全 文 ：RP-HPLC法测定月腺大戟中狼毒乙素的含量
谢演晖 1 ,严小红 1＊ ,王灿坚1 ,江英桥 1 ,马双成 2
(1.广州市药品检验所 ,广东 广州 510160;2.中国药品生物制品检定所 ,北京 100050)
　　摘要　目的:建立高效液相法测定月腺大戟中狼毒乙素含量。方法:月腺大戟经粉碎后用甲醇超声提取 ,采用
C18柱(250mm×4.6mm, 5μm), 乙腈-水(40∶60)洗脱 ,流速:1.0 mL/min,检测波长为 290 nm,进样量 10μL, 外标
法定量。结果:狼毒乙素在 4.048 ～ 20.24 μg/mL浓度范围内线性关系良好 , r=0.9999;平均加样回收率为
101.6%, RSD为 0.72%。结论:本方法专属性强 , 快速简便 ,为狼毒质量标准的制定提供了依据。
关键词　HPLC;月腺大戟;狼毒乙素;含量测定
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)04-0568-03
收稿日期:2009-06-09基金项目:国家科技支撑计划药品安全关键技术研究(2006BAI14B00);常见与重要药品安全标准研究(2006BAI14B01)＊通讯作者:严小红 , E-mail:yanxh73@hotmail.com。
　　月腺大戟 EuphorbiaebracteolataHayata为大戟
科植物 ,是中药狼毒的原植物之一 , 主要分布于江
苏 、安徽 、浙江 、山东等地 , 具有散结 、杀虫的功
效 〔1〕 ,用于治疗淋巴结结核 、皮癣 ,是单方制剂结核
灵片的原料药 ,现代药理研究表明其具有抗结核杆
菌和抗肿瘤活性 〔2〕 ,其质量标准收载于中国药典
2005年版增补本 ,该标准无含量测定项 ,因此建立
合理有效的含量测定方法对毒性药材狼毒的质量控
制十分必要 。
目前 ,有关狼毒的药源 、质量标准 、含量测定 、化
学成分以及药理作用等方面已有研究报道 〔1, 3-6〕。
本研究在此基础上 ,通过试验筛选 ,进一步优化色谱
条件 ,建立了测定月腺大戟中狼毒乙素含量的新的
高效液相方法 ,并对 16份不同来源的月腺大戟进行
了测定 ,为狼毒中狼毒乙素限度的制定提供了数据
参考。
1　仪器与材料
岛津 LC-10Avp高效液相色谱仪;LC-10ADvp
泵;CTO-10ASvp柱温箱;SIL-10ADvp自动进样器;
SPD-M10Avp二极管阵列检测器;岛津 CLASS-VP工
作站。超声波清洗器为德国 ELMA-S100。
狼毒乙素对照品由月腺大戟中提取分离得到 ,
面积归一化法计算纯度(98.7%);甲醇和乙腈均为
色谱级 ,水为 MiliQ超纯水 。 16份供试药材来源见
表 1,由广州市药品检验所侯惠婵和刘伯英主任中
药师鉴定为大戟科植物月腺大戟 Euphorbiaebracteo-
lataHayata的根。
2　方法与结果
2.1　溶液的制备
2.1.1　供试品溶液的制备:取样品粉末(过四号
筛)约 1 g,精密称定 ,加入甲醇 50 mL,称重 ,摇匀 ,
超声 30 min,取出 ,放冷 ,加甲醇补足减失的重量 ,用
微孔滤膜过滤(0.45 μm),取续滤液 ,即得。
2.1.2　对照品溶液的制备:取狼毒乙素对照品约
5mg,精密称定 ,置 50mL量瓶中 ,加甲醇至刻度 ,再
精密量取 5 mL,加甲醇稀释至 50 mL,即得。
2.2　色谱条件与系统适用性研究　色谱柱:依利
特公司 HypersilODS2柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);
流动相为乙腈 -水 (40∶60);流速 1.0 mL/min;检测
波长 290nm;进样量 10 μL。在此色谱条件下 ,药材
中其他色谱峰对狼毒乙素峰无干扰 ,理论塔板数大
于 10 000,峰形尖锐 ,基线平稳。色谱图见图 1。
图 1　狼毒乙素(A)和月腺大戟 2号
样品(B)的 HPLC图谱
1.狼毒乙素
2.3　线性关系考察　精密称取狼毒乙素对照品适
量 ,用甲醇制成每 1 mL含狼毒乙素 200 mg的对照
品溶液 ,精密量取该对照品溶液 2、3、 4、5、6、8、10
·568· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 4期 2010年 4月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2010.04.033
mL置 100 mL量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,制成 6个
浓度的对照品溶液 。分别精密吸取 10 μL进样 ,按
“2.2”项下色谱条件测定 。以浓度(X)为横坐标 ,以
峰面积(Y)为纵坐标 ,进行线性回归 ,回归方程为:Y
=51493X-3753.7, r=0.9999,表明浓度在 405 ～
2024μg/mL范围内线性关系良好。
2.4　精密度试验　精密吸取对照品溶液 10μL,连
续进样 6次 。以峰面积计算 , RSD为 0.5%,表明仪
器精密度良好。
2.5　稳定性试验　取本品粉末 ,按 “ 2.1.1”项下方
法制备供试液 ,分别于 0、2、4、6、8、10、12和 24 h进
样 ,分别依法测定 ,结果表明样品在 24 h内稳定。
