全 文 ：第 22卷　第 2期
2001年 6月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报
Journal o f Inner Mongo lia Ag ricultural Univ er sity
Vo l. 22　 No. 2
Jun. 2001
文章编号: 1009- 3575( 2001) 02- 0052- 05
RAPD在油用向日葵自交系鉴定和
遗传分析中的应用
王茅雁 1 ,　张海明 2 ,　李德军 2 ,　张树军1
( 1.　内蒙古农业大学生物工程系 ,呼和浩特　 010018　 2.　中国农业大学 ,北京　 010010)
摘要:　利用 RAPD标记对 8个油用向日葵自交系进行了鉴定和遗传分析。 从 40个 UBC引物中筛选出 12个能
产生稳定遗传多态性的引物 ,利用其中 3个引物提供的 RAPD标记可将 8个自交系逐一加以鉴别。 12个引物对 8
个自交系共扩增出 41条带 ,其中 39条 (占 95. 1% )具有多态性 ,每个引物可扩增出 1～ 7条带 ,平均为 3. 4条带。不
同自交系之间的 RAPD遗传距离在 0. 13～ 0. 85之间 ,平均为 0. 42。按 UPGM A方法可将 8个自交系聚为 2大类、
4个亚类。
关键词: 　油用向日葵自交系 ;　 RAPD;　鉴定 ;　遗传距离 ;　聚类分析
中图分类号: 　 S565. 5　　文献标识码:　 A
APPLICATION OF RAPD TO IDENTIFICATION AND
GENETIC ANALYSIS OF OIL SUNFLOWER INBRED LINES
WANG Mao- yan,　 ZHANG Hai- min,　 LI De- jun,　 ZHANG Shu- jun
( Dept. of Bio tech no lo gy , Inner Mongo lia Ag ricultural Unive rsity )
Abstract: 　 The identification and genetic analysis o f 8 oil sunf low er inbred lines w ere car ried out by using
RAPD markers. 12 effectiv e primers w ere selected f rom 40 arbi t rary, 10- mer primers, and acco rding to the
RAPD markers produced by 3 o f these primers, all the inbred lines could be identified respectiv ely. of the
12 primers tested against the 8 genotypes, a to tal o f 41 bands were ampli fied, among which 39 ( 95. 1% )
w ere polymorphic. Th e products ampli fied by each primer ranged from1～ 7, wi th an average of 3. 4. The
genetic distance betw een two arbi t ra ry inbred lines ranged from 0. 13～ 0. 85, wi th an average of 0. 42. The
8 inbred lines could be divided into 2 g roups by using U PGM A cluster analy sis, and each g roup could be
divided into 2 subg roups.
Key words:　 oi l sunf low er inbred lines;　 RAPD;　 identification;　 genetic distance;　 cluster analy sis
油用向日葵是世界和我国的重要油料作物 ,利用杂种优势是提高其产量的主要途径 [ 1]。多年来。由于实
验方法和技术的限制 ,使对油用向日葵自交系的鉴定和遗传分析停留在形态学、细胞遗传学和同工酶水平 ,
从而影响了对杂交亲本的选配和杂交育种的效率。 近几年来 ,随着多种分子标记技术日趋成熟 ,使从 DNA
水平上直接对油用向日葵自交系进行鉴定和遗传分析成为可能。 在已经建立的 DNA分子标记技术中 ,
RAPD( random ampolified polymo rphic DN A)具有操作简便、省时、灵敏度高和费用低等优点 ,目前已被广
泛应运于许多种作物的遗传多样性分析、种质资源鉴定和遗传距离测定及类群划分等方面 [ 3, 4, 5, 6]。在国外 ,
收稿日期: 　2001- 01- 15作者简介: 　王茅雁 ( 1961- ) ,女 ,副教授 ,硕士 ,从事农业生物技术的研究 .
