全 文 ：收稿日期:2005-07-11
作者简介:胡　俊(1962-),男 ,内蒙古人,副教授 ,主要从事细菌病害及其防治研究工作;刘正坪为通讯作者。
向日葵菌核病生防放线菌的分离
筛选及拮抗作用的初探
胡　俊1 ,刘正坪2 ,周洪友1 ,丁　俊1 ,宋　娟1
(1.内蒙古农业大学 农学院 ,内蒙古呼和浩特　010019;2.北京农学院植物科学技术系 ,北京　102206)
　　摘要:根据微生物间的拮抗作用 , 试从病地土壤中分离拮抗放线菌 , 探索利用放线菌对向日葵菌核病进行生物防
治的途径。从内蒙古呼和浩特市 、巴彦淖尔 、包头等地所采集的土壤中分离出 38 个放线菌菌株 ,经过平板拮抗作用初
测 ,有 8 个菌株(F-1 、F-3、F-6、F-8 、F-11 、F-15 、F-21、F-25)对向日葵核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)有拮抗作
用。选出其中2 个作用最明显的菌株(F-6 、F-8), 观察其在平板对峙培养中对向日葵核盘菌的抑制作用及其代谢产
物对向日葵核盘菌的作用。结果表明:F-6、F-8 菌株及其代谢产物对向日葵核盘菌均有明显的抑菌作用。 同时 ,
对F-6 、F-8 两菌株的培养性状和形态特征进行了初步观察。
关键词:向日葵;核盘菌;拮抗放线菌;代谢产物
中图分类号:S435.655　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2006)01-0096-04
Studies on Isolation and Screening of Antagonisticmycetes-fungus
and Its Antagonistic Effect for Sunflower Sclerotinia Rot
HU Jun1 ,LIU Zheng-ping2 ,ZHOU Hong-you1 ,DING Jun1 ,SONG Juan1
(1.Inner Mongolic Agricultural University ,Huhhot　010019 ,China;
2.Beijing Agricultural College ,Beijing　102206 ,China)
Abstract:We explored the way of biological control by isolating antagonisticmycetes-fungus from pathogenic soil for
Sclerotinia sclerotiorum.The result showed that 38 strains were isolated from soil samples derived from Huhhot ,Bayannao-
er and Baotou regions of Inner Mongolia.We observed that 8 strains ,named as F-1 ,F-3 ,F-6 ,F-8 ,F-11 ,F-15 ,
F-21 ,F-25 , displayed antagonisms against S.sclerotiorum on the PDA plate.F-6 and F -8 were selected to study
their inhibition to S.sclerotiorum growth and effects of their metabolic products on S.sclerotiorum of
sunflower.Meanwhile ,we examined the cultural and morphological characteristics of F-6 and F-8.Results showed that
F-6 ,F-8 and their metabolic products could inhibit S.sclerotiorum growth on the PDA plate.
