全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(２): １８８￣１９４(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣１２￣３０ꎻ 修回日期: ２０１３￣１２￣０８
基金项目: 国家公益性行业(农业)科研专项(２０１００３０３１)ꎻ国家自然科学基金重点项目(３１１３０４４)ꎻ福建省杰出青年科学基金项目
(２０１１Ｊ０６００８)ꎻ教育部高等学校博士学科点专项科研基金(２０１１３５１５１３０００２)
通讯作者: 谢联辉ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻＴｅｌ: ０５９１－８３６２８９８９ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｆｊｘｌｈ＠１２６.ｃｏｍ
魏太云ꎬ教授ꎬ主要从事植物病毒的虫传机理研究ꎻＴｅｌ: ０５９１－８３７８９２７０ꎬＥ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｔａｉｙｕｎ＠ ｆｊａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
第一作者: 贾东升ꎬ男ꎬ山西长治人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事植物病毒的虫传机理研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｊｉａｄｏｎｇｓｈｅｎｇ２００４＠１６３.ｃｏｍꎮ
水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的
侵染和扩散过程
贾东升ꎬ 马元元ꎬ 杜 雪ꎬ 陈红燕ꎬ 谢联辉∗ꎬ 魏太云∗
(福建省植物病毒学重点实验室ꎬ福建农林大学植物病毒研究所ꎬ福州 ３５０００２)
摘要:水稻黑条矮缩病毒 (Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬ ＲＢＳＤＶ) 由介体灰飞虱(Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ Ｆａｌｌéｎ)以持久增
殖型方式传播ꎬ其编码的 Ｐ９￣１蛋白是形成病毒复制和子代病毒粒体装配的场所—病毒原质(ｖｉｒｏｐｌａｓｍ)的组分之一ꎮ 为了
明确 ＲＢＳＤＶ在介体昆虫体内的侵染循回过程ꎬ本研究通过原核表达的 Ｐ９￣１蛋白免疫注射兔子制备 Ｐ９￣１抗体ꎬ应用免疫
荧光标记技术研究 Ｐ９￣１在饲毒后不同时期的介体灰飞虱体内的定位ꎮ 共聚焦显微镜观察到饲毒后 ３ ｄꎬＰ９￣１出现在介体
中肠的少数上皮细胞内ꎻ饲毒后 ６ ｄꎬ在中肠外表的肌肉细胞分布有 Ｐ９￣１ꎻ饲毒后 １０ ｄꎬＰ９￣１分布于中肠和后肠表面的肌肉ꎬ
同时在唾液腺也能观察到 Ｐ９￣１的存在ꎮ 结果表明 ＲＢＳＤＶ在介体灰飞虱体内首先侵染中肠上皮细胞并复制ꎬ随后扩散到
中肠表面的肌肉细胞ꎬ并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后肠ꎬ最后扩散到唾液腺ꎮ 本研究首次直观地阐述了 ＲＢＳＤＶ 在灰
飞虱消化系统的侵染和扩散过程ꎬ为有效阻断灰飞虱携带并传播病毒奠定基础ꎮ
关键词:水稻黑条矮缩病毒ꎻＰ９￣１ꎻ灰飞虱ꎻ侵染途径
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｉｔｓ
ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ ＪＩＡ Ｄｏｎｇ￣ｓｈｅｎｇꎬ ＭＡ Ｙｕａｎ￣ｙｕａｎꎬ ＤＵ Ｘｕｅꎬ ＣＨＥＮ
Ｈｏｎｇ￣ｙａｎꎬ ＸＩＥ Ｌｉａｎ￣ｈｕｉꎬ ＷＥＩ Ｔａｉ￣ｙｕｎ (Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙꎬ
Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｆｕｚｈｏｕ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ (ＲＢＳＤＶ)ꎬ ａ ｆｉｊｉｖｉｒｕｓꎬ ｉｓ ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ
(ＳＢＰＨ) ｉｎ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｐｒｏｐａｇａｔｉｖｅ ｍａｎｎｅｒ. Ｐ９￣１ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｓｅｇｍｅｎｔ ９ ｉｓ ｔｈｅ ｍｉｎｉｍａｌ ｖｉｒａｌ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ
ｖｉｒｏｐｌａｓｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ＲＢＳＤＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｌｕｃｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｒｏｕｔｅ ｏｆ
ＲＢＳＤＶ ｗｉｔｈｉｎ ｉｔｓ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ＳＢＰＨ ａｆｔｅｒ ｖｉｒａｌ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ９￣１ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ. Ｔｈｅｎꎬ
ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ９￣１ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＳＢＰＨｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ＲＢＳＤＶ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕ￣
ｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇｉａｎｓｔ Ｐ９￣１ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ＦＩＴＣ ｄｉｒｅｃｔｌｙ. Ａｔ ３ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ａｃｑｕｒｉｅ ｖｉ￣
ｒｕｓ (ｐ.ａ.ｖ.)ꎬ Ｐ９￣１ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ. Ａｔ ６ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ ｔｏ
ｔｈｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓꎻ ｔｈｅｎ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｈｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ
ａｎｄ ｈｉｎｄｇｕｔ. Ａｔ １０ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ. Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
ＲＢＳＤＶ ｆｉｒｓｔ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍꎬ ｔｈｅｎ ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ
ａｎｄ ｈｉｎｄｇｕｔꎬ ａｎｄ ｆｉｎａｌｌｙ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄｓ. Ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ
ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ＲＢＳＤＶ ｉｎ ｉｔｓ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ＳＢＰＨꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｇｉｖｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ ｆｏｒ ｂｌｏｃ￣
ｋｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ ＲＢＳＤＶ ｂｙ ＳＢＰＨ ｖｅｃｔｏｒ.
２期 贾东升ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎻ Ｐ９￣１ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｓｍａｌｌ ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒꎻ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｒｏｕｔｅ
中图分类号: Ｓ４３２.４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０１８８￣０７
水稻黑条矮缩病毒(Ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ
ｖｉｒｕｓꎬ ＲＢＳＤＶ)属于呼肠孤病毒科(Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ)ꎬ
与玉米粗缩病毒(Ｍａｉｚｅ ｒｏｕｇｈ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓ)、斐济
病毒(Ｆｉｊｉ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ)和南方水稻黑条矮缩病毒
(Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｒｉｃｅ ｂｌａｃｋ￣ｓｔｒｅａｋｅｄ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬ ＳＲＢＳ￣
ＤＶ)等同属于斐济病毒属(Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓ) [ １ꎬ ２]ꎮ ＲＢＳ￣
ＤＶ可以侵染水稻、玉米和小麦等禾本科植物[３ꎬ ４]ꎬ
近年来主要在我国的江苏、浙江等省发生ꎬ给农业
生产带来巨大的威胁[５ꎬ ６]ꎮ ＲＢＳＤＶ在水稻上表现
的症状为叶色浓绿、植株矮小ꎬ茎秆和叶背长有白
色短条瘤状突起ꎬ瘤状突起在发病后期呈黑褐
色[７]ꎮ ＲＢＳＤＶ 主要由介体灰飞虱 ( Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ
ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓꎬ ｆａｌｌｅｎ)以持久增殖型方式传播[８]ꎬ其基
因组由 １０ 条双链 ＲＮＡ 组成ꎬ２００１ 年 Ｚｈａｎｇ 等[９]
首次完成全基因组序列测定ꎬ全基因组一共有 ２９
４１０个碱基ꎬ共编码 ７个结构蛋白和 ６ 个非结构蛋
白ꎮ Ｉｓｏｇａｉ等[１０]通过 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 证明 Ｓ８ 和 Ｓ１０
编码的蛋白分别是病毒粒子的核心衣壳蛋白 Ｐ８和
外层衣壳蛋白 Ｐ１０ꎬ通过免疫电镜观察到 Ｓ７ 片段
编码的 Ｐ７￣１蛋白抗体标记在包裹病毒粒子的管状
结构上ꎮ Ｚｈａｎｇ 等[１１]发现 Ｓ６ 编码的非结构蛋白
Ｐ６有沉默抑制子功能ꎬＷａｎｇ 等[１２]证明 Ｐ６ 可以自
身互作且在植物细胞中形成类似于病毒原质的内
含体ꎬ推测其是病毒原质的组分之一ꎮ
此外对 ＲＢＳＤＶ研究最多的是 Ｓ９ 片段编码的
Ｐ９￣１蛋白的功能ꎬ早在 １９９８ 年 Ｉｓｏｇａｉ等[１０]通过电
镜观察到 Ｐ９￣１ 蛋白是病毒原质( ｖｉｒｏｐｌａｓｍ)的组
分ꎻ随后 Ｚｈａｎｇ等[１３]证明非结构蛋白 Ｐ９－１可以自
身互作并在拟南芥原生质体中表达形成类似于病
毒原质的包含体ꎻＡｋｉｔａ 等[１４]在昆虫细胞 Ｓｆ９ 中也
观察到类似于病毒原质的内含体ꎬ并明确了 Ｐ９￣１
蛋白首先通过疏水区的互作形成二聚体ꎬ再由每个
二聚体的 Ｃ端伸向邻近的二聚体并通过疏水区互
作形成四聚体ꎮ Ｓｈｉｍｉｚｕ 等[１５] 应用 ＲＮＡ 干扰
(ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅꎬ ＲＮＡｉ)原理获得的表达 Ｐ９￣１
基因 ｄｓＲＮＡ转基因水稻可以有效地抑制病毒的侵
染ꎬ证明 Ｐ９￣１蛋白确实与病毒的复制有关ꎮ 这些
研究均表明 Ｐ９￣１ 蛋白是 ＲＢＳＤＶ 的病毒原质组
分ꎬ参与病毒的复制和装配ꎮ 但到目前为止ꎬ关于
ＲＢＳＤＶ在介体灰飞虱体内的复制增殖过程仍不明
确ꎬ本研究通过原核表达的 Ｐ９￣１蛋白制备 Ｐ９￣１蛋
白的多克隆抗体ꎬ随后应用免疫荧光标记技术系统
观察了病毒侵染不同时间 Ｐ９￣１蛋白在灰飞虱体内
的定位ꎬ进一步明确了 ＲＢＳＤＶ Ｐ９￣１ 蛋白在病毒复
制过程中的作用机理ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 病毒与介体灰飞虱
ＲＢＳＤＶ病株采自江苏省建湖县ꎬ隔离种植于本
实验室田间病毒圃ꎮ 灰飞虱成虫采自福建农林大学
水稻育种实验田ꎬ于温室中 ２５℃条件下经过无毒虫筛
选和多代繁殖后饲养在水稻幼苗上ꎮ 将成虫期的灰
飞虱放入健康水稻幼苗上产卵 ３ ｄꎬ１２ ｄ后水稻幼苗
上孵出若虫ꎬ生长到 ２龄的若虫用于饲毒实验ꎮ
１.２ Ｇａｔｅｗａｙ 重组技术构建原核表达载体
根据 ＲＢＳＤＶ 第 ９ 条链的基因序列(ＧｅｎＢａｎｋ
Ｎｏ: ＡＦ５４０９７６.１)ꎬ设计扩增 Ｐ９￣１基因完整开放阅
读框的引物序列(正体)ꎬ引物 ５′端均含有重组序列
(斜 体)ꎬ Ｐ９￣１Ｆ: ５′￣ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡ
ＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧ￣３′ꎻ Ｐ９￣
１Ｆ:５′￣ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡ
ＡＣＧＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧ￣３′ꎮ 以带毒灰飞虱
总 ＲＮＡ为模板ꎬ用 Ｐ９￣１Ｆ / Ｒ引物进行 ＲＴ￣ＰＣＲ获得
目的基因片段ꎮ 参照 Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ
Ｍｉｘ 试剂盒( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)说明ꎬ将目的基因片段重
组到入门载体 ｐＤＯＮＲ２２１ꎮ 构建好的 ｐＤＯＮＲ２２１￣
Ｐ９￣１载体经测序正确后ꎬ用于重组构建表达载体ꎮ
参照 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 试剂盒( Ｉｎ￣
ｖｉｔｒｏｇｅｎ)说明书将 ｐＤＯＮＲ２２１￣Ｐ９￣１ 与目的表达载
体 ｐＤＥＳＴ１７ 进行 ＬＲ 重组反应ꎬ获得原核表达载
体 ｐＤＥＳＴ１７￣Ｐ９￣１ꎮ
１.３ 抗体制备
将 ＲＢＳＤＶ￣Ｐ９￣１ 的原核表达载体 ｐＤＥＳＴ１７￣
Ｐ９￣１转入大肠杆菌 Ｒｏｃｃｅｔａ 菌株ꎬ经 ＩＰＴＧ 诱导表
达目的蛋白ꎮ 通过 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 凝胶电泳后回收目
的蛋白条带ꎬ并用弗氏佐剂研磨ꎬ免疫注射新西兰
９８１
植物病理学报 ４４卷
大白兔的后退肌肉ꎮ 免疫注射 ５ 次ꎬ动脉取血ꎬ获
得 Ｐ９￣１ 蛋白的多克隆抗血清ꎮ 应用 ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ￣
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎ(Ｔｈｅｒｍｏ)提纯抗血清获
得 ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ( ＩｇＧ)ꎬ并按照 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 说
明书将 ＩｇＧ与 ＦＩＴＣ 荧光素( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)交联得到
Ｐ９￣１￣ＦＩＴＣ抗体ꎮ
１.４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测
