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山西省欧李褐腐病病原菌鉴定



全 文 :西北农业学报 2015,24(4):101-104
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica  doi:10.7606/j.issn.1004-1389.2015.04.017
网络出版日期:2015-04-21
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20150421.2242.017.html
山西省欧李褐腐病病原菌鉴定
收稿日期:2014-09-03  修回日期:2014-12-29
基金项目:国家自然科学基金青年基金(31000873);山西农业大学中青年学术骨干基金(XG201210);山西省科技攻关
(20120311016-2)。
第一作者:郝晓娟,副教授,博士,从事植物病害生物防治研究。E-mail:xiaojuanhao@126.com
通信作者:王建明,教授,学士,主要从事分子植物病理学研究。E-mail:jm.w@sohu.com
郝晓娟1,周 芳1,李新凤1,王美琴1,王建明1,李俊林2
(1.山西农业大学 农学院,山西太谷 030801;2.山西省植保植检总站,太原 030001)
摘 要 为明确山西省欧李褐腐病病原菌种类,采用组织分离法、致病性测定、形态学鉴定及rDNA-ITS序列
测定对病原菌进行研究。结果显示,该菌在PDA培养基上菌落呈同心轮纹状,灰白或灰黄色,产孢丰富;分生
孢子梗较短,有分枝;分生孢子串生,无色,单胞,柠檬形或卵圆形,孢子大小为(7.5~20.0)μm×(7.5~11.5)
μm。经形态学鉴定为美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)。rDNA-ITS序列与 Monilinia fructicola
的同源性为100%,分子鉴定与形态学鉴定结果一致。
关键词 欧李;褐腐病;病原菌鉴定;美澳型核果链核盘菌
中图分类号 S435.32   文献标志码 A     文章编号 1004-1389(2015)04-0101-04
Pathogen Identification of Brown Rot of
Cerasus humilis(Bge)Sok.in Shanxi
HAO Xiaojuan1,ZHOU Fang1,LI Xinfeng1,
WANG Meiqin1,WANG Jianming1 and LI Junlin2
(1.Colege of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China;
2.General Station of Plant Protection and Quarantine,Taiyuan 030001,China)
Abstract The pathogen of Cerasus humilis(Bge)Sok.brown rot in Shanxi province was isolated and
identified by tissue isolation,pathogenicity test,morphological characters and rDNA-ITS sequence
analysis.The colony of isolate was grey,concentric rings and sporulation were abundant.Conidio-
phores were short and branched.Conidia were in chain,hyaline,unicelular,lemon-shaped or ovate,
(7.5-20.0)μm×(7.5-11.5)μm.The results showed that the pathogen was Monilinia fructicola.
rDNA-ITS sequence showed 100%identity with Monilinia fructicola.The molecular identification
indicated the same results as morphology identification.
Key words Cerasus humilis(Bge)Sok.;Brown rot;Pathogen identification;Monilinia fructicola
  欧李[Cerasus humilis(Bge)Sok.]果实含
有多种维生素、氨基酸和矿质元素,果实成熟时富
含水溶钙和磷酸钙,易被人体吸收[1],每100g鲜
果中含钙量高达60mg[2],因此又被称为“钙果”。
欧李不仅含钙量高,铁锌硒等微量元素含量也是
其他水果的几倍至十几倍[3]。作为营养价值极高
的一种水果,除鲜食外,欧李果实还可加工成果
酒、蜜饯、果酱等多种产品,极具开发前景。至
2012年,山西省欧李种植面积达200hm2 左右,
实际挂果或采果面积约占总面积的75%,年总产
量2 000t左右[4]。杜俊杰等[4]认为,山西省欧李
生产中面临的主要病害是褐腐病。褐腐病是核
果、仁果类植物的重要病害,引起褐腐病的病原菌
主要有核果链核盘菌(Monilinia laxa)、果生链
核盘菌(Monilinia fructigena)和美澳型核果链
核盘菌(Monilinia fructicola)[5]。病原菌的有性
态属于链核盘菌属(Monilinia),无性态为丛梗孢
属(Monilia)。徐成楠等[6]报道,引起辽宁省欧李
褐腐病的病原菌为M.fructicola,该菌在中国被
列入检疫名录[7]。目前,对山西省欧李褐腐病病
原菌的种类尚缺乏研究,为此本研究对山西省采
集到的欧李褐腐病病果进行病原菌分离鉴定。
1 材料与方法
1.1 症状观察与病原菌分离
于2012年8月从山西省欧李种植区采集具
有典型症状的发病果实,观察记录症状特点。将
病果带回实验室进行常规分离及单孢纯化[8]。
1.2 病原菌形态鉴定
形态鉴定参照Lane[9]的方法进行。将分离
物在PDA培养基上于22℃光暗交替培养,观察
培养性状。显微观察形态特征,并测量分生孢子
大小。
1.3 致病性测定[8]
将分离物孢子悬浮液喷于经表面消毒的健康
欧李果实表面,以无菌水作为对照,每处理重复
3次。接种后的果实置于培养皿,于2 5℃保湿
培养,记录发病情况并进行病原菌再分离。
1.4 病原菌特异引物扩增
采用改良CTAB法提取菌株DNA[10]。选用
Ioos和 Frey针对 M.fructicola、M.laxa、M.
