全 文 ：　　　收稿日期:2004-7-14;修回日期:2004-08-17
作者简介:王　创(1983-),在读本科生;通讯作者:何绍江 ,男 ,教授。
基金项目:中国自然科学基金(30070027)和华中农业大学 SRF项目资助
用 gfp 基因检测饭豆根瘤菌的侵染途径和定殖动态
王　创 ,郑慧芬 ,何绍江 ,石迪萌 ,冯　娜 ,张　薇 ,陶雪莹
(华中农业大学生命科学技术学院 ,武汉　430070)
摘　要:将绿色荧光蛋白基因转入饭豆根瘤菌 JMC1402 后 ,与AMF(Arbuscular Mycorrhizal Fungi)共同接种饭豆 ,分别用砂
培和土培检测饭豆根瘤菌的侵染途径和定殖动态 , 并与单接饭豆根瘤菌比较。结果表明 , 饭豆根瘤菌先吸附在根表 ,
然后从卷曲的根毛侵入。AMF能促进饭豆根瘤菌在根内定殖 ,抑制饭豆根瘤菌在根表定殖 。
关键词:饭豆根瘤菌;侵染途径;AMF;定殖动态
中图分类号:Q789 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2004)06-0014-03
1　研究意义
饭豆(Vigna umbellata L.)是一种营养丰富的豆类
作物 ,在食品 、饲料等领域有着广泛的用途。此外 ,饭
豆还具有耐旱性 ,耐脊性 ,生长期短和对土壤选择性
不高等特点 ,是一类尚待开发的豆科作物 。为促进饭
豆的开发和应用 ,我们进行了饭豆根瘤菌和 AMF 接
种饭豆的研究。用 gif 基因标记饭豆根瘤菌研究了其
侵染途径和定殖动态以及 AMF 对饭豆根瘤菌定殖的
影响 。
2　材料和方法
2.1　材料
2.1.1　饭豆种子:湖北汉川白蔓豆 。
2.1.2　AMF:Glomus mossae 摩西球孢囊霉 ,由北京农
林科学院张美庆研究员提供。
2.1.3　饭豆根瘤菌 JMC1420P:带 gfp基因标记 ,由郑
慧芬标记 。
2.1.4　培养基
2.1.4.1　YMA培养基
甘露醇 10g;K2HPO40.5g;酵母膏 1g;MgSO4·7H2O
0.2g;NaCl 0.1g;CaCl2·6H2O 0.1g;Rh微量元素液 4ml
(Rh微量元素液配方:H3BO3 5g ,Na2MnO45g ,加 dH20至
1000mL);调 pH6.8 ～ 7.0;卡那霉素 50μg/mL培养基 。
2.1.4.2　Fahraeus植物无氮营养液
CaCl2·2H2O 0.1g;MgSO4 ·7H2O 0.12g;KH2PO4
0.1g;Na2HPO4·12H2O 0.15g;柠檬酸铁 5mg;Gibson 微
量元素液 1mL(Gibson 微量元素液配方:H3BO3 2.86g;
ZnSO4·7H2O 0.22g;MnSO4·4H2O 2.03g;Na2MOO4·2H2O
0.126g;CuSO4·5H2O 0.08g 加 dH2O 至 1000mL);dH2O
1000mL ,调 pH6.5 ～ 7.0。
2.2　方法
2.2.1　饭豆根瘤菌侵染位点和侵染途径的观察
2.2.1.1　样本的准备　用(40cm×26cm×6.5cm)的
塑料盘进行无菌砂培 ,做单接根瘤菌和双接根瘤菌+
AMF两种处理。
2.2.1.2　取样镜检:从接种根瘤菌第一天开始 ,将单
接和双接样本每天分别取苗 3棵 ,用荧光显微镜观察
根瘤菌在饭豆根表的侵染情况(gfp 基因标记的饭豆
根瘤菌 JMC1402P经紫外线激发后发绿色荧光)。
2.2.2　饭豆根瘤菌 JMC1402P在饭豆根部的定殖动态。
2.2.2.1　砂培试验
用容量为 300mL的塑料杯装河砂灭菌后进行杯
栽试验 ,试验设 2个处理;
A单接:单接饭豆根瘤菌 JMC1402P。
B双接:接种饭豆根瘤菌 JMC1402P+AMF孢子土。
2.2.2.1.1　饭豆种子的准备:选饱满的饭豆种子 ,蒸
馏水洗净 ,75%的酒精浸泡 5min ,水洗 3次(每次浸泡
