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繁、推”一体化种子企业合作，组建大型专业制种公
司。同时加大对大型专业化玉米制种企业的扶持力
度，支持有能力的企业建立种子加工中心，迅速提升玉
米种子脱水、脱粒和精选的能力和水平。
3． 3 完善化解制种自然风险的技术体系
建议组织有关专家和制种企业共同研究完善化解
新疆玉米制种自然风险的技术体系。(1)科学规划。
新疆地域辽阔，各地无霜期、积温、水资源、干热风等自
然因素差异大，制种基地必须通盘考虑、科学规划，切
记盲目发展。(2)完善风险防范技术体系。针对不同
玉米制种基地制种潜在风险，建立自交系、杂交组合的
制种安全评估技术体系，从源头降低制种风险。(3)
从亲本生产、机械化制种、干燥、精深加工等方面建立
完善的玉米制种技术示范基地。
3． 4 大力提升种子管理站的监管和服务能力
兵团基层种子站管理存在手段落后、服务能力差，
经费和编制不足等问题，建议兵团及各师按照中央 8
号文件的要求，切实强化师级种子管理的机构职能，加
大种子管理工作经费投入，强化种子业务技术培训，提
升种子管理机构人员的技术水平和服务意识。兵团在
2014 年制定了“新疆兵团玉米制种基地管理办法”，应
进一步学习兄弟省市的制种基地管理经验，贯彻落实
“新疆兵团玉米制种基地管理办法”，加强制种基地的
管理，培育一个健康充满活力的种子市场和制种环境，
吸引更多的企业前来制种和合作，促进兵团玉米制种
产业健康快速的发展。
收稿日期:2014 － 06 － 29
作者简介:夏江勇(1991 －) ，男，湖南人;本科生。
通信作者:刘海学(1965 －) ，男，内蒙古通辽市人;研究员，主要从事生
物化学与分子生物学研究;E-mail:liuhaixue715@ 126． com。
向日葵种子蛋白双向电泳技术体系建立的初步研究
夏江勇， 吕 潇， 张晓倩， 刘 洋， 刘海学
(天津农学院， 天津 300384)
A Preliminary Study on Two-dimentional Electrophoresitic
Technology System for Sunflower Seed Protein
XIA Jiang-yong，L Xiao，ZHANG Xiao-qian，LIU Yang，LIU Hai-xue
摘要:以向日葵种子作为实验材料，对双向电泳各个环节条件
进行了比较选择。结果表明:采用上海生工试剂盒提取植物蛋
白，结合使用 pH 3 ～ 10 的 11 cm IPG胶条，上样量为 1 mg，凝胶
浓度为 10%，用改良的考马斯亮蓝法染色，可分离到 130 个蛋
白质点。初步建立了一套适用于向日葵种子蛋白质组分析的
双向电泳技术体系。
关键词: 双向电泳;向日葵;蛋白提取;蛋白质组学
中图分类号: S 565． 5 文献标志码: A
文章编号: 1001 － 4705(2014)12-0094-04
向日葵(H． annuus L．)为世界四大油料作物之
一，约自明朝传入我国。向日葵子实体含油量为
48% ～55%，富含不饱和脂肪酸 85% ～ 91%，其中含
亚油酸 65%、油酸 23%，是一种极富保健作用的食用
油［1］。向日葵种子是优质食用油和优质蛋白质的重
要来源之一，它含有球蛋白、清蛋白和油脂体蛋白等丰
富的蛋白质［2］。向日葵不仅是世界重要油料作物，也
是我国新疆、内蒙古、甘肃等北方省区的主要油料作
物，在未来能源开发和种植结构调整过程中具有重要
经济意义［3］。蛋白质组学(Proteomics)一词是由澳大
利亚学者威尔金斯和威廉姆 1994 年在意大利召开的
一次科学会议上首次提出［4］。蛋白质组学相关技术
现已成为后基因组时代关键发展技术，全世界科学家
都在争相发展和利用该技术，其中，双向电泳技术是蛋
白质组学研究中至关重要的一项技术，但因多方面原
因一直是蛋白质组学技术发展的瓶颈。本实验旨在以
向日葵种子为实验材料，初步建立蛋白质双向电泳体
系，为后期开展不同植物间蛋白质组图谱比较、荧光差
异蛋白电泳、逆境处理蛋白质组变化等相关研究打下
基础。
1 材料与方法
1． 1 材 料
实验材料为向日葵种子、大豆种子、水稻种子，由
天津农学院农业分析实验教学示范中心保存。
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第 33 卷 第 12 期 2014 年 12 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 12 Dec． 2014