Key words:Sunflower;Sclerotinia sclerotiorum;Antagonisticmycetes-fungus;Metabolic products
　　向日葵菌核病是一种世界性普遍发生的真菌病
害 ,也是向日葵最重要的病害之一。我国的东北 、内
蒙古 、山西和西北等地危害严重 ,1989年在内蒙古的
翁牛特旗重病地块发病率高达67.8%,个别地块甚至
绝产[ 1] 。该病可侵染向日葵根 、茎 、叶 、花盘各个部
位 ,造成植株整体或局部腐烂死亡。向日葵感染菌核
病菌后 ,产量下降 ,皮壳率增加 ,籽仁蛋白质及含油率
下降 ,发病后子粒失去了食用价值和商品价值 ,极大
影响了向日葵种植业的稳步发展 。引起向日葵菌核
病的病原菌为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum),属子
囊菌亚门核盘菌属[ 2 ,3] 。这种病菌形成能够顽固存
活于土壤的菌核 ,当温 、湿度条件适宜时菌核萌发产
生子囊盘 ,散发的孢子由气流传播构成初侵染源[ 4] ,
或萌发直接产生营养菌丝侵染寄主 ,这种流行的特
点给菌核病的防治带来了极大的困难 。对菌核存活
的生态学研究表明 ,土壤中的生物因子是影响菌核
华北农学报·2006 , 21(1):96-99
存活的主要因子 ,并已有报道表明 ,盾壳霉(Conio-
thyrium minitans)、木霉(Trichoclerma spp.)、粘帚霉
(Glioclaclium spp.)等是具有一定应用潜力的菌核寄
生菌[ 5 ,6] 。但在土壤中是否存在拮抗放线菌 ,它们
对向日葵菌核病抑制效果及机理如何做的工作较
少。本试验主要对病土中的放线菌做了分离 、筛选 ,
目的是为了寻求一种对向日葵菌核病更为有效的拮
抗放线菌 。
1　材料和方法
1.1　供试材料
1.1.1　土样　从呼和浩特 、包头 、巴彦淖尔等地的
向日葵地中采集 。
1.1.2　培养基　高氏改良一号(KNO3 1 g ,NaCl 0.5
g , K2HPO4 0.5 g , MgSO4·7H2O 0.5 g , FeSO4·7H2O
0.01 g ,可溶性淀粉 20 g ,琼脂 20 g ,水 1 000 mL , pH
7.2 ～ 7.4)。用前加入 3%的重铬酸钾(3.3 mL/L),
控制真菌的生长 。
1.1.3　供试病原菌　向日葵核盘菌 。
1.2　放线菌的土壤分离
分别取各地采集的土样各 1 g ,置于 10 mL 无菌
水中 ,振荡均匀 ,制成土壤悬浮液 ,抽取 1 mL 移入 9
mL无菌水中 ,依此类推 ,逐级稀释。分别取稀释度为
10-2 ,10-3的土壤悬液 1 mL 涂至高氏改良一号平板
上 ,25 ℃下培养。待长出菌落后 ,移至斜面内待筛选。
1.3　放线菌的筛选
挑选大小均匀的菌核 ,用 0.1%的升汞表面消
毒后 ,接入水琼胶平板中 ,在 25 ℃下进行培养 , 3 ～
5 d后 ,菌核萌发长出菌丝时 ,切取直径为 0.8 cm的
核盘菌菌饼 ,植入 PDA平板中央 ,在以菌饼为圆心 、
半径为3 cm的圆上 ,上下左右对称接入直径为 0.8
cm 的放线菌菌饼 ,培养 7 d后 ,观察抑菌效果。
1.4　抑菌圈的测定
将初筛得到的对核盘菌有抑菌作用的 8个菌株
(F-1 ,F-3 ,F-6 ,F -8 ,F-11 ,F-15 ,F-21 ,F-25)
在高氏改良一号平板上采用对峙培养法进行抑菌试
验 ,5 d后测量其抑菌圈直径 ,以后每隔1 d测 1次。
1.5　放线菌代谢产物对核盘菌的抑制作用
1.5.1　代谢产物的提取　将 F-6 ,F-8两菌株分别
接入高氏改良一号培养液中 ,在25 ℃,100 r/min的条
件下进行振荡培养。7 d后 ,将培养物用灭菌的 8层
纱布过滤 ,然后再将滤液经 5000 r/min离心30min ,取
上清液用孔径为0.22μm滤膜过滤 ,得到代谢产物。
1.5.2　代谢产物的抑菌试验　将直径为 0.8 cm 的
