全 文 ：鲁梅克斯 K-1杂交酸模愈伤组织诱导
及细胞悬浮系的建立
杨起简1 , 周　禾2 , 于同泉1 , 张　蕾1
(1.北京农学院农学系 ,北京　102206;2.中国农业大学草地所 ,北京　100094)
摘要:研究了不同激素组合处理对鲁梅克斯 K-1 杂交酸模子叶愈伤组织的诱导 , 试验结果表明 ,
2 , 4-D 配合使用 6-BAP时愈伤组织诱导率最高。在附加 1.0 mg/ L 2 , 4-D的液体 MS 培养基中通
过悬浮培养分离出的单细胞 , 经数次继代后获得良好的悬浮培养体系。
关键词:鲁梅克斯 K-1 杂交酸模;子叶;愈伤组织诱导;悬浮培养
中图分类号:S54　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2002)03-0075-05
鲁梅克斯 K-1杂交酸模是由蓼科酸模属(Polygonaceae Rumex)天山酸模和巴山酸模杂交
选育而成的多年生饲料作物。鲁梅克斯 K-1 杂交酸模具有耐盐碱 、 耐旱 、 耐涝 、 速生 、高
产 、 优质等生物学特性 , 其粗蛋白含量高 、 营养丰富并且适口性好 , 既可作为饲料又可作为
食品〔1〕 , 年产鲜草最高可达 240 t/hm2 , 一般为 150 t/hm2 , 粗蛋白含量可占干物质的
38.94%。除蛋白质外 , 杂交酸模还富含维生素 C 、胡萝卜素以及铁 、 硒 、 碘等多种矿物质 。
该品种具有母本巴山酸模的药用特性 , 主要功效用于止血〔2〕。
鲁梅克斯 K-1杂交酸模种子价格较高 , 利用组织培养技术进行繁育 , 可以降低成本 。
试验表明 , 杂交酸模是一种比较容易扩繁的植物 。
在诱导愈伤组织时 , 去分化的细胞不受植物体其他部分的干扰和影响 , 可以用于研究在
整体技术下难以研究的内容 , 如细胞分裂 、 伸长 、脱分化和再分化以及器官发生的机理 、所
需的环境条件及其他内在的生理生化变化。
悬浮培养细胞增殖速度快 , 影响细胞活动的因素相对较为简单 , 生长条件均匀一致 , 适
于进行大规模生产 , 可提高实验的准确性〔3〕 。
本试验以鲁梅克斯 K-1杂交酸模子叶为外植体诱导出愈伤组织 , 并利用愈伤组织进行
了悬浮培养 。探讨了不同外源激素配比对诱导愈伤组织影响 。通过悬浮培养分离出单细胞 ,
为进一步进行单细胞培养及筛选具有抗性的细胞突变体作了前期的准备工作。
1　材料和方法
1.1　材料
杂交酸模种子由中国农业大学草地所提供。
收稿日期:2001-06-10
基金项目:北京市自然科学基金资助项目(699207)
作者简介:杨起简(1952-), 女 , 教授 , 主要从事植物遗传育种和光生物学方面的研究工作。联系人:周禾。
华北农学报 2002 , 17(3):75～ 79
Acta Agriculturae Boreali-Sinica 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
1.2　方法
1.2.1　无菌苗的培养　在无菌条件下消毒后 , 将种子接种到不含激素的 MS 培养基中 , 以
获得无菌苗。
1.2.2　愈伤组织的诱导　待无菌苗子叶伸展后 , 切取 4 ～ 5 mm 长的子叶切块接种在附加
2 , 4-D ,6-BAP 的培养基中诱导愈伤组织 。在温度为(24±1)℃的黑暗条件下培养 28 d。
1.2.3　愈伤组织的继代　愈伤组织形成 14 d后 , 转移到原诱导愈伤组织培养基上进行继代
培养 , 每 14 d继代 1次 。
1.2.4　悬浮培养　取大约 1 g 的愈伤组织块用镊子夹碎 , 转入不含琼脂的液体 MS 培养基
中(附加 1.0 mg/L 2 ,4-D , pH 为 5.8)。每个三角瓶中加入 50 mL 培养基 , 然后把三角瓶放
在转速为 120 r/min的摇床上振荡培养 , 每 7 d 继代 1次 , 培养室温度为(24±1)℃。继代
时 , 用吸管从三角瓶中层吸取少量培养液在显微镜下观察 。观察愈伤组织细胞的分散程度及
细胞形状的变化 。培养 28 d后 , 用血球板计数器统计细胞密度。
2　结果与分析
2.1　外源激素对杂交酸模子叶愈伤组织形成的影响
外植体在暗室中培养大约 7 d后 , 可以观察到子叶切口出现膨大并产生肉眼可见的愈伤
组织。经 28 d培养后 , 整个外植体愈伤化。培养基中激素组合处理对愈伤组织始愈期 、诱
导率及生长速度影响很大(表 1)。对愈伤组织诱导率进行方差分析(表 2)及多重比较(表 3),
结果表明 ,不同处理之间有极显著差异 。
