全 文 ：五种整叶透明染色法显微观察链格孢侵染银海枣的比较试验
孙　思 ,王　军
(华南农业大学 林学院 ,广东 广州　 510642)
提　要: 用五种整叶透明染色法显微观察链格孢对银海枣的侵染 ,观察效果有显著区别。 方法 2、 3和 5
效果较好 ,但因法 3较复杂 ,实际操作中采用的是方法 2和 5。 实际结果证明孢子上萌发的芽管有显著
地趋向伤口生长的性质。
关键词: 染色 ;透明 ;链格孢 ;银海枣
　　银海枣是一种价格较高的观赏性棕榈科植物。 广州
市芳村区花卉园有大量银海枣 ( Phoenix sylvestris )感染
了由链格孢菌 ( Alternaria alternata )引起的褐斑病。 经接
种试验证明 ,该菌只能侵染受伤的银海枣叶片 ,而不能侵
染无伤的银海枣叶片。 为了观察病原菌在有伤叶片上的
行为 ,本试验采用了五种整叶透明染色法处理叶片 ,观察
效果有显著区别。
1　材料和方法
采摘健康银海枣叶片 ,用自来水冲洗表面灰尘 , 70%
酒精擦拭表面消毒 ,无菌水冲洗残余酒精。用针刺伤叶表
面 , 喷洒孢子悬浮液接种 (浓度约为 10万个分生孢
子 /ml) , 然后在 28℃保湿培养 10 h。 将叶片剪为大小约
为 1cm2的小片 [1] ,按照以下五种方法进行透明染色:
( 1)在混合液中固定、染色、透明 48h→ 在饱和氯醛
水溶液中脱色 48h→ 制片镜检。
混合液成分: 95%乙醇 300ml,氯仿 150ml,苯酚
150g ,水合氯醛 450g , 90%乳酸 125ml,苯胺蓝 0. 6g。
( 2)在 1∶ 1的 95%酒精和冰醋酸中固定 24h→饱和
氯醛水溶液中透明 24h → 在 1%苯胺蓝中染色 0. 5h→
制片镜检。
( 3)在 1∶ 1的 95%酒精和冰醋酸中固定 24h→滴几
滴 1%酸性品红的甘油乳酸液 ,加热至发烟 → 除去残余
的甘油乳酸液 → 加几滴不含染料的甘油乳酸液 ,加热→
洗去多余染料 → 移至饱和氯醛水溶液中透明 → 制片镜
检。
( 4)在饱和氯醛水溶液中浸渍至透明 →清水漂洗 →
10% KOH水溶液中浸渍 48 h →制片镜检。
( 5) 75%乳酸中浸渍至透明 → 1%苯胺蓝染色 20min
→ 清水漂洗 → 制片镜检。
上述五种方法都用 50%甘油作浮载剂镜检观察。 方
法 1来自 Bruzzese整叶透明染色法 [2] ,应用于观察锈菌
侵染杨树叶片十分理想 ;方法 2、 3、 4和 5来自《植病研究
方法》 [3 ] ,方法 4适合于观察枯叶 ,方法 2、 3和 5未明确指
出适用对象 ,可能适用于观察多类病害 ,但少见于其他参
考资料 [4]。
2　结果与讨论
试验中 ,透明步骤是针对植物体而言 ,是指光线可以
透过植物体 ,以便观察植物体内部或表面的菌体。染色是
指将透明或浅色的菌体染成深色 ,更有利于观察 ,同时要
避免将植物体染上颜色 ,抵消透明的效果。
对于方法 1,应用于无伤接种时它的透明与染色效果
都比较好。 但应用于刺伤接种时 ,染色剂从伤口大量进入 ,
伤口周围颜色过深 ,反而使透明效果变差 ,不利于观察菌
体在伤口周围的活动。 对于观察杨树- 锈菌体系 ,由于是
无伤接种 ,因此染色液不会有在局部累积的问题 ,所以不
会出现本实验所述情形。因此方法 1不适于观察银海枣褐
斑病 ,并且由此推断出实际采用的透明染色法中透明和染
色的步骤最好分离进行 ,以便控制时间。 因为透明的时间
可能偏长较好 ,而染色的时间可能偏短较好。 方法 1的另
一个缺点是消耗药品种类多 ,数量大 ,使成本较高。
对于方法 4,叶片在 KOH中浸渍后 ,出现被轻微腐蚀
的迹象 ,具体原因不明 ,可能是书上所说的 KO H浓度对
于本实验过高 ,因此也不便采用。
对于方法 2、 3和 5,三者的染色效果都比较好 ,并且
染色步骤因为是单独进行 ,其时间还可根据需要进一步
调整。三者透明的效果则是 2, 3较好 , 5稍差一些。方法 2、
3相比 ,方法 2的步骤较多 ,而且有如滴几滴溶液、加热至
发烟等操作 ,不易掌握其度。 因此综合考虑 ,认为方法 3
各项指标最优。 对于方法 5,其对叶片的透明效果虽稍弱
于方法 3,但对于观察叶表面上的菌体没有影响。 后续试
验发现 ,链格孢菌的孢子芽管只能在叶面进行随机或有
趋向性的活动。因此使用法 5不影响观察效果 ,且其操作
与步骤最为简单 ,所用药品价格便宜 ,不失为一种好方
法。