核盘菌菌饼接在 PDA 平板中央 ,在以菌饼为圆心 、
半径为 3.0 cm的圆上(上下 、左右对称)打出 4个直
径为 0.8 cm的孔洞 ,然后在孔洞中注入 0.05 mL 放
线菌的代谢产物 ,每个菌种设 3个重复。设不接菌
的高氏一号培养液为对照 ,7 d后 ,观察结果。
1.6　放线菌的培养性状 、形态观察
1.6.1　放线菌的培养性状观察　分别挑取 F -6 ,
F-8少量菌体置于 10 mL 无菌水中 ,振荡摇匀。然
后抽取0.5 mL菌悬液均匀涂抹于高氏改良一号平
板上 。25 ℃下培养 7 d后 ,分别观察并记载两菌种
的培养性状。
1.6.2　放线菌的形态观察　在培养皿中倒入约 30
mL的高氏改良一号培养基 ,然后将灭菌盖玻片以 45°
角斜插在培养基中 ,将放线菌F-6 ,F-8两菌株分别
接种在平板与盖玻片的接触处。培养 7 d后 ,将盖玻
片取出 ,用结晶紫染色 ,在显微镜下观察形态特征 。
2　结果与分析
2.1　放线菌的分离
从供试土样中共分离出 38株放线菌 。
2.2　拮抗放线菌的筛选
经平板拮抗试验 ,从供试的 38株放线菌中共筛
选出8个对向日葵核盘菌有抑制作用的菌株 ,分别
为:F-1 ,F-3 ,F -6 ,F-8 ,F-11 ,F-15 ,F -21 , F-
25。
2.3　抑菌圈的测定
经过初步筛选得到的 8个对核盘菌有抑制作用
的菌株 , 采用平板对峙培养 , 测定其对核盘菌
(S.sclerotiorum)的抑制结果 。抑菌圈测量结果见表
1 ,抑制效果见图 1。8个菌株中 F-6 ,F-8对核盘
菌的抑制作用最明显 ,两菌株最终抑菌圈直径分别
可达 28.3 mm和 22.5 mm;其次是 F-1 ,F -3 ,抑菌
圈直径为 19.6 mm 和 15.6 mm;效果最差的 F -25
菌株 ,抑菌圈直径也接近 10 mm 。
表 1　拮抗放线菌对核盘菌的抑制效果
Tab.1　Effect of inhibition of antagonisticmycetes-fungus
on S.sclerotiorum
时间(d)
Time
抑菌圈直径(mm)　Inhibition zone
F-1 F-3 F-6 F-8 F-11 F-15 F-21 F-25
7 20.9 17.1 30.3 24.6 16.3 13.5 12.8 11.6
9 20.6 16.6 29.1 24.0 15.6 12.9 12.1 11.0
11 20.1 16.3 28.5 23.6 15.2 12.5 11.6 10.8
13 19.8 15.9 28.8 22.8 14.8 12.1 10.9 10.2
15 19.6 15.6 28.3 22.5 14.3 11.6 10.4 9.6
1期 胡　俊等:向日葵菌核病生防放线菌的分离筛选及拮抗作用的初探 97　
图 1　拮抗放线菌 F-6 , F-8对核盘菌的抑制
Fig.1　Effect of inhibition of antagonisticmycetes-fungus F-6 and F-8 for S.sclerotiorum
2.4　拮抗放线菌代谢产物对向日葵核盘菌的抑制
作用
提取 F-6 ,F-8两菌株的代谢产物与向日葵核
盘菌(S.sclerotiorum)进行对峙培养 ,观察其抑菌效
果 ,抑菌圈测量结果见表 2 ,抑制效果见图 2。结果
表明 ,放线菌F-6 ,F-8的代谢产物对核盘菌均有
明显的抑制作用 。对峙培养 15 d时出现了两层抑
菌圈 ,内圈的直径分别为 25 mm和 20 mm ,外圈的最
终直径分别为 32 mm和 26 mm。抑菌内圈和外圈之
间部分气生菌丝稀薄 。
表 2　拮抗放线菌 F-6、F-8 代谢产物对
核盘菌的抑制效果
Tab.2　Effect of inhibition of the metabolite of antagonist
-icmycetes-fungus F-6 and F-8 on S.sclerotiorum