抓取约 １００ 头人工饲养的 ２ 龄无毒灰飞虱若
虫在 ＲＢＳＤＶ 侵染的拔节期水稻病株上饲毒 ２ ｄꎬ
随后在健康水稻苗上饲养 １２ ｄꎬ整个过程均在
２５℃和 ６０％湿度条件下进行ꎮ 然后将饲喂 ＲＢＳＤＶ
的带毒灰飞虱和未饲毒的无毒灰飞虱总蛋白分别
用 １２％的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 凝胶电泳ꎬ电泳结束后将蛋
白转印到 ＰＶＤＦ 膜(Ｗｈａｔｍａｎ)上ꎬ然后用 ３％的
ＢＳＡ封闭 １ ｈꎬＰＢＳＴ 清洗 ３ 次ꎬ加入制备的 Ｐ９￣１
抗血清于 ３７℃ 孵育 １ ｈꎮ ＰＢＳＴ 清洗 ３ 次ꎬ加入碱
性磷酸酶标记的羊抗兔 ＩｇＧ(Ｓｉｇｍａ)于 ３７℃孵育
１ ｈꎮ ＰＢＳＴ 清洗 ３ 次ꎬ于 ＢＣＩＰ / ＮＢＴ 显色液中进
行显色反应ꎬ１０ ｍｉｎ后即可观察结果ꎮ
〗１.５ 免疫荧光标记
抓取约 ２００头 ２龄的无毒灰飞虱若虫在 ＲＢＳ￣
ＤＶ侵染的拔节期水稻病株上饲毒 ２ ｄꎬ随后在健
康水稻苗上饲养ꎬ整个过程均在 ２５℃和 ６０％湿度
条件下进行ꎮ 在饲毒后的 ３、６、１０、１２ ｄꎬ分别取 ３０
头灰飞虱ꎬ在解剖镜下解剖昆虫的消化系统器官
(包括食道、前憩室、中肠、后肠和唾液腺)ꎮ 免疫
荧光标记参照 Ｃｈｅｎ 等[１６]方法ꎬ首先用 ４％的多聚
甲醛固定消化系统器官 ２ ｈꎬ再用 ２％的 Ｔｒｉｔｏｎ￣１００
渗透 ３０ ｍｉｎꎬ然后用 Ｐ９￣１￣ＦＩＴＣ 抗体和肌动蛋白
(Ａｃｔｉｎ)染料 ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ￣Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)同
时孵育消化系统器官 １ ｈꎬ最后通过共聚焦显微镜
观察 Ｐ９￣１蛋白在介体昆虫体内的定位ꎮ
２ 结果
２.１ Ｐ９￣１蛋白的原核表达
将原核表达载体 ｐＤＥＳＴ１７￣Ｐ９￣１ 转化到大肠
杆菌 Ｒｏｃｃｅｔａ菌株ꎬ挑取阳性菌落摇菌ꎬ菌液经 ０.１
ｍｍｏｌ / Ｌ ＩＰＴＧ诱导后表达目的蛋白ꎮ 离心收集菌
体ꎬ加入上样 ｂｕｆｆｅｒꎬ煮沸 １０ ｍｉｎ 后通过 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ凝胶电泳和考马斯亮蓝染色ꎬ可以在诱导菌
液的菌体中检测到 Ｐ９￣１与 ６×Ｈｉｓ 标签融合表达的
大小约 ４３ ｋＤａ的蛋白ꎬ与预测的蛋白大小相符ꎬ而
未加诱导剂的菌体没有对应的条带(图 １)ꎬ表明
Ｐ９￣１蛋白特异性诱导表达ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ
Ｐ９￣１ ｇｅｎｅ ｏｆ ＲＢＳＤＶ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｂｙ ＩＰＴＧꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ＩＰＴＧ.
２.２ Ｐ９￣１蛋白抗体特异性检测
分别取 ３０头实验室条件下感染 ＲＢＳＤＶ并渡过
循回期的灰飞虱成虫和人工饲养未感染ＲＢＳＤＶ的灰
飞虱成虫ꎬ分别提取总蛋白为样品ꎬ经 １２％的 ＳＤＳ￣
ＰＡＧＥ胶电泳后用制备的 Ｐ９￣１抗血清做Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
检测ꎬ可以检测到带毒虫含有 ３９.９ ｋＤａ 的蛋白条带ꎬ
与预测的 Ｐ９￣１蛋白大小相符ꎬ而未感染 ＲＢＳＤＶ的灰
飞虱中检测不到 Ｐ９￣１蛋白ꎬ表明所制备的抗体具有
特异性ꎬ可用于免疫荧光标记实验(图 ２)ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉ￣
ｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｐ９￣１
Ｌａｎｅ Ｍ: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ＳＢ￣
ＰＨｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＢＳＤＶꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ
ＲＢＳＤＶ￣ｆｒｅｅ ＳＢＰＨｓ.