使用方法 5的效果如下 (见图 1, 2)。 经观察发现 ,链
格孢孢子的芽管在银海枣叶片上有显著地趋向伤口生长
的性质。
(下转第 49页 )
·40· 陕　西　农　业　科　学 2005( 5)
收稿日期: 2005- 04- 25
　作者简介:孙思 ( 1980- ) ,男 ,重庆市人 ,硕士研究生 ,从事林木病理学研究。
　　试验中间隔一个月换一次诱芯 ,在蛾发生期更换过 2
次诱芯。 第一次更换 ,更换前 3d每天诱蛾量分别为 1. 3
头、 4. 1头、 0. 7头。 更换后 3d每天分别为 3. 4头、 1. 0头
和 1. 5头 ;第二次更换 ,更换前 3d每天蛾量分别为 4. 2
头、 9. 0头和 7. 6头 ,更换后 3d分别为 7. 4头、 2. 0头和
5. 2头 ,两次更换后均呈下降趋势 ,未引起蛾量突增 ,符合
整个蛾发生趋势 ,可见桃小食心虫性诱芯田间使用更换
间隔期在一个月左右是适当的 (表 1)。
表 1　性诱剂防治苹果桃小食心虫效果　 2004年 ,蒲城县洛滨镇
处　理
6月 25日 7月 20日 10月 22日
卵果率
(% )
果卵量
(粒 /百果 )
虫果率
(% )
卵果率
(% )
果卵量
(粒 /百果 )
虫果率
(% )
虫果率 (% )
性诱剂诱杀+ 蛾高峰期 ( 6月 25日、 7月 19
日 )药剂防治 2次 0. 5 2 0 1 1 0 0. 5B
药剂防治 4次 ( 6月 8日、 6月 26日、 7月 19
日、 8月 30日 ) 2. 8 6. 5 0. 5 2. 5 3. 2 2. 2 3. 5A
　　注:表中数字均为 5点平均值 ,数字后面大写字母代表极显著水平下的差异 ;处理药剂为 40%乐斯本 EC1 000倍。
　　以上诱蛾数量及显示的动态趋势 ,能较好的反映桃
小食心虫在当地的气候条件下的发生规律 ,世代清晰、蛾
峰期明显 ,利用其预测预报桃小食心虫的防治适期 ,有较
高的准确性。
2. 2　防治效果
试验结果显示 ,桃小食心虫性诱剂诱杀活性较高 ,可
明显降低田间蛾量 ,降低田间的卵果率。田间调查结果显
示: 性诱芯诱到雄蛾的数量连续 3 d增加时 ,桃小食心虫
田间始见卵与蛾高峰期相吻合 ,此时结合药剂防治一次 ,
可有效地控制桃小食心虫。 收获前 ( 10月 22日 )调查结
果 ,性诱剂诱杀+ 蛾高峰期药剂防治 2次的虫果率明显
低于药剂防治 4次的虫果率 ,经差异显著性测定 ,相互间
达极显著水平 (表 1)。
试验结果同时显示 ,桃小食心虫性引诱剂对金纹细
蛾也有一定的诱杀作用 ,全程单盆诱杀金纹细蛾 169. 2
头。 偶尔可诱到草蛉、瓢虫、地老虎等 ,数量极少 ,对天敌
安全。
3　小结
桃小食心虫性引诱剂用于苹果园桃小食心虫的预测
预报 ,能够达到测报应用技术要求 ,诱集的蛾量世代清
晰 ,有规律性 ,蛾峰期突出明显 ,预报准确性高 ,且简便易
行。使用性引诱剂诱杀防治桃小食心虫 ,在蛾峰期间隔 3 d
结合树上药剂防治一次 ,可受到良好的防治效果 ,比单一
的药剂防治既可减少施药次数 ,又具有降低农药果品残
留、保护生态环境等优点。 在生产中应用时 ,最好连片使
用 ,适当缩短盆间距离 ,第二代蛾高峰期没有越冬代整
齐 ,药剂防治时要结合田间查卵进行。
(上接第 40页 )
图 1　浸染效果　　　　　　　　　　　　　　　图 2　浸染效果
注: W表示伤口 ( w ound) ; GT表示芽管 ( germ tube) ; S表示孢子 ( spor e)。
参 考 文 献:
[1 ]　田呈明 ,梁英梅 , 康振生等 .杨树与栅锈菌互作的组织病理
学研究 [ J ]. 林业科学 , 2001, 37( 6): 52～ 58.
[2 ]　 E Bruzese, S h as an. A wh ole leaf clearing and staining
tech nique for h ost speci fici ty studies of rus t fu ngi [ J] . Plant
patholog y, 1983, ( 32): 335～ 338.
[ 3 ]　中达主编 . 植病研究方法 (第三版 ) [M ] . 北京: 中国农业
出版社 , 1998.
[4 ]　张凤国 , 汪宜萱 , 王智忻 .几种整叶透明染色方法的比较
[ J] . 河北农业大学学报 , 1989, 12( 2): 151～ 153.
·49·康　珍等: 性引诱剂在苹果桃小食心虫测报和防治上的应用试验