全 文 ：28　 草　业　科　学 23卷 9期
9 /2006 PRAT ACULT URA L SCIENCE Vol. 23 , No. 9
牧草研究 扁穗牛鞭草 RAPD影响因素的研究　　
陈福1 , 2 ,范 彦2 ,秦 华1
(1. 西南大学园艺园林学院 ,重庆 400716;2. 重庆市畜牧科学研究院 ,重庆 400039)
摘要:以扁穗牛鞭草 Hemarthria comp ressa 基因组 DNA 为模板 , 通过单因子试验分别研究了 RAPD反应
体系中主要成分:Mg2+浓度 、dNTP 浓度 、引物浓度 、模板浓度 、TaqDNA 聚合酶用量以及 BSA 浓度对
RAPD - PC R扩增的影响 ,找出各自的最适条件 , 建立了适合扁穗牛鞭草的 RAPD 反应体系:在 25 μL 反应
体系中 ,内含 1 ×PCRbuffer、1. 5 ～ 2 mmo l /L Mg 2+ 、150 μmo l /L dNTP、20 ng 引物 、40 ng 模板 、1 U
TaqDNA 聚合酶。
关键词:扁穗牛鞭草;RAPD;反应体系
中图分类号:S543+. 9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2006)09-0028-05
　扁穗牛鞭草 Hemarthria compressa 又名牛
仔草 、马鞭梢 、扁担草 ,是禾本科牛鞭草属多年生
草本植物 。它具有适应性强 、抗逆性好 、生长快 、
产量高 、营养丰富等特点 ,主要分布在广东 、广西 、
福建 、云南 、四川等省(区),是一种很有发展前途
的优质高产饲料作物和水保植物。目前对扁穗牛
鞭草的研究主要集中在牧草的品质 、生物特性以
及栽培管理等方面[ 1 , 2] ,对扁穗牛鞭草种质资源
遗传多样性的研究也仅仅局限于一些简单的表型
上 , 如形态特征 、农艺性状等方面[ 3 , 4] ,采用分子
标记研究其遗传多样性在国内外尚属空白。因
此 ,利用分子标记对扁穗牛鞭草天然群体遗传结
构 、遗传分化及多样性进行研究 ,为合理保护 、利
用与开发扁穗牛鞭草遗传资源提供分子水平上的
科学依据 。
随机扩增多态性 DNA(random amplif ied
po lymo rphic DNA ,简称 RAPD)技术是 1990 年
由Williams[ 5] 和Welsh[ 6] 2个研究小组几乎同时
发展起来的一项 DNA 多态检测技术。自诞生以
来 ,便以其操作简便 、灵敏快速 、费用低廉 、安全准
确倍受分子生物学家的关注 ,已被广泛应用于植
物的遗传图谱构建 、遗传多样性检测 、亲缘关系分
析 、品种纯度鉴定等方面的研究[ 7-10] 。但 RAPD
是基于 PCR的一种标记 ,对反应条件非常敏感 ,
其最佳扩增条件在不同物种中各有不同 ,因此为
了获得重现性 、可靠性均较高的图谱 ,在对扁穗牛
鞭草进行 RAPD分析时 ,完全有必要对各因子的
最佳反应条件进行探索 ,建立稳定的反应体系。
1　材料和方法
1. 1 材料　扁穗牛鞭草采自重庆市畜牧科学研
究院樵坪实验基地 ,取幼嫩叶片洗净 、晾干 ,冻
于- 80 ℃超低温冰箱中备用 。
1. 2 试剂　10 mer 随机引物(Opron)、Taq 酶
(promega)、dN TP(promega)、λ- EcoT14 I di-
gest DNA M arker (TakaRa)、CTAB (Amres-
co)、PVP (Sigma)、β -疏基乙醇(Sigma),其余为
国产分析纯试剂。
1. 3 扁穗牛鞭草基因组 DNA 的制备　取
1 g 扁穗牛鞭草幼嫩叶片用改良的 CTAB法提取
基因组 DNA ,以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,结果
如图 1 所示:带型整齐一致 ,呈 1条明显的单带 ,
背景浅 ,点样孔无 EB吸收 。表明 ,多糖 、RNA 去
除干净 ,无 DNA 的降解 。经全自动分光光度计
SmartSpecTM 3000 检测 , A260 /A280 为 1. 80 左
右 , 说明样品的纯度较高 。将样品稀释为 40
ng /μL ,用于 RAPD分析。
1. 4 DNA 扩增 　PCR 扩增在 TaKaRa PCR
Thermal cycler Dice M odel No. TP600扩增仪上
进行 。参照常规的 PCR反应中各成分的含量 ,将
收稿日期:2005-06-06
作者简介:陈福(1965-),男 , 重庆人 ,助理研究员 , 在读
硕士生 ,主要从事牧草研究。
E mai l:17837@163. com
