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薇甘菊杀线虫活性成分及其对番茄生长的影响



全 文 :薇甘菊杀线虫活性成分及其对番茄生长的影响
李 君1,2, 李 3, 曹坳程2, 沈斌斌1
(1.华南农业大学资源环境学院, 广东 广州 510642; 2.中国农科院植物保护研究所, 北京 100193;
3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州 贵阳 550002)
摘 要:采用活性追踪法,从外来入侵杂草薇甘菊中提取到两种活性化合物——薇甘菊内酯和间-甲氧基苯甲
酸。以南方根结线虫为测试对象,测试了两种化合物的杀线虫活性和卵囊孵化抑制率。结果表明,两种化合物具有中
等强度的杀线虫活性,其中薇甘菊内酯活性较高,药后 48 h 的致死中浓度(LC50)为 57.75 mg/L,药后 6 d 的抑制中浓
度(IC50)为 415.87 mg/L。 另外,测试了两种化合物对寄主植物番茄生长、根系活力和叶片的超氧化物歧化酶(SOD)酶
活的影响,结果表明两种化合物对番茄生长没有明显影响,但是可以显著减少根结线虫的侵染。 根系活力和 SOD 酶
活结果进一步证明了两种化合物抑制线虫侵染的活性。
关键词:薇甘菊; 杀线虫活性; 薇甘菊内酯; 间-甲氧基苯甲酸; 寄主植物
中图分类号:S482.3+9 文献标识码:A 文章编号:1004-874X(2014)19-0070-05
Nematicidal constituents of Mikania micrantha against Meloidogyne
incognita Chitwood and their effects on growth of tomatoes
LI Jun1,2, LI Yan3, CAO Ao-cheng2, SHEN Bin-bin1
(1.College of Resources and Environment, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2.Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province
and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China)
Abstract: Two compounds, mikanolide and m -methoxy benzoic acid, have been isolated from leaves of Mikania
micrantha H. B. K. with method of bioactivity-guided fractionation. Nematode mortality and hatching inhibition rate were
evaluated against Meloidogyne incognita. The results showed that two compounds possessed nematicidal activity and
mikanolide had higher activity than m-methoxy benzoic acid. Median lethal concentration (LC50) and median inhibitory
concentration(IC50) of mikanolide were 57.75 mg/L(at 48 h) and 415.87 mg/L(at 6 d), respectively. Their effects on growth,
root activity, and superoxide dismutase (SOD) enzyme activity of tomato were tested. The results indicated that both
compounds had no effect on the growth of tomato but could reduce the infection of root-knot nematode. The results of root
activity and SOD enzyme activity demonstrated further that both compounds could inhibit the action of nematode infection.
The significance of this study was that two compounds may play a role in reducing the populations of root-knot nematode.
Key words: Mikania micrantha; nematicidal activity; mikanolide; m-methoxy benzoic acid; host plant
薇甘菊(Mikania micrantha H. B. K.)属菊科假泽兰
属,又称为“一分钟一英里”杂草,是一种生长极快的多
年生匍匐杂草。 原产于中南美洲,被 IUCN(世界自然保
护联盟)列为全球 100 种最具破坏力的物种——“植物
绿色杀手”。 我国 1984 年在香港植物园首次采集到薇
甘菊标本[1-2],迄今为止,薇甘菊已遍布我国海南、广西、
香港、台湾、云南、广东等省,严重破坏了入侵地的生物
多样性和生态环境,同时造成巨大的经济损失。 然而,
在薇甘菊原产地,它不但没有造成危害,反而是一种良
好的草药,用来治疗伤口感染、皮癣、足癣等多种皮肤
病及蛇蝎毒等。 文献报道,薇甘菊含有多种次生代谢产
物,具有抗菌、抗癌、镇痛、抗炎等多种生物活性[3-13]。 然
而,薇甘菊的杀线虫活性从未被报道。 为此,本研究采
用活性追踪法, 从薇甘菊叶氯仿提取物中提取到两种
具有杀线虫活性的化合物,并通过盆栽试验,测定了两
种化合物对寄主植物生理生长的影响。
1 材料与方法
1.1 植物材料
收稿日期:2014-05-08
作者简介:李君(1988-),男,在读硕士生,E-mail:2008eveni
ng@163.com
通讯作者:沈斌斌(1965-),男,博士,副教授,E-mail:shenb
inbin@scau.edu.cn


广东农业科学 2014 年第 19期70
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.19.023
薇甘菊叶样品采集于 2011 年 4 月广东东莞芒果
园内。 样本由魏孝义教授鉴定, 已鉴定的标本(No.