０９１
２期 贾东升ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程
２.３ Ｐ９￣１蛋白在灰飞虱消化系统的定位
为了研究 ＲＢＳＤＶ 在灰飞虱消化系统的侵染
和扩散过程ꎬ本实验首先用 ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ￣ｒｈｏｄａｍｉｎｅ对
灰飞虱消化系统的 Ａｃｔｉｎ 进行标记(红色)ꎮ 通过
共聚焦显微镜可以观察到灰飞虱消化系统由食道
(ｏｓ)、前憩室(ａｄ)、中肠(ｍｇ)、后肠(ｈｇ)和唾液腺
(ｓｇ)组成ꎮ 其中中肠从内到外分别由肠腔( ｇｌ)、
单层上皮细胞(ｍｅ)、基底膜(ｂｌ)和肠道表面的肌
肉组织(ｖｍ)组成ꎬ在上皮细胞靠近肠腔一侧分布
着大量的微绒毛(ｍｖ)ꎬ而中肠外表的肌肉组织则
由环肌( ｃｉｒｃｕｌａｒ ｍｕｓｃｌｅ)和纵肌( ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ｍｕ￣
ｓｃｌｅ)组成(图 ３￣Ａ)ꎮ
将 ２龄灰飞虱在 ２５℃条件下饲毒 ２ ｄ 后转到
健康水稻幼苗上饲养ꎬ在饲毒后的 ３、６、１０ 和 １２ ｄ
分别解剖 ３０头灰飞虱ꎬ获得的消化系统经过固定、
渗透和抗体孵育ꎬ共聚焦显微镜下观察 Ｐ９￣１ 蛋白
在灰飞虱消化系统的分布ꎬ统计结果如表 １ 所示ꎮ
实验中用 Ｐ９￣１￣ＦＩＴＣ 标记昆虫消化系统中由于病
毒侵染产生的 Ｐ９￣１ 蛋白(绿色)ꎬｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ￣ｒｈｏｄａ￣
ｍｉｎｅ标记组成昆虫消化道的 Ａｃｔｉｎ(红色)ꎮ 灰飞
虱饲毒后 ３ ｄꎬ仅 ３３％的灰飞虱中肠上皮细胞中可
以观察到 Ｐ９￣１ 蛋白的表达ꎮ 由于 Ｐ９￣１ 蛋白是形
成病毒复制场所—病毒原质基质的组分ꎬ因此Ｐ９￣１
蛋白的出现表明病毒已侵入中肠上皮细胞并进行
复制(图 ３￣Ｂ)ꎮ 饲毒后 ６ ｄꎬ在 ４３％的灰飞虱中肠
上皮细胞和中肠表面的肌肉细胞存在 Ｐ９￣１ 蛋白ꎬ
且 １６％的灰飞虱后肠也观察到 Ｐ９￣１蛋白ꎬ表明病
毒在上皮细胞内大量复制并扩散到中肠表面的肌
肉细胞(图 ３￣Ｃ)ꎮ 饲毒后 １０ ｄꎬ４７％的灰飞虱中肠
和后肠表面肌肉细胞能观察到大量的 Ｐ９￣１ 蛋白ꎬ
约 ３４％的唾液腺也有 Ｐ９￣１ 蛋白存在ꎬ同时上皮
细胞内没有观察到Ｐ９￣１蛋白ꎬ表明病毒已经完全
Ｆｉｇ. ３ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ＲＢＳＤＶ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｓｅｃｔ ｖｅｃｔｏｒ ＳＢＰＨｓ
Ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＳＢＰＨｓ ｗｅｒｅ ｓｔａｉｎｅｄ ｆｏｒ Ｐ９￣１ ｗｉｔｈ Ｐ９￣１￣ＦＩＴＣ (ｇｒｅｅｎ) ａｎｄ ｆｏｒ Ａｃｔｉｎ ｗｉｔｈ ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ￣ｒｈｏｄａｍｉｎｅ
( ｒｅｄ) ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ. Ａ: Ｔｈｅ ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ ｃａｎａｌ ｏｆ ＳＢＰＨ. Ｂ: Ａｔ ３ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｉｎ ａ ｆｅｗ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ. Ｃ: Ａｔ ６ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ａ ｆｅｗ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅ
ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ. Ｄ: Ａｔ １０ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｂｕｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｄｇｕｔ ａｎｄ
ｈｉｎｄｇｕｔ. Ｅ: Ａｔ １０ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａ ｆｅｗ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ. Ｆ: Ａｔ １２ ｄａｙｓ ｐ.ａ.ｖ.ꎬ Ｐ９￣１ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ
ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ. ａｄꎬ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌｕｍꎻ ｍｇꎬ ｍｉｄｇｕｔꎻ ｈｇꎬ ｈｉｎｄｇｕｔꎻ ｍｔꎬ ｍａｌｐｉｇｈｉａｎ ｔｕｂｕｌｅｓꎻ ｏｓꎬ
ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓꎻ ｓｇꎬ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ. ｍｅꎬ ｍｉｄｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍꎻ ｍｖꎬ ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅꎻ ｇｌꎬ ｇｕｔ ｌｕｍｅｎ. Ｂａｒｓꎬ ７０ μｍ.