10min),再用 3%～ 4%次氯酸钠浸泡 5min ,然后用无
菌水冲洗干净 ,置于无菌平板上 , 28℃下暗室催芽。
2.2.2.1.2　栽培砂杯准备:将塑料杯底打一小洞 ,穿
上一纱布条 ,砂用 3%HC1浸泡一周 ,反复冲洗至无氯
离子 ,装入 300mL塑料杯中 ,杯口用牛皮纸封好 ,装在
空罐头瓶中灭菌。
2.2.2.1.3　播种:将催好芽的饭豆播种到灭菌砂杯
中 ,并在罐头瓶内加入 Fahraeus营养液。
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2.2.2.1.4　接种:播种第三天将在 YMA 培养液中培
养48h的 JMC1402P菌液用微量取样器接种到饭豆根
部 ,1mL/株(108个细菌),双接种的每杯另加 AMF 孢
子土 10g 。
2.2.2.1.5　测数:自饭豆接种之日起 ,分别在 3 、5 、7 、
9 、11 、13 、15 、17 、20 、23 、30 、35 、40天取样测数 。具体方
法为:在无菌条件下 ,用镊子取出 3 株饭豆苗 ,剪下
根 ,去掉根上的根瘤 , 放入带无菌玻璃珠的装有
100mL无菌水的三角瓶中 ,震荡 10min ,将样品悬液 10
倍稀释到 10-5 ,取 10-3 ～ 10-5稀释度的菌悬液涂在
加有卡那霉素的 YMA 平板上。取出震荡过的根 ,以
无菌水将根洗 2 ～ 3次 ,再表面灭菌 ,无菌水洗 3 ～ 5
次。用无菌研钵将根磨成匀浆后 10倍稀释至 10-5 ,
取10-3 ～ -5稀释度的菌悬液涂在加有卡那霉素的
YMA平板上。将涂好的平板置于 28℃恒温培养 5 ～ 7
天 ,在紫外灯下计数发光菌落 。
2.2.2.2　土培试验
实验设2个处理:
A单接:单接饭豆根瘤菌 JMC1402P
B双接:接种饭豆根瘤菌 JMC1402P+AMF孢子土
2.2.2.2.1　饭豆种子的准备(同 2.2.2.1.1)
2.2.2.2.2　栽培土杯的准备:将塑料杯底打一小洞 ,
穿上一纱布条 ,栽培土用狮子山的棕黄壤 ,土取回后
晒干 ,捶细 ,过 40目筛 ,装入 300mL的塑料杯中 ,加 1:
1的水浸湿 ,杯口封上牛皮纸 ,放在一罐头瓶中灭菌。
2.2.2.2.3　播种(同 2.2.2.1.3)
2.2.2.2.4　接种(同 2.2.2.1.4)
2.2.2.2.5　测数:自饭豆接种之日起 , 分别在 3 、7 、
10 、14 、21 、28 、35 、42 、49 、56天取样测数 。具体方法同
2.2.2.1.5
3　结果分析
3.1　饭豆根瘤菌侵染位点和侵染途径
将接种 JMC1402P 饭豆的根毛制水浸片 ,用荧光
显微镜观察 ,发现标记菌株首先吸附在根毛上 ,然后
通过卷曲的根毛侵入根内形成根瘤(见图1 ,图 2)。
图 1　JMC1402P 吸附在饭豆根表
图 2　JMC1402P侵入卷曲的根毛
观察结果表明 ,双接种处理 3天时可在饭豆根毛
表面观察到 JMC1402P 的绿色荧光菌体 , 7天后可在
根内看到绿色荧光菌团 。而单接种处理 7天时才可
以在饭豆根毛表面观察到 JMC1402P 的绿色荧光菌
体 ,且数量较双接体系少。
3.2　无菌砂培下根瘤菌 JMC1402P 在饭豆根表 、根内
的定殖动态
无菌砂培下根瘤菌 JMC1402P 在饭豆根表 、根内
的定殖动态见图 3。
图 3　无菌砂培下根瘤菌 JMC1402P在饭豆根内 、根表的定殖动态
由图 3可见 ,在无菌砂培条件下 ,根瘤菌在根表
定殖的数量是单接种根瘤菌的处理高于双接种根瘤
菌+AMF的处理 ,出现这种结果是由于双接种处理中
两种微生物在饭豆根表都要竞争生态位所致。由图3
的曲线还可看出 ,根瘤菌在饭豆根内的定殖数量是双
接种根瘤菌+AMF 的处理明显高于单接种根瘤菌的
处理 。说明菌根真菌对于根瘤菌侵入饭豆根内有促
进作用。15天以后饭豆根表 、根内都无法检测到根瘤