fructigena设计特异引物(表1),对分离到的病
原菌进行PCR扩增[11]。20μL反应体系:10×
PCR Buffer 2μL,25mmol·L
-1 MgCl21.2μL,
10mmol·L-1 dNTP 0.4μL,模板DNA 1μL,
5U·μL
-1 Taq 酶 0.2μL,引物各 1μL(10
mmol·L-1),超纯水13.2μL。反应条件:94℃
预变性3min,94℃变性30s,62.5℃退火30s,
72℃延伸1.5min,共30个循环,最后72℃延伸
10min。10g·L-1琼脂糖凝胶电泳检查扩增结
果。扩增产物测序后,将测得序列在GenBank核
酸数据库中进行比对,并采用 MEGA软件构建
系统发育树。
2 结果与分析
2.1 病害症状
山西省欧李褐腐病始发于8月中下旬,9月
上中旬达到发病高峰,各品种欧李果实均可发病。
果实在成熟期受害严重。发病初期,在果面上形
成浅褐色水渍状圆形病斑,之后病斑蔓延扩展,果
肉变褐软腐,病部产生灰色绒球状霉层(图1-A)。
最后病果大部分或完全腐烂(图1-B),易脱落,或
表1 特异引物名称和序列[10]
Table 1 Names of specific primers and its sequences
种名
Species
特异引物名称
Names of specific primers
特异引物序列 (5′→3′)
Sequences of specific primers(5′→3′)
美澳型核果链核盘菌 M.fructicola  ITS1Mfcl  TATGCTCGCCAGAGGATAATT
ITS4Mfcl  TGGGTTTTGGCAGAAGCACACT
核果链核盘菌 M.laxa  ITS1Mlx  TATGCTCGCCAGAGAATAATC
ITS4Mlx  TGGGTTTTGGCAGAAGCACACC
果生链核盘菌 M.fructigena  ITS1Mfgn  CACGCTCGCCAGAGAATAACC
ITS4Mfgn  GGTGTTTTGCCAGAAGCACACT
  A.灰色绒状霉层 Greyish spores;B.果实软腐 Soft rot of fruit;C.僵果 Infected fruits eventualy turn into shriveled,black
mummies
图1 欧李褐腐病田间症状
Fig.1 Symptoms of Cerasus humilis(Bge)Sok.brown rot in field
·201· 西 北 农 业 学 报 24卷
干缩成僵果悬挂枝上经久不落(图1-C)。
2.2 病原菌分离及形态鉴定
分离获得的菌株在PDA上菌落为圆形,颜
色初为灰白色,逐渐变为灰黄色,菌落呈同心轮纹
状(图2-A),产孢量丰富。分生孢子梗较短,具有
分枝,顶端串生分生孢子(图2-B)。分生孢子芽
生,链状排列(图2-B),无色,单胞,柠檬形或卵圆
形,有些顶端具有平截面。孢子大小为(7.5~
20.0)μm×(7.5~11.5)μm。经形态学鉴定为
美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola)。
2.3 致病性测定结果
对欧李健康果实进行回接,接种3d后显症,
症状特点与田间症状相同(图3),对照不发病。
再分离获得的菌株与接种菌株相同。
  A.培养7d后菌落形态 Colony morphology;B.产孢梗及孢子链(100×) Conidiogenous structure and conidia chain(100×)
图2 病原菌形态特征
Fig.2 Morphological characteristics of pathogen
图3 致病性测定
Fig.3 Pathogenicity test of isolate in lab