表 1　2 , 4-D和 6-BAP 的组合处理对愈伤组织诱导的影响
处理 激素浓度(mg/ L)
2 , 4-D 6-BAP
外植体数
A B
愈伤块数
A B
平均诱导率(%) 始愈期(d) 愈伤组织类　型
MS1 　　 0 　　1.0 　36 　40 　 0 　 0 　　0 　　- -
MS2 0 2.0 40 40 3 4 8.75 　　14 A
MS3 0.5 0 36 40 23 29 68.20 11 C
MS4 1.0 0 40 40 29 32 76.25 10 C
MS5 1.5 0 36 40 28 34 81.40 8 C
MS6 2.0 0 40 40 36 37 91.25 6 C
MS7 2.5 0 36 40 24 30 70.85 9 C
MS8 3.0 0 40 36 23 21 57.90 10 C
MS9 2.0 0.5 40 36 39 36 98.75 8 B
MS10 2.0 1.0 40 36 39 35 97.35 6 B
MS11 0.5 2.0 40 40 15 19 42.50 9 A
MS12 1.0 2.0 36 40 23 29 68.20 10 A
　注:愈伤组织类型:A 表示愈伤组织为绿色 、结构紧密 、生长缓慢 ,不断增殖;B表示愈伤组织灰白色 ,生长迅速 ,结构松软;
C表示愈伤组织生长快 ,乳白色 ,棉絮状 ,结构松软
从表 1中看出 , 当培养基中只单独添加 1.0 mg/L 6-BAP 时 , 所试材料不能诱导出愈伤
组织 , 并且逐渐褐化死亡。当6-BAP 浓度提高到 2.0 mg/L 时 , 诱导率为 8.75%, 形成的量
很少。单独添加 0.5 mg/ L 2 ,4-D时 , 愈伤组织诱导率可达 68.20%, 浓度提高到 2.0 mg/ L
76 华　北　农　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷
时 , 诱导率可提高到 91.25%。2 ,4-D浓度超过 2.0 mg/L 时愈伤组织诱导率则呈下降趋势 。
2 , 4-D配合使用 6-BAP 时 , 愈伤组织诱导率由 91.25%(附加 2 ,4-D 2.0 mg/ L)提高到
97.35%(附加 2 ,4-D 2.0 mg/ L+6-BAP 1.0 mg/ L)和 98.75%(附加 2 ,4-D 2.0 mg/ L+6-BAP
0.5mg/L),体现出激素的增效作用 。
表 2　愈伤组织诱导率的方差分析
变异来源 自由度 平方和 均方 F F0.01
处理 11 13 390.760 2 1 217.342 109.09＊＊ 4.22
误差 12 133.912 1 11.159
总变异 23 13 524.672 3
　　将 A 、 B 、 C 型愈伤组织分别接
种在 MS +6-BAP 0.5 mg/L 培养基
中诱导分化。A型愈伤组织早期不定
芽为一绿色芽点 , 芽点进一步发育成
叶片 。B 型愈伤组织接种 40 d 后 ,
表面形成绿色芽点 , 但经长时间的继
代培养 , 芽点始终不能分化成芽 。C
型愈伤组织接种后始终形成不了芽
点 , 褐化现象严重。比较 3种愈伤组
织成芽率 , A 型愈伤组织易分化出
芽。
表 3　愈伤组织诱导率差异的多重比较
处理 愈伤组织诱导率的平均反正弦值
差异显著性
5% 1%
MS9 85.45 a A
MS10 80.64 a AB
MS6 72.84 b B
MS5 64.55 c C
MS4 60.90 cd C
MS7 57.38 cd CD
MS12 55.72 de CD
MS3 55.72 de CD
MS8 49.55 e DE
MS11 40.67 f E
MS2 17.17 g F
MS1 0 　 h G
　
注:A.B型愈伤组织分离出的圆形细胞;B.C型愈伤组织分离出的长型细胞;C.B型愈伤组织分离出的单细胞的分裂;D.B
型愈伤组织分离出的单细胞分裂形成细胞团
图 1　愈伤组织的悬浮培养
2.2　悬浮培养
对 3种类型愈伤组织同时进行悬浮培养 。在第 1 次继代时进行镜检 , 发现 A 型愈伤组
773期　　　　　　　　　杨起简等:鲁梅克斯 K-1杂交酸模愈伤组织诱导及细胞悬浮系的建立
织由于过于坚硬致密 , 很难分离成单细胞。B型愈伤组织大部分分离成单细胞 , 细胞形状为
圆形(图 1-A)。C 型愈伤组织大部分分离成长型细胞(图 1-B)。在第 2次继代时 , 观察到
B类愈伤组织分离出的许多单细胞正进行分裂(图 1-C),经过几次继代后 , 单细胞已经分裂
形成细胞团(图 1-D)。C类愈伤组织经过几次继代后只有极少数能够进行 1 ～ 2次横段式分