DOI:10.16590/j.cnki.1001-4705.2014.12.061
1． 2 方 法
1． 2． 1 蛋白提取
试验了三氯乙酸 /丙酮沉淀法和酚提取法［5］、改
良水提取法和有机溶剂提取法［6］，另外还试验了试剂
盒提取方法，其中包括南京凯基生物科技发展有限公
司和上海生物化工科技发展有限公司(简称生工)植
物蛋白提取试剂盒。试验结果表明，生工试剂盒提取
效果较好，其他方法存在样品用量大、提取杂质多、溶
解特别困难等问题。用生工试剂盒提取蛋白的具体步
骤是取 100 mg向日葵种子，约取尖端 3 mm，用研钵研
碎，然后按试剂盒操作步骤操作，最后加入1 mL水化液，
漩涡震荡使沉淀悬浮，4 ℃过夜溶解。为验证该方法对
其他植物种子蛋白的提取效果，还用该方法提取了 100
mg大豆种子和水稻种子的全蛋白，并进行了初步比较。
1． 2． 2 蛋白定量
采用紫外吸收 A280法和 SDS-PAGE 单向电泳检测
相结合，以期得到准确的蛋白含量测定结果，避免出现
因样品中存在干扰物质导致仪器检测错误的现象。在
这里使用了 Thermo 公司的蛋白质微量测定仪，取
1． 5 μL样品进行测定。单向电泳方法体系采用张云
贵等［7］的方法，上样量为 10 μL，最后采用的染色方法
和双向电泳染色方法一致［9］。
1． 2． 3 双向电泳
(1)水化:采取水化上样，选择 pH 值为线性
3 ～ 10 的11 cm胶条，IPG buffer 的含量为 0． 5%，上样
体积为 200 μL，放置 Immobiline Dry Strip 泡胀盘中过
夜水化，第 2 天开始第一向等电聚焦，保证水化时间在
10 ～ 16 h之间。
(2)一向:等电聚焦程序参照 GE公司操作手册［8］
进行，并稍作改动，改为 100 V 保持 0． 5 h，500 V 保持
1 h，1 000 V 梯度升压 1 h，6 000 V 梯度升压 2 h，
6 000 V保持 0． 5 h。
(3)平衡:平衡时间为 15 min，先在加入 DTT的平
衡液Ⅰ中浸泡 15 min，同时水平摇晃，后立即在加入
IAM的平衡液Ⅱ中浸泡 15 min，同时水平摇晃。其中
平衡液用中号平皿盛放。
(4)二向:二向胶采用的是浓度为 10%的聚丙烯
酰胺胶，厚度为 1 mm，将一向胶条放至二向胶面后，迅
速加入含有溴酚蓝的琼脂糖溶液封顶。二向电泳参数
为先 10 mA 1 h，后 20 mA电泳至溴酚蓝跑到底部。
(5)染色:采用 Giovanni Candiano 等［9］创制的染
色方法，同时在此方法上简化:染色配方不变，先染色
过夜，后脱色 6 ～ 8 h。其中，染色液配方为磷酸浓度为
10%，硫酸铵浓度为 10%，G-250 考马斯亮蓝的浓度为
0． 12%，甲醇浓度为 20%，脱色液为超纯水。
(6)扫描:扫描采用的是 Imagescanner 扫描仪扫描
后，调整对比度，观察胶图情况使背景和蛋白点的对比
度处于最佳状态，为后期进行蛋白点的分析提供便利。
(7)分析:采用 Image Master 2 Dplatinum 5． 0 分析
软件进行分析，其中参数设定:光滑度为 5，最小区域
值为 5，显著度为 10，先自动检测所有蛋白点，后手动
剔除错误识别的蛋白点。
2 结果与讨论
2． 1 向日葵种子蛋白与其他种子蛋白含量测定结果
比较
由表 1 可以看出，用上海生工试剂盒法提取的蛋
白样品浓度较高，并且杂质较少，一般当 A260 /A280值偏
低时说明蛋白样品所含核酸等杂质较少。其中向日葵
种子取的是种子尖端，去除了含油脂较多的子叶部分，
所以得到的蛋白纯度较高。在蛋白样品制备过程中，
蛋白的复溶是很关键也是当前仍未得到有效解决的难
题，当蛋白质经丙酮或甲醇等有机溶剂萃取后，蛋白质
表面的水化层遭到破坏，所以很难再溶，一般用漩涡震
荡、超声处理、微波处理、枪头搅拌等机械方法促进溶
解，但这些方法的过分使用都有对蛋白结构产生破坏
的可能，另外，对一些难溶性蛋白可以采取提高尿素等
盐的浓度来促进溶解，但是盐浓度过高易导致后面等
电聚焦的失败，所以每种方式的选择都存在利弊，需要
根据实际情况多次摸索找到合适溶解方案。
因溶解蛋白样品的水化液中含有尿素等干扰蛋白
样品含量测定，直接用紫外吸收 A280法测定会出现假
阳性结果，前期实验时，常出现机器测定结果含量较高
的现象，但是双向电泳分离后，图像没有任何点的痕
迹，图 1 就是其中一例。所以在建立双向电泳技术体
系之初，仅仅靠机器检测蛋白含量是不够的，需和