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扁穗牛鞭草 RAPD 影响因素探索的初始反应体
系确定为:反应总体积 25 μL ,内含 1×PCR buf f-
er 、MgCl2 1. 5 mmo l /L 、dNTP 200 μmo l /L 、引物
40 ng 、模板 40 ng 、Taq酶 1 U 。根据预试验的结
果 ,以 SBSH4 为引物 ,对扁穗牛鞭草 RAPD反应
体系中 5种主要成分(Mg 2+浓度 、dN TP 浓度 、引
物浓度 、模板浓度 、酶单位)及牛血清白蛋白(bo-
vine serum albumin ,BSA)分别进行单因子试验 ,
每个合适条件确定后作为后续研究的 1个条件。
梯度设置见表 1。 图 1　扁穗牛鞭草基因组 DNA
表 1　扁穗牛鞭草 RAPD - PCR反应各影响因子的梯度设置
因子 梯度
Mg2+浓度(mmol / L) 0. 5 , 1 , 1. 5 , 2 , 2. 5 , 3 , 4 , 5
dNTP 浓度(μmo l /L) 20 , 50 , 100 , 150 , 200 , 250 , 300 , 400
引物浓度(ng) 10 , 20 , 40 , 60 , 80 , 100
模板浓度(ng) 0. 5 , 5 , 10 , 20 , 40 , 80 , 160 , 240 , 360 , 480
Taq DNA 聚合酶浓度(U) 0. 5 , 1 , 2. 5 , 3
BSA 浓度(μg /μL) 0 , 0. 5 , 1 , 2 , 3 , 4
　　扩增程序为 94 ℃预变性 5 min ,然后进行 35
个循环:94 ℃变性 30 s ,37 ℃复性 1 min ,72 ℃延
伸 1. 5 min ,循环结束后 72 ℃延伸 7 min , - 4 ℃
保存 。
1. 5 PCR 产物的检测 　扩增产物在 1. 5%
(w /v)的琼脂糖凝胶上电泳分离 ,电压不超过 5
V /cm 。当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿
2 ～ 3 cm时停止电泳 ,用 0. 5 μg /mL 的 EB 染色
15 ～ 30 min后 ,在 BIO - RAD GEL DOC 2000凝
胶成像系统上检测 、照相 、记录 。
2　结果与分析
2. 1 Mg2+浓度对 RAPD 图谱的影响 　
Mg 2+是影响 RAPD 扩增结果的一个重要因素 。
试验设置了 0. 5 ～ 5. 0 mmo l /L 共 8个梯度 ,扩增
结果如图 2所示:Mg2+浓度对扁穗牛鞭草 RA PD
扩增结果影响较大。当 Mg 2+浓度为 1. 5 和 2. 0
mmo l /L 时 ,扩增产物的条带数 、亮度基本一致 ,
背景清晰;随着 Mg2+浓度的降低 ,只能扩增出主
带 ,当 Mg2+浓度为 0. 5 mmol /L 时 ,未得到扩增
产物;而随着 Mg2+浓度的增加 ,背景加深 ,弱带增
加 , 主带逐渐模糊 , 当 Mg2+浓度增加到 4. 0
mmo l /L 时 ,条带数反而减少 , Mg 2+浓度为 5. 0
mmol /L 时只有极弱的扩增。因此 Mg2+浓度不
能过低或过高 ,根据扩增结果 ,Mg2+浓度以 1. 5 ～
2. 0 mmo l /L 为适。
图 2　Mg2+浓度对 RAPD图谱的影响
2. 2 dNTP 浓度对 RAPD 图谱的影响　在
PCR反应中 , dN TP 的一般使用浓度为 50 ～ 200
μmol /L。设定了从 20 ～ 400 μmol /L 共 8个浓度
梯度 ,如图 3所示:当 dN TP 浓度为 20 μmo l /L
时 ,条带极少;随 dN TP 浓度的增加 ,条带随之增
加 ,50 ～ 200 μmol /L 带型基本一致 ,只是有的带
增强 ,有的带减弱 ,但以 150 和 200 μmol /L 时扩
增效果最佳;当 dNTP 浓度高于 200 μmol /L 时 ,
条带减少;dN TP 浓度为 400 μmo l/L 时 ,未得到
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任何扩增 。结果表明 ,过多或过少的 dN TP 用量
均不利于 RAPD 扩增 ,从节约成本角度考虑 ,宜
采用 150μmol /L 的 dN TP。
图 3　dNTP浓度对 RAPD图谱的影响
2. 3 引物浓度对 RAPD 图谱的影响　设定
了从 10 ～ 100 ng 共 6个引物梯度 ,结果见图 4:引
物浓度为 10 ～ 80 ng ,带型基本一致 ,但扩增量有
所增加 ,非特异性扩增增强 ,背景不清晰;当引物
浓度为 100 ng 时 ,条带减少 。因此引物浓度不宜
