麦不同外植体愈伤组织
诱导及再生植株变异研究
崔林 ·范银燕
(山西省农科院高寒作物研究所 )
近年来 , 离体培养材料主要有花尊原基 、
子房 、 幼穗 、 种胚 、 颖片和花药等部分 、卜 6 ; 。
各研究大多是用某种外植体诱导愈伤组织 , 进
而获得再生植株 。 而对不同外植体愈伤组织
诱导效果的比较 、 胚性愈伤组织状态的调控 、
以及再生植株后代变异性状选择效果的研究 ,
却尚未见报道 。 本文就这方面的研究结果报
道如下 。
一 、 材料和方法
1
、 外植体 离体培养
( 1 )选 用6个裸燕麦 ( A v e n a n u d e ) 品种 :
晋燕八号 、 83 43 、 83 30 、 品 6号 、 品 1 6号 、
20一 1 。
(2 ) 幼穗离体培养 : 在裸燕麦幼穗分化后
期 , 取 1 . 0一 2 . Oc m 的幼穗 , 除去外层叶后在7。%
乙醇 中表面消毒 10 分钟 , 用 l仍6安替福民浸泡
20 分钟 , 无菌水冲洗 3一 4次 , 在超净工作台上
剥出幼穗 , 切成 2一 3m m小段后 , 接种在 I N 6培
养基上 。
(3 )幼胚离体培养 : 在裸燕麦开花授粉后10
一 12天 , 取穗部按幼穗消毒方法进行表面消毒 ,
在超净工作台上剥出幼胚 , 接种在 IN时言养基上 。
(4 )成熟胚离体培养 : 选取饱满 、 具有发
芽能力的成熟种子 . 消毒 : 7帆乙醇浸泡 2分钟
一无菌水冲洗一次一安替福民原液浸泡2小时
一无菌水冲洗3次一无菌水中浸泡 14 一 16 小时 。
剥取种胚后进行第二次消毒处理 : 安替福民原
液浸泡 30 分一无菌水冲洗 5次 , 在超净台工作
台上接种到 IN 6培养基上 。
(5 )培养条件 : 在人工气候箱中暗培养 , 温
度为26 一 28 “ C 。 诱导愈伤组织 20 天左右 。 选
取新鲜的愈伤组织转移到 IM I一4培养基上继
代培养 , 每 25 一30天继代培养一次 。
(6 )再生植株方法 : 按崔林等 19 3年报道
的植株再生法进行 窟 。
2
、 农艺性状 评价
(l ) 选择程序 : 组织培养再生植株为 0R ,
由于再生植株受长期培养条件的影响 , 绝大多
数性状变异是生理效应 , 不能遗传 , 所以不进
行选择 。 lR 选择单株 , 在R Z种植成株系 。 R Z按
株系选择 , 入选株系在 R3种植成品系 。 每一个
再生单株所有后代品系为一个系谱 。
(2 )田间试验 : 56 个系谱包括有 268 个品系
在田间完全随机区组排列 、 重复四次 , 小区面
积 1 x l . 5m 2 , 每 个材料种 4行 , 用未经组织培
养的品种做对照 , 对7个农艺性状进行评价 。
(3 )研究性状 : 抽穗期 (6 月1 日后的天数) 、
株高 c( m ) 、 千粒重 (g) 、 产量 (公斤 / 亩 ) 、 单
株粒数 、 产草量 (公斤 / 亩 ) 、 旗 叶面积 c( 稍
一每个品系测定20 个展开叶 。 各性状按系谱
和品系分另l]计算平均值 , 并进行变异分析和现
实遗传力估算 。
二 、 结果与分析
1
、 不 同外植体约愈伤组 织诱 导比 较
表1看出 : 不同品种无论在幼穗 、 幼胚或 的出愈率最低 。 而其它品种在不同外植体培
者成熟胚的离体培养中 , 愈伤组织诱导率存在 养中 , 出愈率排列顺序不完全一致 。 在所有品
着明显的差异 。 晋燕八号在三种外植体培养 种中 , 三种外植体以成熟胚离体培养的出愈率
中的出愈率始终高于其他品种 , 相反品 16 号 最好 , 幼胚次之 。 出愈率最高的晋燕八号成熟
表 1 不同品种的三种外植休 出俞率比较
品 种 幼 穗 幼 胚 成熟胚
接种数 愈伤数 出愈率 (% ) 接种数 愈伤数 出愈率 (% ) 接种数 愈伤数 出愈率 ( ”么)
晋燕 八号 8 52 67 O 78 . 6 3铭 2 93 8 4 . 2 4 26 4 06 9 5 . 3
83 4 3 { 1 56 6 2 39
.