１９１
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ １ Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｐ９￣１ ｉｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＳＢＰＨｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄａｙｓ
ｐｏｓｔ￣ａｃｑｕｒｉｅ ｖｉｒｕｓ ａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
Ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ａｃｑｕｉｒｅ ｖｉｒｕｓ / ｄ
Ｎｕｍｂｅｒ. ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｎｓｅｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｐ９￣１ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ (ｎ＝ ３０)
ｍｅ ｖｍ ｈｇ ｏｓ ａｄ ｓｇ
３ １０ ０ ０ ０ ０ ０
６ １３ １３ ５ ０ ０ ０
１０ ０ １４ １４ １３ １３ １１
１２ ０ １４ １４ １４ １４ １４
Ｎｏｔｅ: ｍｅ: Ｍｉｄｇｕｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍꎻ ｖｍ: Ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｕｓｃｌｅꎻ ｈｇ: Ｈｉｎｄｇｕｔꎻ ｏｓ: Ｏｅｓｏｐｈａｇｕｓꎻ ａｄ: Ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌｕｍꎻ ｓｇ: Ｓａｌｉｖａｒｙ
ｇｌａｎｄ.
扩散到中肠和后肠表面的肌肉层ꎬ且部分病毒已扩
散到达唾液腺(图 ３￣Ｄ、Ｅ)ꎮ 饲毒后 １２ ｄꎬ大量的
Ｐ９￣１蛋白分布在中肠、后肠、食道和前憩室外表的
肌肉细胞和唾液腺组织ꎬ表明病毒已达到了系统性
侵染(图 ３￣Ｆ)ꎮ 以上结果表明 ＲＢＳＤＶ在介体灰飞
虱体内首先侵染中肠上皮细胞ꎬ随后扩散到中肠表
面的肌肉细胞ꎬ并通过环肌和纵肌扩散到中肠和后
肠ꎬ最后扩散到唾液腺ꎮ 同时本研究也表明病毒可
以在中肠上皮细胞ꎬ外层肌肉和唾液腺等组织或器
官中复制和增殖ꎮ
３ 讨论
Ｐ９￣１ 蛋白是病毒原质的组分ꎬ参与病毒的复
制过程ꎬＰ９￣１ 蛋白存在的部位即病毒侵染后复制
的部位ꎬ如水稻锯齿叶矮缩病毒(Ｒｉｃｅ ｒａｇｇｅｄ ｓｔｕｎｔ
ｖｉｒｕｓꎬ ＲＲＳＶ)的 Ｐｎｓ１０ 也是病毒原质的组分ꎬ其在
中肠上皮细胞及唾液腺内均与病毒共定位[１７]ꎬ因
此通过免疫荧光技术标记 Ｐ９￣１蛋白在介体灰飞虱
体内的分布即可明确 ＲＢＳＤＶ的复制和扩散过程ꎮ
目前关于水稻呼肠孤病毒在介体内的侵染循
回已有多篇报道ꎬ如黑尾叶蝉传播的水稻矮缩病毒