2.4 病原菌特异引物扩增结果
在供试菌株中未扩增出M.laxa、M.fructi-
gena的特异引物条带,M.fructicola特异引物扩
增出1条大小约为350bp的特异性片段(图4)。
测 序 后 将 序 列 提 交 至 GenBank,登 录 号 为
KC848461。系统发育分析表明,在以 Ciboria
shiraiana(登录号为 HQ833461)为外群构建的系
统发育树中(图5),供试菌株与Monilinia fruc-
ticola USFQBV T04菌株(登录号为JX878906)
归于同一分支,同源性为100%。ITS序列分析
证明,山西省欧李褐腐病菌为 Monilinia fructi-
cola,与形态学鉴定结果一致。
  M.Marker;1.M.fructicola特异引物ITS1Mfcl/ITS4Mfcl
 ITS1Mfcl/ITS4Mfcl,M.fructicolaprimer pair;2.M.laxa特
异引物ITS1Mlx/ITS4Mlx ITS1Mlx/ITS4Mlx,M.laxa primer
pair;3.M.fructigena 特 异 引 物 ITS1Mfgn/ITS4Mfgn 
ITS1Mfgn/ITS4Mfgn,M.fructigenaprimer pair
图4  特异引物扩增结果
Fig.4 Polymerase chain reaction(PCR)products
obtained using the specific primers
3 结论与讨论
引起褐腐病的3个种的关系相近,在鉴定上
主要根据培养和形态学性状及分子生物学等方面
的特征。Lane[9]认为,M.fructicola菌落颜色一
般呈灰色或灰黄色,产孢丰富,通常会产生同心轮
纹状孢子堆,菌落不呈莲座状。但在实践中,仅依
·301·4期 郝晓娟等:山西省欧李褐腐病病原菌鉴定
图5 基于rDNA-ITS基因序列构建的欧李褐腐病菌
(GenBank登录号为KC848461)系统发育树
Fig.5 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS gene sequences
of Cerasus humilis(Bge)Sok.brown rot pathogen
(sequence ID:KC848461)and related fungi
据经典的形态学特征,往往难以完全将3个种区
分开[12]。为快速鉴定 M.fructicola,发展出多
种分子检测方法,樊锦艳等[12]、Zhu等[13]经过对
多种分子鉴定方法的比较,均认为Ioos等[11]的检
测方法适用于鉴定 M.fructicola,本研究采用
Ioos等报道的引物对山西省欧李褐腐病菌进行
鉴定。结合培养性状、形态学特征和rDNA-ITS
序列,将山西省欧李褐腐病菌鉴定为美澳型核果
链核盘菌(Monilinia fructicola),这是M.fruc-
ticola在山西省为害的首例报道。
M.fructicola主要分布于美洲、大洋洲及亚
洲一些国家,中国和欧盟都将其列为检疫对
象[7,14]。2001年以来,陆续在法国、捷克、西班
牙、瑞士等国家出现该菌侵染为害的报道[15-18],为
此欧盟将其从A1类检疫对象改为A2类[14]。近
年来,中国也陆续出现该菌为害的报道。2005
年,Zhu等[19]首次报道在中国北京引起桃褐腐病
的病原为 M.fructicola。2011年,Zhu等[13]对
来自北京的367株褐腐病菌进行种群结构研究,
发现M.fructicola占供试菌株的95.6%。这些
结果提示中国的褐腐病菌种群结构正在发生变
化,或者预示着中国褐腐病菌的种群结构比以往
认知的更为复杂[13]。
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