7 28 0 1 72 6 1
.
4 35 3 260 7 3
.
7
83 3 0 2 40 56 23
.
3 19 8 1 07 5 4
.
0 2 88 183 63
.
5
2 (卜 l 3 40 14 1 4 1 . 5 434 2 32 53 . 5 25 2 175 69 . 4
品 6号 28 3 93 32 . 9 363 2 29 63 . 1 32 0 2 48 刀 . 5
品 16号 17 4 34 19 . 5 278 7 4 26 . 6 34 2 107 3 1 . 3
胚比幼穗高 16 . 7 ; a , 比幼胚高 11 . 1 ; 6 。
三种外植体初始愈伤组织状态也有着明
显的不同 。 幼穗诱导出的愈伤组织多为结构
致密 、 质地脆硬 、 表面有突起 、 生长较慢 、
色泽鲜黄 、 在愈伤组织生长过程中不断分化
出幼芽 。 幼胚诱导的愈伤组织多为结构松散 、
质地稀泥状 , 色泽为 白色 、 生长比较快 。 成熟
胚诱导的愈伤组织为白色 、 质地松软 、 表面
为瘤状结构 、 细胞大 、 胞质浓 、 生长旺盛 。
三种愈伤组织 以成熟胚 愈伤组织容易调控产
生出胚性愈伤组织 。
2
、 愈伤 组织 改造 和胚性愈伤 组织 调控
表 2 愈伤组织诱导 、 继代的培养基配方 (m 9 . 犷 l)
培养基成份 IN 6 IM I IM Z IM 3 IM 4
大量元素 N 6 2 / 3M S 2 / 3M S 2 / 3M S 2 / 3M S
谷氨酸胺 150 150 150 15 0
天冬氨酸 150 150 150 15 0
酵母提取物 5 O 50 50 印
蔗糖 6(叉X幻 3 (叉刃 O 3 (刀X) 3以刀) 3仪刀 )
2
.
4一D 3 0 3 6 8
N A A 1 0
.
5 l
6一 BA 2 1
K T 0
.
5 0
.
5
注 : 在各培养基中 , 微量元素和有机物为 2倍M S , 铁
盐和肌醇与 M S相同 , p H为 5 . 8 , 琼醋为8% 。
胚性愈伤组织对禾谷类作物细胞和原生
质体培养体系的建立 , 具有极为重要的作用子
为此 , 我们对成熟胚的愈伤组织状态进行继代
改造 。 继代培养基为 IM 配以不同的激素 (表
2 )

当愈伤组织转移到 IM Z培养基上 , 其表面
长出颗拉状态 、 分散性好 、 浅黄色的胚性愈
伤组织 。 将这些结构的愈伤组织及时分离下
来 , 转移到 IM赔养基上 , 颗粒状愈伤组织比
例大幅度增加 , 但仍有松散旺盛型愈伤组织出
现 。 继续选择颗粒状愈伤组织 , 转移到 IM 4培
养基上 , 在前 2次继代中 , 颗粒状愈伤组织仍能
很好地维持生长 。 当继代 3一 4次后 , 愈伤组织
生长能力开始出现衰败 , 逐渐长出质地软而韧
性大的白絮状衰败愈伤组织 。 经严格挑选生
长好 、 颗粒状愈伤组织 , 转移到IM I培养基上 ,
发现颗粒状愈伤组织具有明显的恢复趋势 。
根据近二年的愈伤组织状态调控 , 我们归纳出
松脆型 、 分散性好 、 生长势强的颗粒状愈伤组
织的循环调控法 。 具体为 : 愈伤组织依次在
IM Z 一 IM 4上继代 , 每种培养基继代 2次 , 当愈
伤组织在 IM 4培养基上表现生长变慢 , 颗拉状
愈伤组织中嵌合有其它状态的愈伤组织时 , 选
择颗拉状愈伤组织转入 IM I培养基上 , 并适当
给子光照 (王海波曾提到 , 光照具有细胞分裂
素的效应 侧 ) 。 继代 2次后再转入 IM Z , 按 IM 2 3 、 再 生植株后代的性 状 变异
一 IM 4循环培养 。 这样可有效地保持胚性愈 经晋燕八号 、 2-0 1再生植株后代 R浓艺