过高 ,以 20 ng 效果最佳。
图 4　引物浓度对 RAPD图谱的影响
2. 4 模板浓度对 RAPD 图谱的影响　模板
的用量有个较宽的浓度适宜范围 ,设置了 10个模
板梯度 ,如图 5 所示:模板对牛鞭草 RA PD扩增
结果影响不显著。模板浓度过低(0. 5 ng),扩增
极弱;随着模板浓度的增加 ,扩增的条带数也随着
增加 ,在 20 ～ 240 ng 范围内均可得到稳定的 、带
型基本相同的指纹图谱 ,只是随着模板浓度的增
加 ,扩增的 DNA 量有所增加 ,背景也逐渐加深 。
综合考虑 ,以 20 和 40 ng 时条带最为清晰;模板
浓度过高时 ,有的带扩增减弱 。
2. 5 Taq酶用量对 RAPD 图谱的影响　一
般 RA PD - PCR反应中 Taq酶用量为 0. 5 ～ 5 U。
设定了从 0. 5 ～ 3 U 共 5个酶梯度 ,如图 6所示:
5个酶梯度下均有产物 ,但高于 1 U 时 ,非特性扩
增产物增加 ,足以形成背景。0. 5 U 的酶用量 ,带
少 ,扩增不稳定。综合扩增效果及成本的考虑 ,宜
采用 1 U 的酶单位用量。
图 5　模板浓度对 RAPD图谱的影响
图 6　Taq酶用量对 RAPD图谱的影响
2. 6 BSA 对 RAPD 图谱的影响　BSA 广泛
应用于减少 PCR反应系统中内源抑制物的干扰
作用 ,从而提高反应效果 。设定了 6 个 BSA 梯
度 ,结果如图 7所示:BSA 对扁穗牛鞭草 RAPD
分析无明显影响 。这说明BSA是通过与多酚化
图 7　BSA浓度对 RAPD图谱的影响
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合物作用 ,阻止其与 TaqDNA 聚合酶结合 ,从而
提高酶活性。而试验所提 DNA 无论是电泳检测
还是分光光度仪测定 ,其纯度均较好 ,因而 BSA
对 RAPD图谱的影响并不显著 。
2. 7 热循环参数对扩增结果的影响　此外 ,
还对扩增程序中的一些主要热循环参数进行了探
讨:94 ℃的变性温度下设置了 30 、40 、60 s 共 3个
时间梯度 ,结果表明:扩增的主带基本一致 ,考虑
到 94 ℃下变性时间过长 ,会影响酶的活性 ,变性
时间以 30 s 为宜;退火温度设置了 34 、37 、40 、
45 ℃共 4个梯度 ,34 ℃的退火温度下 ,扩增的条
带多而弱 ,40与 45 ℃特异性增强 ,但条带相对少
一些 ,相比之下 ,以 37 ℃得到的扩增结果最佳;循
环数设置了 30 、35 、40 、45次 ,各循环数下得到的
条型基本一致 ,但 30 次的循环数扩增量明显不
足 ,40 、45次扩增量显著提高 ,但非特异性增强 ,
背景加深 ,因此 35 次的循环数较适宜 。72 ℃下
延伸时间 60 ～ 120 s对条型无明显影响 ,试验选
用 90 s作为延伸时间 。
2. 8 扁穗牛鞭草 RAPD 反应体系的建立　
通过上述各反应条件的分析 ,建立了扁穗牛鞭草
RAPD - PCR扩增的反应体系 ,即 25 μL 反应体
系中 , 内含 1 ×PCRbuf fe r、1. 5 ～ 2. 0 mmol /L
Mg 2+ 、150 μmol /L dN TP 、20 ng 引物 、40 ng 模
板 、1 U T aqDNA 聚合酶 。运用上述优化反应体
系对引物 SBSH1 - 11进行筛选 ,如图 8所示:大
多引物均有清晰的扩增产物 ,说明所建反应体系
是适合扁穗牛鞭草 RAPD 分析的。用上述反应
体系对 16个不同生态型的扁穗牛鞭草进行遗传
多样性研究 ,能得到清晰 、稳定 、多态性较为丰富
的图谱 ,图 9所示为引物 SBSC6的扩增结果。
图 8　引物筛选
图 9　优化反应体系的扩增效果
3　讨论
RAPD是以 PCR反应为基础 ,反应体系中存
在多种成分 ,其中 Mg2+对 PCR扩增的特异性和
产量有显著的影响。Mg2+不仅能影响 Taq酶的
活性 ,还能影响引物与模板的结合效率 、产物的特
异性 、模板与产物的解链温度以及引物二聚体的
形成。浓度过高 ,出现非特异扩增 ,浓度过低 ,则
dNTP 本身要结合一部分 ,模板中的 EDTA 螯合
一部分 ,这样就没有足够的 Mg2+激活 Taq DNA
聚合酶的活性 ,最终使反应产物减少甚至失败 。
dNTP 作为 PCR反应的原料之一 ,直接影响
产物的产量 、特异性及合成的忠实性 ,因此 ,合适
浓度的优化十分重要 。dN TP 浓度过高 ,会导致
Taq酶的错误掺入;dNTP 浓度过低 , 又会降低
PCR产物的产量 ,甚至会因为 dN TP 的过早消耗
完 ,而使产物单链化。此外 , dN TP 能与 Mg2+结