020701)存放在广州中国科学院华南植物所。
1.2 提取和分离
自然风干的薇甘菊叶片(1.0 kg)由氯仿(3 L× 3)在
室温下超声提取 30 min, 提取液加入活性炭作脱色处
理,随后过滤去除活性炭和残渣。 合并 3 次提取液,浓
缩得 55.34 g 浸膏(产量 6.13%)。 55.0 g 浸膏一级硅胶
柱层析(0.150~0.075 mm)分离,流动相为四氯化碳 ∶丙
酮∶甲醇(30∶2∶1, 30∶5∶1, 30∶5∶2 30∶6∶2, 30∶6∶3, 30∶6∶4, 30∶
6∶5, V/V/V) 梯度洗脱, 得到流分 A-1 到 A-18。 A-7
(3.7534 g) 二级硅胶柱层析分离, 流动相为石油醚∶丙
酮=3∶2 (V/V),A-7-3 流分经丙酮重结晶得化合物 1
(2.0872 g,产量 0.2088%)。 A-13(4.3462 g)二级硅胶柱
层析分离,流动相为氯仿∶乙酸乙酯=2∶1(V/V),A-13-3
流分经氯仿重结晶得化合物 2 (1.9624 g, 产量
0.1962%)。
1.3 线虫培养
南方根结线虫(Meloidogyne incognita Chitwood)在
北京郊区温室中的番茄根系上获得, 接种至番茄苗上
进行人工繁殖。 从感染南方根结线虫的番茄病根挑取
新鲜卵囊, 置于培养皿 (d=6 cm), 皿底垫湿润滤纸 1
张,置于 25(±1)℃培养箱,5~7 d后待卵孵化,收集二龄
幼虫备用[14]。
取病根于解剖镜下挑取大小一致的卵囊, 用镊子
收集于烧杯中, 用 0.5% 的次氯酸钠处理卵囊 3 次 [15],
然后统计每个卵囊包含的卵量。
1.4 室内毒力测定
1.4.1 线虫死亡率生测 用二甲亚砜(2.5%,V/V)将化
合物 1、2 配制成 1 000 mg/L 的溶液, 分别吸取 1、0.5、
0.25、0.125、0.0625 mL 溶液置于 24 孔培养板内, 每孔
加入 1 mL 线虫水(包含 J2 幼虫约 300 头),剩余部分
用蒸馏水补足至 2 mL[16],以 2.5%二甲亚砜溶液为对
照,每个处理 3 次重复。 将 24 孔板放入 25(±1)℃恒温
箱中,12、24、36、48 h 后在解剖镜下检查结果并进行毒
力分析。 检查方法采用针刺法,用挑针轻轻刺碰僵直的
线虫,如若不动,即为死亡[17]。
1.4.2 线虫卵囊孵化生测 化合物 1、2 用二甲亚砜
(2.5%,V/V) 配制成浓度为 2 000,1 000,500,250 和
125 mg/L 的溶液, 分别吸取 1 mL 溶液加入到 24 孔板
中,放入 2个南方根结线虫卵囊(包含约 250个卵)。 以
2.5%二甲亚砜溶液为对照,以无菌水为空白,每个处理
3次重复。 置于 25(±1)℃培养箱中,分别于培养 2、4、6
d后检查卵孵化数并计算孵化抑制率。
1.5 盆栽试验
1.5.1 活性化合物对寄主植物番茄生长和线虫侵染的
影响 将 1 000 g 灭菌土装入塑料花盆(d=15 cm)中,
注入新孵化的 J2幼虫 1 500 头。 将化合物 1、2 用溶剂
(2.5%,V/V)配成所需的浓度,采用灌根法将待测溶液
注入花盆土中,48 h 后,在每个花盆中移栽入 7 d 大小
的番茄苗,等量溶剂处理(2.5%二甲亚砜溶液,V/V)为
对照,未接种线虫为空白,每样重复 3 次,将花盆随机
放置在温室中(25℃±1℃),正常水肥管理。 接种后 25
d,将番茄苗从盆中移出,用清水冲洗根系,测量并记录
株高、根重、鲜重、根长、根结数,计算根结指数。
1.5.2 番茄根系活力的测定 将番茄根系用吸水纸吸
干水分,切成 1~2 cm的小段,混合均匀后称取 1 g置于
100 mL锥形瓶中。 根系活力的测定采用 α-萘胺法[18]。
1.5.3 SOD酶活性的测定 粗酶液的制备: 取每个处
理番茄叶片 1 g,放入玻璃匀浆器,加入适量磷酸缓冲
液(pH 6.5),匀浆,离心(8 000 r/min,15 min),吸取上