菌 ,这与砂培缺少根瘤菌生长所需要的生长因子有
关。
3.3　无菌土培下根瘤菌 JMC1402P 在饭豆根表 、根内
的定殖动态
3.3.1　在无菌土培条件下 ,根瘤菌 JMC1402P 在饭豆
根内的定殖动态见图 4。
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由图 4 可见 ,无菌土培下 ,在双接种根瘤菌 +
AMF 处理中 , JMC1402P 在根内的定殖数量高于单接
种根瘤菌 , 说明菌根真菌能促进根瘤菌侵入植物根
内 ,这与无菌砂培结果一致。45天后根内检测不到根
瘤菌 JMC1402P。
3.3.2　在无菌土培条件下 ,根瘤菌 JMC1402P 在饭豆
根表的定殖动态见图 5。
图 5　无菌土培下根瘤菌 JMC1402P在饭豆根表的定殖动态
由图 5可见 ,饭豆根瘤菌在根表的定殖动态随着
时间的延长呈下降趋势 ,12天以前 ,双接种的定殖数
量高于单接种 , 12天以后 ,双接种的定殖数量低于单
接种 。出现这种情况的原因可能是:双接种处理中 ,
在早期 ,AMF的菌丝生长可带动 JMC1402P 向根表迁
移 ,而当两种微生物迁移到根表后 ,由于两种微生物
都要在饭豆根表竞争生存空间导致双接种处理根表
根瘤菌没有单接根瘤菌处理高 。
4　讨论
4.1　本研究结果表明 ,根瘤菌侵染饭豆形成根瘤时先
吸附在根表 ,然后从卷曲的根毛侵入。
4.2　利用 gfp 基因检测饭豆根瘤菌在饭豆根部的定
殖动态 ,具有直观快速的优点。不像 lux 基因和 gus
基因需要显色剂显色。
4.3　AMF 对于根瘤菌在饭豆根内的定殖有促进作
用。而对根瘤菌在根表的定殖有抑制作用 ,这可能是
由于两种微生物都要在根表竞争生存空间所致 。
参考文献
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Detecting the colonization and infection pathway
of Rhizobiumin rice bean by gfp gene
WANG Chuang ,ZHENG Hui_fen ,HE Shao_jiang ,FENG Na ,SHI Di_meng ,
ZHANG Wei ,TAO Xue_ying
(Huazhong Agricultural University ,Wuhan ,430070 , Hubei ,China)
Abstract:Rhizobium sp.JMC1402P firstly attracted on the surface of ricebean root , then intruded into root from root_
hair.Rhizobium sp.JMC1402P was co_inoculated with AMF(Arbuscular Mycorhizal Fungi)in ricebean.The colonization of
Rhizobium in ricebeans which were planted both in sand and soil were detected.The result from single_inoculation and co_
inoculation treatment showed that AMF could accelerate the Rhizobium s colonization in the root of ricebean and restrict the
colonization on the surface of ricebean root.
Key word:Rhizobium ,AMF , colonization , infection pathway
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