合 ,使游离的 Mg 2+浓度降低 ,因此应通过试验确
定 Mg2+浓度与 dN TP 浓度之间的关系 。值得注
意的是 4种 dNTP 在使用时必须以等当量浓度配
制 ,若浓度不相同 ,则会诱发核苷酸的错误掺入 ,
降低使用效率 ,以至过早地终止延伸 。
RAPD - PCR对模板的要求并不严格 。一是
对纯度要求不严 ,二是模板用量低 ,理论上 102 ～
104拷贝的模板足可满足各种要求的 PCR反应。
一般认为 RAPD 的模板浓度在一定范围内
(0. 4 ～ 25 mmo l /L)并不会影响扩增条带的增减 ,
但对扩增产量有影响 ,模板浓度越高 ,扩增产量越
多[ 11] 。这一点在试验中也得到了证实 。
引物浓度不宜偏高 , 一般为 0. 1 ～ 0. 5
μmol /L[ 12] 。浓度过高一方面易引起错配和产生
非特异性扩增 ,造成扩增背量模糊 ,另一方面可增
加引物之间形成二聚体的机会。而浓度过低 ,则
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引物与模板的结合率低 ,扩增反应过早终止 ,从而
导致扩增图谱无产物 。
TaqDNA 聚合酶的用量也是影响 PCR 反应
的一个重要因素 。使用高浓度的 Taq酶不仅会增
加成本 , 而且易导致非特异性扩增产物的积
累[ 13] ;Taq酶用量过低则会导致产物的合成效率
下降。另外 ,不同厂家的 TaqDNA 聚合酶活性不
同 ,还需根据厂家的说明确定用量 。
热循环参数对扩增的影响也不容忽视。一般
情况下 ,93 ～ 94 ℃下变性 1 min足以使模板 DNA
变性 。退火温度与时间 ,取决于引物的长度 , 退
火时间一般为 30 ～ 60 s ,足以使引物与模板之间
完全结合 。循环次数决定 PCR扩增程度 ,一般的
循环次数为 30 ～ 40 次。PCR反应延伸常用温度
为 72 ℃,延伸反应的时间 ,可根据待扩增片段的
长度而定 , 一般 1 kb 以内的 DNA 片段 , 延伸
1 min是足够的。
总之 ,在严格筛选 RAPD 扩增中各种影响因
子的基础上 ,确定了适合扁穗牛鞭草 RAPD 分析
的反应体系:25 μL 反应体系中 , 内含 1 ×
PCRbuffer、Mg2+ 1. 5 ～ 2 mmol /L , dN TPs 150
μmol /L 、引物 20 ng 、模板 40 ng 、Taq酶 1 U 。
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Study on influencing factors of RAPD in Hemarthria compressa
CHEN Fu1 , 2 , FAN Yan2 , QIN Hua1
(1.College o f Hort iculture and Landscape , Southw est University , Chongqing 400716 , China;
2.Chongqing A nimal Husbandry Science Resea rch Insti tute , Chongqing 400039 , China)
Abstract:Based on the genomic DNA ex tracted f rom Hemarthria compressa , the main elements , i. e.
Mg 2+concentration , dN TP concentrat ion , prime r concentration , template DNA concentration , Taq
DNA polymerase dosage on RAPD - PCR amplif ication and BSA concentra tion were tested by single
facto r experiment , to determine thei r optimal levels respect ively. A reaction sy stem sui table fo r
H. compressa was established , that is , 25 μL amplifica tion react ions system containing 1×PCR buf f-
er 、1. 5 ～ 2 mmol /L Mg 2+ 、150μmol /L dN TP 、20 ng primer 、40 ng template DNA 、1U Taq DNA poly-
merase.
Key words:Hemarthria compressa ;RAPD;reaction system