清液,重复两次,合并上清液,用蒸馏水稀释至 25 mL,
-20℃保存备用。
叶片 SOD 酶活性采用南京建成试剂盒(WST 法)
测定。
试验结果的均值进行 Duncans 多重比较(DMRT),
计算标准误差 , 回归方程和置信区间 。 数据均由
SPSS19.0处理分析。
2 结果与分析
2.1 化合物结构鉴定
化合物 1 为白色针状晶体, 其波谱数据与文献一
致,故鉴定为薇甘菊内酯[19],其结构见图 1。 化合物 2为
白色针状晶体,通过解析其波谱数据确定其结构为间-
甲氧基苯甲酸,其结构见图 1。 化合物 1、2的 1H和 13C
NMR 波谱数据见表 1。
2.2 室内离体生物测定结果
2.2.1 杀线虫活性毒力测定结果 化合物 1、2 对南方
根结线虫 J2 毒力测定结果见表 2, 结果表明薇甘菊内
酯和间-甲氧基苯甲酸对 J2 有中等的活性, 薇甘菊内
酯活性较强,其 12、24、36、48 h 的 LC50分别为 450.93、
220.01、116.57、57.75 mg/L, 间-甲氧基苯甲酸活性较
图 1 化合物 1、2 的结构
1 薇甘菊内酯 2 间-甲氧基苯甲酸
71
化合物 1 化合物 2
表 1 化合物 1、2(DMSO)的 1H NMR(400 MHz)和 13C NMR
(300 MHz)波谱数据(J in Hz)
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
13C NMR
57.59
55.70
49.56
129.27
150.68
83.69
50.46
76.94
42.56
57.53
138.71
168.34
122.43
21.36
171.25
1H NMR
3.26s
3.39d(3.1)
4.79m
7.61d(0.9)
5.49m
3.98m
4.82m
1.88dd(13.4,4.6)
2.19dd(13.1,11.3)
6.22d(3.6)
5.95d(2.6)
0.99s
13C NMR
140.88
127.7
130.05
131.71
131.36
129.20
167.29
52.74
1H NMR
7.85d(3.0)
7.75d(1.2)
8.06t(11.3)
5.74s
8.14d(6.0)
3.92s
表 2 化合物 1、2 对南方根结线虫二龄幼虫的杀线虫活性
化合物
化合物 1
化合物 2
药后 12 h
0.904x-
2.401
0.960x-
3.543
24 h
1.061x-
2.484
1.119x-
3.526
36 h
1.075x-
2.222
1.110x-
3.262
48 h
1.231x-
2.169
1.344x-
3.597
12 h
450.93
4925.50
24 h
220.01
1413.80
36 h
116.57
866.80
48 h
57.75
474.16
12 h
389.66~
535.59
3084.23~
9397.77
24 h
200.64~
243.11
1032.69~
2173.34
36 h
106.90~
126.93
682.59~
1183.87
48 h
52.24~
63.26
423.80~
539.49
毒力回归方程 LC50 (mg/L) 95%置信区间 (mg/L)
弱,LC50分别为 4 925.50、1 413.80、866.80、474.16 mg/L。
该结果显示薇甘菊内酯和间-甲氧基苯甲酸是薇甘菊
叶中的杀线虫活性成分。
2.2.2 卵囊孵化抑制率测定结果 离体测试下, 不同
浓度的化合物 1、2 对南方根结线虫卵囊的孵化有显著
的抑制效果(表 3),抑制率随着药物浓度下降而降低。
药后 2、4、6 d 薇甘菊内酯 IC50 分别为 732.71、504.15、
415.87 mg/L,间-甲氧基苯甲酸 IC50则分别为 1 217.03、
728.14、715.67 mg/L,显然,薇甘菊内酯对南方根结线虫
的抑制效果显著高于间-甲氧基苯甲酸。 接触时间也显