SDS-PAGE单向电泳检测结合起来才能确保样品蛋白
含量足够并且杂质较少。
由图 2 可以看出，向日葵种子蛋白条带有 11 条，
其中最亮的 2 条条带分布在 43 000 ～ 31 000 Da 和
20 100 ～ 14 400 Da 之间，标准蛋白每条带的含量约为
2 μg，从亮度进行估计，向日葵种子的含量达到机器测
定的预定值，并且没有拖尾现象和严重的背景干扰，说
明提取的蛋白纯度较高。在此次蛋白单向电泳中，大豆
蛋白有 12条带，比向日葵要多，并且亮度也比向日葵要
亮，水稻蛋白有 8 条带，比向日葵要少，亮度也更弱，说
明同样质量种子样品中大豆蛋白含量比向日葵要多，向
日葵种子比水稻种子要多。除此之外，该蛋白提取方法
不仅适合向日葵、大豆和水稻等蛋白的提取，还适用于
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问题探讨 夏江勇 等:向日葵种子蛋白双向电泳技术体系建立的初步研究
其它植物蛋白的提取，这为后期进行多种植物间蛋白质
组的比较研究打下技术基础。
表 1 向日葵种子蛋白与其他种子蛋白含量测定结果
样品
测定项目
浓度(μ g /μ L) A260 /A280
向日葵种子 13． 359 0． 53
大豆种子 6． 382 1． 10
水稻种子 39． 221 1． 21
图 1 向日葵样品中蛋白含量不足时得到的双向电泳图
(A为向日葵种子，B为大豆种子，C为水稻种子)
图 2 向日葵种子和其他种子蛋白单向电泳检测结果
2． 2 不同上样量获得的双向电泳结果的比较
由图 3 可看出，虽然图谱上存在少量瑕疵，但是蛋
白点清晰可见，并且为数不少，这已基本达到向日葵种
子蛋白分离效果。另外，通过上样量是 1 mg(图 3)，与
上样量是 2 mg(图 4)蛋白质双向电泳图相互比较可
知，上样量的多少会直接影响向日葵蛋白点的获取，当
上样量过大时，会导致高丰度蛋白将其他蛋白覆盖，从
而使胶图呈现一片蓝色而达不到分辨效果，当上样量
过小时，又会导致低丰度蛋白丢失。因此，在进行双向
电泳实验过程中，每个环节都是决定最终结果好坏的
关键因素，所以做好每个环节的优化都是很重要的。
一般地，蛋白点数多、背景少、点不拖尾、分辨率高、重
复性高的二向图谱是较优图谱，另外为了得到差异蛋
白点，选择合适的胶条长度和 pH 值以得到特异蛋白
点的图谱也是非常重要的，这些都取决于实验者不同
的要求，但是不管需要得到怎样的图谱，都要求实验者
具有丰富的操作经验和细心的实验态度，只有这样才
能保证实验的成功进行。
图 3 上样量为 1 mg的向日葵种子的双向电泳图
图 4 上样量为 2 mg的向日葵种子的双向电泳图
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第 33 卷 第 12 期 2014 年 12 月 种 子 (Seed) Vol． 33 No． 12 Dec． 2014
图 5 上样量为 1 mg的向日葵双向电泳图谱经 Image Master 2 Dplatinum 5． 0 软件分析后得到的三维 2-DE图
2． 3 上样量为 1 mg的向日葵双向电泳图谱软件分析
结果
通过自动检测和手动剔除，共得出 130 个蛋白质
点。由图 5 可以看出，在低分子量区存在较多高丰度
蛋白，虽然在高分子量区也存在一些高丰度蛋白，但这
些高丰度的蛋白点却不易分辨。在偏碱性区不存在高
分子量蛋白，大部分蛋白都分布在 pH = 7 左右，说明
大部分蛋白为中性蛋白。从向日葵种子双向电泳图中
选取 4 个点做三维展示(图 5)，可以直观地看出各个
点的含量或者强度差异。据 Herbert 等［6］实验研究可
知，挖取的向日葵种子双向电泳凝胶中的相关蛋白点
进行质谱分析后得到的蛋白是脱水蛋白、白蛋白、种子
贮藏蛋白、胞质磷酸甘油酸激酶等。其中，脱水蛋白参
与脱水或者低温环境压力下的应答，白蛋白参与细胞
运输，种子贮藏蛋白被认为是主要的贮藏蛋白，胞质磷
酸甘油酸激酶参与能量代谢过程，特别是碳水化合物
代谢。
3 结 论
本实验主要以向日葵种子为材料，研究了植物全
蛋白的提取方法。上海生工试剂盒提取能得到较优结
果，然后结合紫外吸收 A280法和单向电泳法检测蛋白
含量，最后经初步的双向电泳分析，共得到 130 个清晰
的蛋白质点，这为后期进一步研究向日葵蛋白质组学
打下了基础。
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问题探讨 夏江勇 等:向日葵种子蛋白双向电泳技术体系建立的初步研究