伤组织状态 , 并缓减其生活力衰退 。 性状比较看出 (表 3) : 无论是在系谱中 、 或是
表3 再生植株品系和系谱与对照的农艾性状比较
口 项 目 株高 抽穗期 旗叶面积 千粒重 单侏粒数 产量 产草量P 口 ( C m ) ; 6月1日后 ( e m Z ) ( g ) ( N 一、 ) ( kg / 亩 ) ( kg / 亩 )
种 的天数 )
- 叫 系谱 n = n 9 1一9 4 12一1 4 9 . 4一12 . 1 23 一2 4 84 . 序 . 1肠 . 4 120 . 6一 165 . 2 358 . 3一 458 . 2
{ 范 围
、 叼目尹
0 J 忡 )> C K宋 O 2 2 1 O 1 O
N )`了C K 6 1 1 0 1 2 1
品系 n 二 56 37一笑 1 () 一 14 8 . 0一 13 . 3 2 1一 25 6 7 . 5一 11 6 . 1 9 . 9一 17 3 . 2 32 1 . 7一父 2 , 2
范 围
灿 , ) C K米 米 2 2 1 14 13 6 5 7
N
、 < C K 3O 11 9 8 13 工6 23
C K 93 1 2 10
.
1 2 3 103
.
3 15 2
.
5 45 2
.
2
一 、 系谱 n 二 4 5 7 4一 86 12一 19 7 . 3一 12 . 工 2 1一 26 53 . 8一 98 . 0 65 . 3一 138 . 5 29 5 . 了一 48 0 . 9
~ 产 范 围
白、
铭兰 N ` )> C K米 3 2 4 5 1 5 6 13
封工
N O < C K l 2 8 O 7 7 2O 5
品系 n 二 2 12 4 6一 8 1 2一 19 6 . 1一 15 . 6 2 1一 28 4 1 . 6一 117 . 0 6 1 . 9一 16 1 . 2 25 0 . 4一 53 8 . 8
范 围
N 。少> C K 米米 3 () 12 1 36 8 4 1 47 31
N ( )` C K 56 23 6 33 29 99 12
C K 82 16 8
.
1 24 7 7
.
3 10 3
.
9 36 6
.
3
注 : 宋与对照差异在 P < 0 . 0 5上的系谱数 米 本与对照差异在 P < 0 . 0 1上的品系数
在品系中 , 所有性状均表现出双向变化 。 在双 照 13 . 6 ; 。 。
向变化中 , 除株高大多数品系表现降低 外, 其 20一1有9个系 i普( 82%) , 晋燕八号有42 个
它性状高于对照的品系数多于比对照低的品 系 i普( 93 川至少在一个性状上发生显著变异 ,
系数 , 虽然其 中达极显著水平的品系不多 , 但 大多数系 i普具有 2个以上性状发生变化 。 晋燕
通过组织培养产生的变异中 , 有益的变异多于 八号在6个增产系潜中 , 有5个系谱具有4个性
不良变异 。 状发生显著变异 , 包括抽穗期 、 旗叶面积 、 千
两个品种都表现为 : 抽穗期和千拉重变幅 粒重 、 单株粒数 、 产草量的增加及株高的降
比较小 , 而旗叶面积 、 单株拉数 、 产量和产草 低 。 2于 1的一个增产系谱 中 , 也伴随着抽穗
量方 面的变幅比较大 。 增产的频率虽然高于 期的减少和旗叶面积与千粒重的增加 。
减产的频率 , 但达到显著差异的频率却少于减 对 7个农艺性状的现实遗传力估算表明 :
产 。 晋燕八号品系各性状的变异一般比20 一 1 旗叶面积和产草量的现实遗传力较低 , 分别为
品系大 , 就产量而言 , 晋燕八号最高产量的品 0 . 3 和 0 . 28 ; 株高 (0 . 54 ) 、 千拉重 (0 . 48 ) 、 产
系超过对照 56 % , 2-0 1最高产量的品系超过对 量 (0
.