菌株
Strain
抑菌直径(mm)　Inhibition zone
7 d 9 d 11 d 13 d 15 d
F-6 34(30) 33(28) 33(26) 33(25) 32(25)
F-8 29(23) 29(22) 27(22) 26(20) 26(20)
　注:括号中的数字为抑菌圈的内圈直径
　Note:The number in the brackets is the diameter of inner cycle in bacteriostat cycle
图 2　拮抗放线菌 F-6 , F-8代谢产物对核盘菌的抑制效果
Fig.2　Effect of inhibition of the metabolite of antagonisticmycetes-fungus F-6 and F-8 on S.sclerotiorum
2.5　放线菌培养性状 、形态观察结果
2.5.1　放线菌的培养性状　F-6 ,F-8在高氏改良
一号平板上经过 7 d 的培养 ,得到放线菌的单菌落 ,
观察结果表明 ,F-6 ,F-8两个菌株的单菌落均为圆
形 ,表面粉末状 ,且边缘整齐 ,但菌落颜色不同 ,F-6
为橘红色 ,F-8为灰白色。
2.5.2　放线菌形态观察　插片法培养的放线菌经过
结晶紫染色后在油镜下观察。形态如图 3所示 。
F-6:孢子圆形 ,表面光滑 ,孢子丝为螺旋状 。直
径约为 0.35 μm。F-8:孢子圆形 ,表面光滑 ,孢子丝
为棍棒状 ,直径约为 0.5μm 。
98　 华　北　农　学　报 20卷
图 3　拮抗放线菌 F-6 , F-8 形态
Fig.3　Morphology of antagonisticmycetes-fungus F-6 and F-8
3　结论与讨论
从内蒙古巴盟 、包头 、呼和浩特等地向日葵菌核
病重病地采集的土样中 ,共分离出 38个放线菌菌株 ,
经过平板抑菌初测 ,其中 8个菌株对向日葵菌核病菌
有明显的抑制作用 ,其中 F -6 ,F -8抑制作用最明
显 ,抑菌圈直径分别可达 32 mm和 26 mm 。
放线菌 F-6 、F-8的代谢产物对向日葵核盘菌
也有明显的抑制作用 ,在试验过程中 ,每隔 2 d 测量
一次 ,发现抑菌圈出现了两层的现象 ,内圈以里无菌
丝生长 ,外圈以外产生茂密的气生菌丝 ,而内外圈之
间只产生基质菌丝而不产生气生菌丝或气生菌丝稀
薄 ,抑菌圈内圈的最终直径分别为 25 mm 和 20 mm ,
外圈的最终直径分别为 32 mm和 26 mm ,可能是由于
拮抗放线菌的代谢产物渗入培养基向外扩散而产生
的浓度梯度效应所致 。浓度向外逐渐减小 ,抑制效果
也逐渐变弱 ,使核盘菌生长过程中有了明显的差异 ,
距拮抗放线菌的代谢产物越远 ,气生菌丝生长越茂
盛 ,随着距拮抗放线菌的代谢产物的距离的缩小 ,气
生菌丝逐渐稀薄 ,直至完全不生长 。拮抗放线菌及其
代谢产物对菌核菌的生长是如何起抑制作用的 ,是否
引起菌丝形态异常等 ,未作详细观察 ,有待进一步研
究。
据资料报道 ,造成生防放线菌抑菌效果不稳定的
因素有多方面 ,如寄主 、病菌 、生防菌本身的毒力退化
问题以及土壤内各种微生物间相互作用等 ,其中毒力
退化问题是最主要的因素[ 11] 。为了使生防放线菌得
到大规模的应用 ,必须了解其遗传变异性以及其代谢
产物对寄主植物 、土壤和其他有益微生物的作用。此
外 ,还需积极探寻有效方法 ,避免或减少其毒力退化。
有关资料表明 ,放线菌在抑制核盘菌过程中 ,真
正起作用的绝大部分是它产生的代谢产物或毒
素[ 12] 。所以 ,为更好的利用放线菌进行向日葵菌核
病的生物防治 ,我们还需对放线菌的拮抗机理进行深
入的研究 ,使其能在向日葵菌核病的现实防治中发挥
一定的作用。
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1期 胡　俊等:向日葵菌核病生防放线菌的分离筛选及拮抗作用的初探 99