应用 RAPD对向日葵进行类似研究的报道很多 [ 9, 10, 11, 12 ] ,而在国内却很少。季静等用 RAPD技术对向日葵细
胞质雄性不育核恢复基因 [ 2]及恢保关系进行了研究 [8 ] ,但尚未见有用 RAPD对油用向日葵自交系进行鉴定
和类群划分的报道。本试验对目前我国有代表性的 8个油用向日葵自交系进行了 RAPD分析 ,试图寻找它
们的特异 RAPD标记 ,估算它们之间的 RAPD遗传距离并进行类群划分 ,为油用向日葵自交系的鉴定和杂
交亲本的选配提供分子证据。
1　材料与方法
1. 1　植物材料　 8个油用向日葵自交系均由内蒙古
天葵经济作物研究发展中心提供 ,具体编号见表 1。
1. 2　 DNA的提取　取幼嫩叶片约 1g ,参照王关林的
表 1　 8个油用向日葵自交系的编号
编号 自交系　　　 编号 自交系　　　
1 W- 96- 311 5 TUB340
2 W- 96- 329- 3 6 RHA- 274- 3
3 W- 96- 320- 4 7 W- 96- 313- 3
4 8603- 12412121- 1 8 DK3840- 2112- 1
SDS方法 [7 ]提取基因组 DNA,最后用灭菌的 ddH2O溶解 , - 20℃保存备用。
1. 3　 PCR扩增及其产物鉴定　 RAPD反应在 9801- 型 DNA扩增仪上进行。 25μl反应体系中含 Tris-
CL10mmol / l, KCL50mmo l /l, Mg CL2 2. 5mmo l /l, dN TPs各 0. 35mmo l /l (购于华美生物工程公司 ) , U BC
( Univ ersity o f Bri tish Co lumbia, Vancouver, Canada)引物 16. 5ng,模板 DNA 50ng , TagDN A聚合酶 (华美
生物工程公司生产 ) 2U,上覆 20μl液体石蜡油。扩增反应程序为: 94℃预变性 4min,然后再按 94℃变性 40s,
37℃复性 50s, 72℃延伸 1min30s扩增 35个循环 ,最后在 72℃延伸 10min。扩增产物用 1. 4%琼脂糖凝胶电
泳分离 ,经溴化乙锭 ( EB)染色后在紫外检测仪上观察照相。 PCR扩增反应重复 1～ 2次。
1. 4　数据处理　 RAPD扩增产物以 0、 1统计建立数据库 ,在相同迁移位置上有带记为 1,无带记为 0。 按
Nei的方法计算自交系间的相似系数 GS: GS= 2N i j /(N i+ N j ) ,其中 N ij为 2个自交系共有的扩增带数 ; Ni、
N j为两个自交系分别拥有的扩增带数。自交系间的遗传差异用遗传距离 GD= 1- GS衡量 ,然后利用 GD值
按不加权成对群算术平均法 ( U PGM A)进行聚类分析。
2　结果与分析
2. 1　 8个油用向日葵自交系的 RAPD多态性
在 40个引物中有 28个引物可对 8个油用向日葵自交系产生扩
增结果 ,其中扩增条带清晰、并且能产生稳定多态性的引物有 12个
(占 42. 9% ) ,本论文选用它们的扩增结果进行 RAPD分析
(见表 2)。
12个引物对 8个自交系共扩增出 41条带 ,不同引物的扩增带
数为 1～ 7条 ,每个引物平均产生 3. 4条 ,扩增片断长度大多在 300
～ 2 400bp之间。每个自交系产生的条带数为 6～ 28条不等。在全部
41条扩增带中 ,有 39条为多态性带 ,占总带数的 95. 1% ,有 18条为
表 2　 12个引物对 8个自交系的扩增结果
引物名称 引物序列 扩增带数
UBC506 CCTT TCCCGA 1
UBC508 CGGGGCGGAA 2
UBC509 ACAGAGAC TG 2
UBC511 GAATGGTGAG 4
UBC514 CGGTT AGACG 3
UBC516 AGCGCCGACG 7
UBC519 ACCGAACACT 5
UBC523 AC AGGCAGAC 1
UBC527 CT TCAACGTG 6
UBC533 GCATCTACGC 4
UBC535 CCACC AACAG 3
UBC536 GCCCC TCGTC 3
单个自交系所特有 ,占总带数的 43. 9% 。这些结果表明 ,在 8个自交系之间存在很丰富的 RAPD多态性。
2. 2　 8个油用向日葵自交系的特异 RAPD标记及鉴定