2.6　重复性试验　取同一批样品 6份 ,按 “2.1.1”
项下方法制备供试液 ,分别测定 ,样品的平均含量为
0.043%, RSD为 0.9%,结果表明方法的重复性良
好 。
2.7　加样回收率试验　精密称取已知含量的同一
狼毒大戟样品 0.4、0.5、0.6 g, 分别精密加入狼毒
乙素对照品 150、200、250 g,一式三份 ,按 “2.1.1”项
下方法制备溶液 ,按 “2.2”项下色谱条件分别进样
10 μL,测定含量 ,计算加样回收率 ,结果狼毒乙素的
平均加样回收率 (n=9)为 101.6%(RSD=
0.72%)。
2.8　检测限和定量限　取 “2.1.2”项下的对照品
溶液稀释 ,以甲醇为空白对照 ,以信噪比 3∶1为指
标 ,测得检测限为 0.042 μg/mL, 定量限为 0.140
μg/mL。
2.9　样品含量测定　取 16批样品 ,按照 “ 2.1.1”
项下方法制备供试品溶液 ,在 “2.2”项下色谱条件
测定 ,以外标法计算各批药材中狼毒乙素的含量 ,结
果见表 1。
3　讨论
3.1　狼毒乙素的紫外最大吸收波长为 290 nm,且
吸收峰较为平坦 。故选择 290nm为检测波长 。
3.2　采用 C18色谱柱 ,分别考察了乙腈-水(40∶
60)、甲醇-水(50∶50)和甲醇-水-10%醋酸(45∶55∶
2)(10%氨水调至 pH5.4)等流动相 ,结果发现以乙
腈 -水(40∶60)为流动相 ,具有组分简单 、分离度大 、
色谱峰对称 、理论塔板数大等优点。
3.3　分别考察了超声 、回流 、索氏提取 、冷浸等提
取方法 ,结果显示前三种测定结果均接近 ,考虑到实
验方法的简便 ,采用甲醇超声提取的方法作为提取
方法。
3.4　分别考察了超声处理 10、 20、 30、 40、 50、 60
min后对狼毒乙素的提取效果 ,结果表明超声 20
　表 1　月腺大戟 、狼毒大戟及狼毒代用品的狼毒乙素含量
编号 药名 来源 含量 /%
1 月腺大戟 安国市云天中药行 -
2 月腺大戟 辽宁省药品检验所提供 0.043
3 月腺大戟 江苏省药品检验所提供 0.029
4 月腺大戟 长安中药材有限公司 0.010
5 月腺大戟 河北国安市养生堂药业 0.039
6 月腺大戟 安徽省亳州市药材总公司药材公司 0.019
7 月腺大戟 河北安国市同利中药材有限公司 0.027
8 月腺大戟 亳州百全药业有限公司 0.019
9 月腺大戟 安国市京兴药业 0.037
10 月腺大戟 安国市冷背药材有限公司 0.034
11 月腺大戟 亳州市安格药业有限责任公司 0.032
12 月腺大戟 中国药品生物制品检定所 0.023
13 月腺大戟 中国药品生物制品检定所 0.016
14 月腺大戟 中国药品生物制品检定所 0.027
15 月腺大戟 江门市恒健药业有限公司 0.025
16 月腺大戟 驼腰子镇药材开发中心 0.031
17 狼毒大戟 中国药品生物制品检定所 0.010
18 瑞香狼毒 长安中药材有限公司 -
19 海芋 广州市通济堂药店 -
min已将大部分狼毒乙素成分提取完全 ,为保证将
狼毒乙素成分尽可能提取完全 ,故将提取时间定为
30 min。3.5　分别考察了 C18和 C8色谱柱的实验
结果 ,结果发现 C18柱的分离度 、拖尾因子和保留时
间均比 C8柱好 ,故实验中采用 C18柱子分离。
3.6　狼毒乙素溶于乙醇 、甲醇 、丙酮 、乙酸乙酯及
氢氧化钾溶液 ,在供试品的制备过程中比较了甲醇 、
氯仿和石油醚不同溶剂的提取效果 ,结果表明甲醇
提取较完全 ,因此采用甲醇提取。
3.7　通过对 16批月腺大戟中狼毒乙素的含量测
定表明 ,不同产地的药材中狼毒乙素的含量差别较
大 ,其中 15批检测到狼毒乙素 ,最高为 0.04%。狼
毒的另一原植物狼毒大戟也含有狼毒乙素 ,而瑞香
狼毒和海芋(广东狼毒)未检测到狼毒乙素。
本研究建立的月腺大戟中狼毒乙素的含量测定
方法分离度好 、准确度和专属性高 ,可为狼毒药材质
量标准的制定提供依据 。
参 考 文 献
[ 1] 徐国钧等 .常用中药材品种整理和质量研究(南方协
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收稿日期:2009-07-07基金项目:珠海市科技基金资助项目(PC20052031)作者简介:余德芊(1975-),女,讲师 ,硕士 ,主要从事肾脏生理学研究;E-mail:yudeqian@ 163.com。＊通讯作者:高原 , Tel:0756-7623306, E-mail:gy60211@yahoo.com.cn。
·药理 ·
大黄酸对高糖和血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠
近端肾小管上皮细胞肥大的影响
余德芊 1 ,高　原2＊ ,刘晓红 1
(1.遵义医学院生理学教研室 ,贵州 遵义 563003;2.遵义医学院珠海校区生理学教研室 , 广东 珠海
519041)
　　摘要　目的:探讨大黄酸(Rhein)对高糖和血管紧张素Ⅱ(angiotensin, AngⅡ)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞
肥大的影响。方法:麻醉下 ,无菌分离大鼠单根近球小管并培养 ,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮
细胞。在高糖(30mmol/L)环境下用 AngⅡ(10-7 mol/L)刺激肾小管上皮细胞肥大。与此同时 , 加入不同浓度的大
黄酸(30、15、5mg/L),作用 72 h后检测细胞体积 、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量以观察细胞肥大的变化。结
果:高糖(30 mmol/L)+AngⅡ(10-7 mol/L)培养 72 h导致细胞体积显著增大 , 3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质
含量显著增加。加入大黄酸处理 72h后 , 大黄酸 30 mg/L可显著降低高糖和 AngⅡ所致的细胞体积增大 、3H-亮氨
酸掺入量及细胞内蛋白质含量的升高。大黄酸 15 mg/L降低了 3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量 ,而对细胞
体积无显著抑制作用。大黄酸 5 mg/L可降低细胞内蛋白质含量 , 而对细胞体积及 3H-亮氨酸掺入量无显著抑制作
用。结论:大黄酸能抑制高糖和 AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大。
关键词　大黄酸;高糖;血管紧张素Ⅱ;近端肾小管上皮细胞;细胞肥大
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　文章编号:1001-4454(2010)04-0570-05
EfectsofRheinontheHypertrophyofRenalProximalTubularEpithelialCels
InducedbyHighGlucoseandAngiotensinⅡinRats
YUDe-qian1 , GAOYuan2 , LIUXiao-hong1
(1.Departmentofphysiology, ZunyiMedicalColege, Zunyi563003, China; 2.Departmentofphysiology, ZhuhaiCampusofZunyi
MedicalCollege, Zhuhai519041, China)
Abstract　Objective:ToexploretheefectofRheinonthehypertrophyofrenalproximaltubularepithelialcelsinducedbyhigh
glucoseandangiotensinIIinrats.Methods:StudieswereperformedonanesthetizedSDrats.Renalproximaltubularweregainedbymi-
crodissectionandculturedinRPMI-1640 medium.Thecelltypeswereidentifiedbyimmunocytochemistry.Therenalproximaltubular
epithelialcelswereincubatedwithhighglucose(30 mmol/L)andangiotensinII(10 -7 mol/L)toinducethehypertrophyofcels.To
observetheeffectofRheinonhypertrophyinducedbyhighglucoseandangiotensinII, renalproximaltubularepithelialcelswerecul-
turedwithdiferentconcentrationsofRhein(30, 15, 5 mg/L)for72h, thencelsize, 3H-leucineincorporation, andcelularproteincon-
tentweredetectedtoobservethechanges.Results:Highglucose(30mmol/L)andAngI(10-7 mol/L)inducedhypertrophyofrenal
proximaltubularepithelialcellsresultin, celsize, 3H-leucineincorporationandcellularproteincontentincreasedsignificantly.Onthe
contrary, RheininhibitedthehypertrophyofrenalproximaltubularepithelialcelsinducedbyhighglucoseandAngiotensinⅡ.Rhein
30 mg/Lsignificantlydecreasedcelsize, 3H-leucineincorporationandcellularproteincontent.Rhein15 mg/Ldecreased3H-leucine
incorporationandcelularproteincontent.Rhein5mg/Ldecreasedcellularproteincontent.Conclusions:Rheincaninhibitthehyper-
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