54) 为中等 ; 而抽穗期 (1 . 0) 和单株粒数
(0
.
80) 具有较高的现实遗传力 。 说明 , 对组培
株系的株高 、 千粒重 、 产量 、 抽穗期 、 单株
粒数这些性状进行选择 , 在改变性状表现方面
是有效的 。
三 、 讨 论
1
、 幼穗 、 幼胚和成熟胚是离体培养常用
的外植体 , 三种外植体以成熟胚的培养效果最
好 。 它不但出愈率高 , 而且愈伤组织状态比较
好 , 容易调控出胚性愈伤组织 。 其次 , 成熟胚
比幼穗 、 幼胚离体培养 , 具有不受生长季节限
制的优点 , 在一年中随时可 以取材培养 。
2
、 应用愈伤组织的循环式调控法 , 可有
效地缓减愈伤组织的生活力衰退 。 其原因可
能与愈伤组织内部的内源激素有很大关系 。
愈伤组织依次在 IM Z一 IM 4上继代 , 培养基中
生长激素逐渐增加 、 分裂激素减少 。 当愈伤
组织在 I入工一 `上继代 2一 3次时 , 外源生长激素达
到最高峰 , 这时愈伤组织内部的内源生长激素
也达到高峰 。 如果再继续在此培养基上培养 ,
外源生长激素 ( 2 , 4一 D )将起到抑制作用 , 因而
愈伤组织开始衰败 。 当转入 IM I培养基上后 .
外源生长激素骤减 , 分裂激素增加 , 调整了愈
伤组织内源生长激素与分裂激素的比例 , 因而
激 i沂了愈伤组织的生长能力 。
3
、 经再生植株 7个农艺性状评价表明 : 大
多数性状变 异无定 向性 , 它既有超亲本的 , 也
有劣于亲本的变异 。 性状变异并不局限在某
一性状上 , 大多数品系或系谱至少在一个性状
上与对照显著不同 。 研究认为 : 组织培养在体
细胞变异 诱导 上具有明显的作用 。 在裸燕麦
上 , 结合常规育种应用体细胞培养产生无性系
变异 , 可有效地扩大变异范围 , 提高变异频率 ,
对祈品种选育有着极为重要的意义 。 但并非
所有基因型的诱导效果都比较好 , 董合忠在棉
花上提出胚胎诱导 的预决定阂值和预决定表
达闽值的概念 , 并认为这两个阅值不同品种是
不相同的 。 我们的研究也表明 : 晋燕八号出愈
率在三种外植体培养中 , 始终表现最好 , 而品
16号表现最差 。 说明 , 不同基因型自身具有不
同的愈伤组织发生能力 , 愈伤组织发生能力高
的基 因型 , 在同样的培养条件下 , 无论选用何
种形式的外植体进行离体培养 , 其出愈率始终
是高的 。 因此 , 筛选愈伤组织发生能力高的基
因型是非常必要的 。
4
、 通过对适宜的农艺性状选择 , 获得了
裸燕麦组培品系的性状遗传力表现 。 在本研
究中 , 虽然不显著的变异频率比较高 , 但现实
遗传力沽算表明 : 当对这些性状进行选择时 ,
在累加效应的作用下 , 显著的变异性状将会获
得 。
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