比较 12个引物的 RAPD图谱可以看出 , 8个自交系的 RAPD标记之间都存在差异 ,利用其中 3个引物
提供的 RAPD标记可将 8个自交系一一加以鉴别。在引物 UBC516的 RAPD图谱 (见图 1)中 ,自交系 1、 2、
3均没有带 ,自交系 6、 7、 8均有 3条带 ,而自交系 4除有 1条分子量约 1 713bp的带外 ,特异性缺少其它带 ,
自交系 5却有 4条带 ,其中 2条带为特有 ,分子量分别约 1808bp和 1581bp。因此 ,利用引物 UBC516可以
鉴定自交系 4与 5。引物 UBC527可以鉴定自交系 1、 2、 3和 7,在该引物的 RAPD图谱 (见图 2)中 ,自交系 5、
6、 8均有 3条相同的带 ,而自交系 1有 4条带 ,共中 1条为分子量约 588bp的特异性带 ,自交系 2有 2条分子
量分别约 515bp和 357bp的特异性带 ,自交系 3没有带 ,自交系 7只有 1条分子量约 1 027bp的带 ,特异性
缺少其它带。自交系 8在引物 UBC536的 RAPD图谱中有 2条带 ,其中 1条为分子量约 686bp的特异性带 ,
很容易与其它自交系相区别 (见图 3)。自交系 6的鉴定稍复杂一些 ,需比较 UBC536与 UBC527 2个引物的
53第 2期　　　　　　　　　王茅雁等: 　 RAPD在油用向日葵自交系鉴定和遗传分析中的应用
RAPD图谱。在 UBC536的 RAPD图谱中 ,自交系 6和 7有 2条相同的带 ,其中 1条为分子量约 1 184bp的
特异性带 ,可与其它自交系相区别 ,而在引物 UBC527的 RAPD图谱中 ,自交系 7又可与自交系 6相区别。
因此 ,利用引物 UBC536 /U BC537可以鉴定自交系 6。
图 1　引物 UBC 516对 8个自交系扩增的 RAPD图谱
图 2　引物 UBC 527对 8个自交系扩增的 RAPD图谱
1～ 8为 8个自交系的编号　 M代表 DN A分子量标准 ,自上而下依次为 1 543、 994、 697、 515和 377bp ,下同
箭头所示为自交系的特异性　 RAPD标记
图 3　引物 UBC 536对 8个自交系扩增的 RAPD图谱
遗传距离 ( GD)
图 4　 8个油用向日葵自交系的 RAPD遗传距离聚类图
表 3　 8个自交系之间的 RAPD遗传距离矩阵
自交系 1 2 3 4 5 6 7 8
1 0. 00 0. 13 0. 25 0. 67 0. 42 0. 30 0. 41 0. 40
2 0. 00 0. 25 0. 44 0. 60 0. 36 0. 42 0. 46
3 0. 00 0. 72 0. 85 0. 56 0. 60 0. 64
4 0. 00 0. 32 0. 23 0. 34 0. 34
5 0. 00 0. 37 0. 41 0. 45
6 0. 00 0. 20 0. 19
7 0. 00 0. 34
8 0. 00
2. 3　 8个油用向日葵自交系之间的遗传距离和聚类分析
为了分析 8个油用向日葵自交系之间的遗传差异 ,利用所得 41个 RAPD标记计算了不同自交系之间
54 内 蒙 古 农 业 大 学 学 报　　　　 　　　　　　　　 2001年
的遗传距离 ,结果见表 3。
从表 3可见 , 8个自交系之间的遗传距离在 0. 13～ 0. 85之间 ,平均为 0. 42,其中达到或超过此值的自交
系组合有 12个 ,占总数的 42. 9% ,看来在相当一部分自交系之间存在较大遗传差异。 8个自交系中遗传距离
最大的是自交系 3与 5,最小的是自交系 1与 2,自交系 3与其它自交系间普遍存在较大遗传差异。
为了进一步明确不同自交系之间的遗传关系 ,根据上述 RAPD遗传距离利用 UPGMA软件进行了聚
类分析 ,结果 (见图 4)显示 , 8个自交系可被划归为 A、 B两大类 ,每一大类又可分为 2个亚类 ,其中 A1亚类
包括自交系 DK3840- 2112- 1( 8)、 RHA- 274- 3( 6)、W- 96- 313- 3( 7)和 8603- 12412121- 1( 4) , A2亚
类只有自交系 5, B1亚类只有自交系 3,自交系 1和 2亲缘关系最近 ,同属于 B2亚类。
3　讨论
3. 1　 RAPD标记是在 DNA水平上检测基因组 ,它能反映不同基因组 DNA顺序的差异 ,而不受实验材料所