著影响着药物对线虫卵囊孵化的抑制率, 药后 6 d 达
到最大效果。
2.3 盆栽试验测定结果
2.3.1 化合物 1、2 对番茄生长和线虫侵染的影响 线
虫的侵染可以刺激其寄主分泌特殊的化学物质, 这些
物质诱导植物产生根结、根瘤等,因此植物会变得生长
缓慢,叶片变小、变黄等[20]。薇甘菊提取化合物 1、2对番
茄生长和线虫侵染的影响见表 4,结果显示空白组和对
表 3 化合物 1、2 对南方根结线虫卵囊孵化抑制影响
化合物
化合物 1
化合物 2
药后 2 d
2.43x-6.96
2.32x-6.60
4 d
1.62x-4.21
1.42x-4.08
6 d
1.54x-4.04
1.38x-3.99
2 d
733
1217
4 d
504
728
6 d
416
716
2 d
639.46~822.11
978.06~1527.98
4 d
344.05~468.86
614.75~865.78
6 d
362.79~472.46
671.12~906.28
毒力回归方程 IC50(mg/L) 95%置信区间(mg/L)
照组的番茄生长有很大差异, 这是由于对照组植株有
线虫的侵染, 从而导致了其生长缓慢。 从表 4 可以看
出,处理组和对照组之间的株高、根长、苗长和鲜重均
没有显著的差异。 表明化合物 1、2 对番茄生长没有显
著影响。
然而,从表 4 可以看出,处理组的根结数较对照
组均有减少,浓度越高根结数越少。 该结果表明化合
物 1、2 均可以减少线虫对番茄的侵染。 另外,两个化
合物减少线虫侵染的数据差异是显著的,化合物 1 作
用较强,400 mg/kg 的处理根结数最少。 显然,薇甘菊
内酯在抑制线虫侵染上的活性要强于间-甲氧基苯甲
酸。
2.3.2 根系活力测试结果 根系活力代表着植物根系
吸收和代谢的能力, 根系活力直接影响着植物的耐受
力和生长状况以及作物产量[21]。根系活力测定的结果见
图 2,结果显示对照组和处理组的根系活力显著低于空
白组,这是由于线虫的入侵导致了根系活力的降低。 然
而,在对照组和处理组之间也有差异,不同的浓度化合
物处理的根系活力均高于对照组, 化合物 1 处理的根
系活力要高于化合物 2 处理的根系活力。 上一个试验
的结果显示化合物 1 处理的植株根系的根结数少于化
合物 2 处理的植株, 故少量的侵入线虫对于寄主植物
的根系活力影响也较小。
2.3.3 SOD活性测试结果 由于在逆境条件下植物会
72
160
140
120
100
80
60
40
20
0




( μ
g/

h,
FW

400 200 100 50 对照 空白
图 2 化合物 1、2 对番茄根系活力的影响
ab
bc bc cde bcd
ef
def ef f
a
处理(mg/kg)
化合物 1
化合物 2
化合物 1
化合物 280
70
60
50
40
30
20
10
0
SO
D


( m
g/
m
L)
ef
de cd
bc b ab ab
a a
f
400 200 100 50 对 照 空 白
图 3 化合物 1、2 对番茄 SOD 活性的影响
处理(mg/kg)
表 4 化合物 1、2 对寄主植物番茄生长和根结线虫侵染的影响
化合物
化合物 1
化合物 2
对照
空白
浓度(mg/kg)
400
200
100
50
400
200
100
50
株高(cm)
69.64±0.35 b
67.45±1.82 b
72.01±1.66 b
69.29±0.35 b
66.53±2.91 b
66.51±2.36 b
66.53±2.36 b
65.02±2.91 b
69.29±2.35 b
81.10±1.25 a
根长(cm)
19.25±0.95 b
21.54±1.24 b
20.89±0.91 b
21.03±0.90 b
19.52±1.50 b
18.77±1.27 b
20.67±1.20 b
19.10±1.80 b
21.38±1.80 b
28.08±1.89 a
苗长(cm)
82.33±1.20 b