裂 , 并不能形成细胞团。培养结果表明 , B型愈伤组织为建立细胞悬浮系的良好材料 。28 d
后细胞密度达到 3.9×104 个/mL , 从 30 d起 , 将肉眼可见的小细胞团转入改良 MS 培养基
进行看护培养 , 细胞增殖速度较快 , 更换新鲜分化培养基后 , 部分细胞产生次生愈伤组织并
分化出胚状体。
3　讨论
外植体诱导出的愈伤组织在形态结构上的不同已有人作了大量报道 , 宣朴等〔4〕在对皇
竹草进行组织培养研究中发现 , 由腋芽切段形成愈伤组织分为乳白致密型和水浸疏松型两
类。危晓薇等〔5〕在对紫花苜蓿子叶进行组织培养时发现 , 愈伤组织一类为淡黄色絮状 , 另
一类为淡黄和绿色相嵌 , 有绿色颗粒。张德炎等〔6〕在对巴东红三叶叶片愈伤组织诱导时发
现愈伤组织分为 3 类 , 一类为淡黄色 、 松软易碎 、 颗粒结构 , 一类为淡黄至黄色 、结构致
密 , 另一类为乳白色 、浆糊状 、无颗粒结构;而白三叶诱导的愈伤组织分为 2类 , 一类为淡
紫色 、松散易碎 、颗粒结构 , 另一类为淡黄色至黄色 , 结构紧密。本试验表明 , 杂交酸模的
愈伤组织可分为 3种类型 。其原因主要是外源激素的种类 、浓度的配比不同造成的 。单独使
用生长素或与低浓度细胞分裂素配合使用 , 易产生疏松型愈伤组织 。相反 , 高浓度细胞分裂
素或与低浓度生长素配合 , 则有利于致密型愈伤组织的形成。只有致密型愈伤组织有利于诱
导器官的发生。植株子叶所形成的绿色致密的愈伤组织在适宜的分化培养基中能够分化出根
和芽 , 把这类愈伤组织称为器官发生型愈伤组织〔7〕 。但如果要进行悬浮培养就应选择结构
疏松的愈伤组织 , 稍经机械振荡 , 即可使组织分散成单细胞或少数几个小细胞团。而致密的
愈伤组织中的细胞被果胶质紧紧地粘着 , 往往不能形成良好的悬浮培养体系。一个成功的悬
浮培养体系必须满足 3个基本条件:一是悬浮培养物分散性良好 , 细胞团较小;二是均一性
好 , 细胞形状和细胞团大小大致相同;三是生长迅速 。因此 , 不同目的的试验研究 , 除了应
注意愈伤组织的生长量外 , 更重要的一点是不可忽视愈伤组织的形态特征 。
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78 华　北　农　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　17卷
Study on Callus Induction and Cell Suspension Line of
Hybrid Sour Dock cv.Rumex K-1
YANG Qi-jian1 ,ZHOU He2 ,YU Tong-quan1 , ZHANG Lei1
(1.Department of Agronomy , Beijing Ag ricultural College , Beijing　102206 , China;
2.I nstitute of G rassland Science , China Ag ricultural University , Beijing　100094 , China)
Abstract:This paper studied the ef fects of different hormone combinations and concentrations on
callus induction hybrid sour dock cv.Rumex K-1.The experimental results showed that the in-
duced rate of callus w as the best by MS medium supplemented w ith 2 ,4-D and 6-BAP.The mono-
cells w ere cultured in MS liquid medium supplemented with 1.0 mg/L 2 , 4-D was appropriate.
After some times of culture , the cells suspension culture w as set up.
Key words:Hybrid sour dock cv.Rumex K-1;Coty ledon;Callus induction;Suspension culture
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