(Ｒｉｃｅ ｄｗａｒｆ ｖｉｒｕｓꎬ ＲＤＶ)、褐飞虱传播的 ＲＲＳＶ 和
白背飞虱传播的 ＳＲＢＳＤＶ [１６ ~ １８ ]ꎮ 这几种病毒虽
然都属于介体昆虫传播的植物呼肠孤病毒ꎬ但由于
基因组和传播介体的差异其在介体内的侵染循回
过程也各有特点ꎮ ＲＢＳＤＶ 与 ＳＲＢＳＤＶ 有着非常
相近的亲缘关系ꎬ因此两种病毒在介体内的侵染循
回过程大体相似[１８]ꎬ均表现为:病毒顺着食道进入
中肠肠腔ꎬ少量病毒穿过微绒毛侵染少数的中肠上
皮细胞并建立初侵染点ꎬ病毒在上皮细胞内复制增
殖后穿过基底膜到达中肠表面的肌肉细胞ꎬ在肌肉
细胞上进行复制并沿着环肌和纵肌扩散到中肠、后
肠、前憩室和食道表面ꎬ同时病毒从中肠释放到血
淋巴并扩散到唾液腺完成在介体内的整个侵染循
回过程ꎮ 但 ＲＢＳＤＶ 在灰飞虱体内的扩散速率较
ＳＲＢＳＤＶ在白背飞虱体内的扩散速率缓慢ꎬ且灰
飞虱带毒率最高约为 ５０％ꎬ低于白背飞虱 ８０％的
带毒率[１９]ꎮ 与 ＲＢＳＤＶ同属呼肠孤病毒科的 ＲＤＶ
属于植物呼肠孤病毒属ꎬ其传播介体是黑尾叶蝉ꎬ
由于 ＲＢＳＤＶ与 ＲＤＶ属于不同病毒属且传播介体
不同ꎬ因此两者的侵染循回过程也存在较大的差
异[１６]ꎮ 首先ꎬ病毒的初侵染点不同ꎬＲＢＳＤＶ 首先
侵染灰飞虱中肠的上皮细胞进行复制ꎬ而 ＲＤＶ 在
介体叶蝉体内首先到达滤室的上皮细胞进行初侵
染复制ꎬ这可能与参与病毒侵入的受体蛋白的分布
位点不同有关ꎻ其次ꎬ病毒从中肠释放的方式不同ꎬ
ＲＢＳＤＶ在上皮细胞穿过基底膜直接到达中肠表面
的肌肉层ꎬ而 ＲＤＶ则从滤室扩散到前憩室和前中
肠ꎬ病毒在未到达其他器官之前迅速扩散到与中中
肠和马氏管相连接的神经系统ꎻ第三ꎬ病毒在消化
器官间的扩散方式不同ꎬＲＢＳＤＶ 沿着中肠表面的
环肌和纵肌扩散到后肠和食道ꎬ而 ＲＤＶ 不仅利用
肌肉细胞ꎬ还利用神经快速扩散ꎻ第四ꎬ病毒到达唾
液腺的方式不同ꎬＲＢＳＤＶ 通过血淋巴扩散到唾液
腺ꎬ而 ＲＤＶ则会通过神经快速将病毒从中肠扩散
到唾液腺ꎬ这种方式与玉米花叶病毒(Ｍａｉｚｅ ｍｏｓａ￣
ｉｃ ｖｉｒｕｓ)的扩散途径相似[２０]ꎮ
与非增殖型病毒不同ꎬ持久增殖型病毒必需在
介体内复制增殖ꎮ ＲＢＳＤＶ在介体灰飞虱体内的复
制贯穿于整个侵染过程ꎬ一旦阻断病毒的复制或扩
２９１
２期 贾东升ꎬ等:水稻黑条矮缩病毒在灰飞虱消化系统的侵染和扩散过程
散ꎬ灰飞虱就不能有效传毒ꎮ 例如:饲喂源于病毒
原质组分蛋白的 ｄｓＲＮＡ可以降低介体昆虫的带毒
率[１８]ꎬ其原因是阻断了早期病毒在中肠上皮细胞
的初侵染ꎻＳＲＢＳＤＶ 在灰飞虱体内受中肠释放屏
障的阻断ꎬ其扩散受阻而无法传毒[１９]ꎻ此外通过转
基因水稻干扰参与病毒复制的 Ｐ９￣１蛋白表达也可
以成功地抵抗病毒的侵染[１５]ꎮ 因此ꎬ通过分析病
毒的侵染循回过程ꎬ可以推测阻断 ＲＢＳＤＶ 在灰飞
虱体内的初侵染是防止病毒扩散的有效手段之一ꎮ
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责任编辑:张宗英
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