83.00±2.08 b
82.00±1.53 b
81.33±0.88 b
77.00±1.53 bc
72.33±2.03 c
78.00±3.21 bc
74.33±3.84 bc
80.33±0.88 b
87.67±0.88 a
鲜重(g)
17.71±0.80 b
20.18±0.85 ab
18.38±0.59 b
18.63±0.81 ab
15.35±0.57 bc
15.12±0.78 bc
14.13±0.23 c
15.33±0.58 bc
17.83±1.60 b
21.49±0.52 a
根结数
10.33±0.88 e
15.67±0.88 d
21.33±0.88 c
28.00±2.08 b
14.00±1.15 d
18.00±0.58 c
28.00±1.15 b
36.00±0.58 a
38.33±0.88 a
根结指数
11.49±0.60 d
15.80±0.42 c
17.86±0.42 b
17.87±0.82 b
13.92±0.84 d
16.08±0.13 c
21.04±0.14 b
22.41±0.24 a
22.16±0.14 a
注:表中同列数据后小写英文字母不同者表示经 Duncans 法检验差异显著。
增加活性氧自由基的清除能力, 所以其体内的保护酶
的活性,如 SOD,将会被加强,以减少活性氧对寄主植
物的伤害[22]。 化合物 1、2 对番茄叶片 SOD 活性影响测
定结果见图 3, 空白组的 SOD 活性显著低于对照组和
处理组,这是因为空白组没有线虫的入侵,故而植株的
保护酶活性没有增加。 对照组的 SOD活性是所有处理
中最高的,因为对照组的入侵线虫数最多,故而其叶片
的 SOD 活性也最强。 化合物 1、2 处理组的植株,随着
浓度的减小,侵入的线虫数也增加,所以植株叶片 SOD
活性增强。 另外,化合物 2 处理组植株叶片的 SOD 活
性高于化合物 1 处理组, 即被化合物 2 处理的寄主植
物的线虫侵染程度更强。
3 结论与讨论
化感作用一直被视为外来植物入侵的重要策略。
从薇甘菊中提取到的几种倍半萜二内酯和黄酮醇苷化
合物被报道具有化感作用[23-24]。然而,薇甘菊内酯和间-
甲氧基苯甲酸是否具有化感作用至今没有报道。 本研
究测试结果显示,被薇甘菊内酯和间-甲氧基苯甲酸处
理的植物生长与对照相比没有明显不同。 故推测这两
种化合物不是薇甘菊中的化感物质。
本实验室前期的试验结果显示薇甘菊内酯和间-
甲氧基苯甲酸对多种植物病原菌具有强烈的抑制作
用 [11,21],本试验的结果又显示它们具有中等的杀线虫活
性,故它们既具有抑菌活性又具有杀线虫活性。 众所周
知,农业生产中,根结线虫的侵入会导致植物抗病能力
下降, 使得植物更容易感病, 从而造成巨大的经济损
失。 盆栽试验结果显示被薇甘菊内酯和间-甲氧基苯甲
酸处理的植物根结数明显低于对照, 推测它们不但能
杀灭植物病原菌,同时能够减少线虫的入侵,使得植株
的抗病能力提高, 从而降低植物病原菌和根结线虫的
为害程度,对于农业丰收具有重要意义。 本实验的意义
在于揭示了薇甘菊内酯和间-甲氧基苯甲酸在农业生
产中作用,从而为开发它们的农用活性提供理论依据。
另外,间-甲氧基苯甲酸的钠盐一直被作为食品防
腐剂来使用。 随着人们生活和消费水平的提高,对食品
加工的需求越来越向“绿色”和“天然”等理念转变。 再
者,薇甘菊在广东等地严重泛滥,所以原材料来源广、
价格低,且薇甘菊无毒,无副作用,所以开发薇甘菊作
为植物源杀菌剂和杀线虫剂服务于农业, 在控制根结
73
线虫种群方面起一定的作用, 或者开发为防腐剂服务
于食品加工等都具有一定的可行性。 该理念的应用将
会拓展薇甘菊的应用价值, 从而从应用的角度去消除
外来入侵植物薇甘菊的负面影响。
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(责任编辑 杨贤智)
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