处的发育时期、取样部位和环境条件的影响。所以 , RAPD分析比依赖基因表达的形态学方法、种子贮藏蛋
白电泳和同工酶电泳等传统技术更能准确地揭示物种的遗传多样性 [5 ] ,已被成功地应用于许多物种的遗传
变异分析和品种、品系的鉴定等方面。本试验利用 3个 RAPD引物的扩增图谱可将供试的 8个油用向日葵
自交系逐一鉴定出来 ,类似的报道目前尚未见到。如果再结合从单粒种子提取 DNA的技术 ,本结果还可进
一步用来检验这些自交系的种子纯度。因此 ,本研究结果对于油用向日葵自交系的鉴定及种子纯度检验和配
制优质杂交种子来说具有重要实用价值。
3. 2　本研究利用 12个引物对 8个自交系共扩增出 41条带 ,与其它作物相比 ,虽然检测到的基因组位点数
不多 ,但其中有 95. 1%的扩增带在自交系间显示出多态性 ,这个数值是相当高的。进一步分析表明 ,不同自
交系间的遗传距离在 0. 13～ 0. 85之间 ,平均为 0. 42,在相当一部分自交系之间 ,尤其是自交系 3与多数自
交系之间存在较大遗传差异。根据 RAPD遗传距离 ,可将 8个自交系划分成 2大类 , 4个亚类。 这些结果为
油用向日葵自交系的类群划分和杂交亲本的选配提供了更准确可靠的信息和依据。
参　考　文　献:
[ 1]　钱建宁 ,赵林 .美国三系杂交油葵的开发与利用〔 J〕.云南农业科技 , 1996, 4: 29- 30.
[ 2]　季静 .运用 Bulked DNA- RAPD方法寻找向日葵细胞质雄性不育核恢复基因 Rf 1探针研究〔 J〕.中国科学 , C辑 ,生命科
学 , 1996, 4: 377- 384.
[ 3]　刘新芝 ,彭泽斌 ,傅骏骅等 . RAPD在玉米类群划分研究中的应用〔 J〕.中国农业科学 , 1997, 30( 3): 44- 51.
[ 4]　乔爱民 ,刘佩瑛 ,雷建军 .芥菜 16个变种的 RAPD研究〔 J〕.植物学报 , 1998, 40( 10): 915- 921.
[ 5]　张超良 ,孙世孟 ,金德敏 . RAPD技术在 12个玉米骨干自交系快速鉴定中的应用〔 J〕.作物学报 , 1998, 24( 6): 718- 722.
[ 6]　许明辉 ,郑明慧 ,刘广田 .烟草品种 RAPD分子标记遗传差异的研究〔 J〕.农业生物技术学报 , 1998, 6( 3): 281- 285.
[ 7]　王关林 .植物基因工程原理与操作技术〔M〕.北京: 科学出版社 , 1998, 598- 599.
[ 8]　季静 ,正罡 .向日葵 CMS恢保关系的分子遗传学研究〔 J〕.作物学报 , 1999, 25( 6): 683- 685.
[ 9]　 Law son W. R. et al. Genetic div ersity in sunflow er as r ev ealed by RAPD ana ly sis〔 J〕. Austr alian Journa l o f Ag ricultural
Resea rch. 1994, 45: 7, 1319- 1327.
[ 10]　 Aria s D. M. and Rieseber g L. H. , Genetic relationship among domestica ted and wild sunflow er〔 J〕. Economic Botany ,
1995, 49: 3, 239- 248.
[11]　 Dehmer K. J. and Friedt W. Development of molecular ma rker s fo r high o leic acid content in sunflow er〔 J〕. Special
Issue , Select Papers From th e Third European Symposium on Industria l Cr ops and Products , 1996, Par t, 2- 3.
[12]　 Law son W. R. e t al. Ma rker- assisted selection for two rust resistance genes in sunflow er〔 J〕. Molecular Breeding ,
1998, 4: 3, 227- 234.
55第 2期　　　　　　　　　王茅雁等: 　 RAPD在油用向日葵自交系鉴定和遗传分析中的应用