全 文 ：2伏万 年第 6 期 植物检疫 P l流N T Qu AR ANT IN EV l o
.
19N o
.
6
P cR
一
F RP L鉴别假高粱和丝克高粱 ’
郭琼霞 黄可辉 虞 资
( 福建出入境检验检疫局 福州 35仪力 3 )(福建农林大学 )
l D一 a腼 f o呵 Um响~ n d a& 砒 勿 P R C-~ m e枷 d· Guon Qi o咖’ , uH anF跳h u i ’ , Y u Y u n , ( 1 . ujF i a n En t砰一 E石 t snI pec t i on an d Qu arn it n e B u o au , uF z h o u 35。汉) 3 2 . ujF ian A g -
ir e u l tu er an d oF er s lyt U
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A加t r a ct oT e s *abl i s h a mo le e ul ar me ht od fo r 击fe er n ti at ion of oS hgr o m ha l聊。 an d 5 . 51认 , P ol y -
m e o s e e h a i n er ac t i
o n · 。 s巨 e it o n 仓吧m e n t l e n gt h 卯l ym o甲址 s m an al y s i s was u s e d
.
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e r DNA
一
18 5
一
2 6 5
罗 n e was a m p l iif e d b y 印ec i 6 e irP m e o an d CP R p耐 u e st we o pu ifr e d , e lo n e d , s e叫 e n e de an d an a -
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. 明 I fl er s itr e it o n e n Z y me aws e h o s e n ba se d on het 二 s l ir e ti o n . 以p s of rD N A一 18 5一2 6 5 罗 ne Of 5 .
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bl as t e d as 5
.
ha l聊。 e an d 5 . 3滋 w e er de te e det i n ht e s ut d y , 5 . ha l啊砌e an d 5 . ; ilk e an be v is u al ly
di s ti n 即ihs e d ac e o汕 n g t o ht e el ce t哪h o二51 5 p a t e m : ht e fo u r 介吧m e n t s i n 18 l bP , 17 4 b p , 4 95 bP an d
6 9 b p we er ob se Vr
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,
P C R
一
R F廿
摘要 本文利用 PC R 特异引物扩增 rD N A一招 S一26 5 基 因 , 对 CP R 产物进行纯化 、 克隆和测
序 ; 分析假高粱与丝克高粱 rD NA 一 18 5一26 5 的酶切 图谱 , 选择合适 的限制性 内切酶对 两者 CP R
产物进行特异性切割 , 按照酶切片段的长度来区分两个近似种 。 被 明m 酶切后 ,假高粱被切
割为 67 4 b p 、 l科 bp 两个片段 , 而丝克高粱被切割成 18 l bP 汪 7 4冲 、钓 s bP 、 “ g b p 4 个片段 。 为建
立 PC R 一R F廿 分子鉴定方法有效地区分假高粱与丝克高粱这两个种提供依据 。
关键词 假高粱 丝克高粱 分子鉴别 CP R 产物酶切片段长度多态性分析
高粱属 ( so 砂 “ 。 )的假高粱 ( S , 肠肠呷肪e
( L
,
) eP 。 )是 世界性的恶性杂草 。 丝克高粱
( 5
.
s
ilk )是 so ghr ufn h a兔阵枷 x 5 . 二b“ gr hi i
的 lF 与 s . a 。 翔过`一。 杂交而成 。 由于丝克高粱生长速度快 ,抗逆性强 ,在国外被认为
是热带地区较理想的草地与饲料植物 [ ’ 」。 但
因丝克高粱是国家禁止人境的危险性有害杂
草 “ 假高粱 ” 的杂交种 ,其形态特征与其亲本
假高粱基本相同 , 尤其是丝克高粱的危害性
与假高粱相 似〔, 一 5」。 因此 , 采用分子标记方
法以区别假高粱 与丝 克高粱 的意义更为重
国家质量检验疫监督总局 2X() 2 年科技项 目
收稿日期 : 2以月 一 12 一 24
一 3 3 0 一
2印 5年第 6期 植物检疫 P L ANT QU AR AN” N EV l o. 19N o. 6
要 。
1材料与方法
1
.
1实验材料来源
本研究 以澳大利亚昆士兰州引进的丝克
高粱种子及从阿根廷进 口 大豆截获的假高粱
种子为实验材料 。
1
.
2D N A提取
取样 品 0 . 0 5 9, 经液氮 速冻后研磨至粉
末 , 加 人 50 拌U r E S ( 花 S : l o m m o l irT s ,
p H s
.
0
,
l o
n ol
EDTA
,
2 % S D S )
, 加 5 0 一 10 拌g
蛋白酶 K , 5 一 60 ℃ 温育 0 . 5 一 hl , 期间轻轻
摇动混匀 ;调节 N a C I 浓度至 1 . 4 I n 0 1/ L , 加 l /
10 体积 10 % CTA B , 65 ℃ 一。而 n ; 加人 l 体积氯
仿 :异戊醇 ( 24 : 1 ) ,轻摇混匀 ,于 。℃30 inr n ,之
后于 4℃离心 12 0( 刃 lr 而 n lo 而 n ;取上清 ,加人
2 5拌L s n l o l N氏 A C , 混匀 ,置于冰块 3 0而 n 以
上 , 4 ℃ 12 lX旧 lr 而 n 离心 10而 n ; 取上清 ,加 3拌L
nR as
e , 于 37 ℃ 巧而 n , 4℃ 12 《X刃 lr 而 n 离 心
10 而 n ;取 上 清 , 加 0 . 5 体 积 异 丙 醇沉淀
D NA
, 立 即 12《X旧lr 而 n 离 心 5而 n , 若 无 D NA
团出现 ,立即置样品于冰上 巧 一 30 而 n ;弃上
清 , 70 % 乙 醇 洗 沉 淀 2 次 , 干 燥 后溶 解 于
5如” , E 中 [6 } 。
1
.
3 rD N A
一
1 8 5
一
26 5 基因扩增
使用分别与 18 5 与 26 5 编码 区保守序列
互补的上游引物 : 18 S E : 5 ’ 一A C G AAT T C A TG G
CT C GG T G A A G TG T TC G 3’ 和 下 游 引 物
2 6 S E : 5
` 一
T AG A A T TC C C CG G TT C G C TC G
e e e T TA e
一
3
`
[7 1扩 增 nr N A一 15 5一肠s 基 因片
段 。 5 0拌廿C R 反应液 中含 5拌L 10 x CP R b谴 -
e r , l料功 o x dN , ( l o lnr o l l L )
, 引物 18 S E 、 26 S E
各 l拼L ( 10拌mol z L )
,
0
.
4仁L T a q 酶 ( S U I拌L ) , DN A
提取液 2拌L (约 s o n g/ 拌L ) , d d从 0 3 9 . 6拼L 。 反
应条件 : 94 ℃ 预 变性 3而 n , 94 ℃ 1而 n , 60 ℃
1而 n , 7 2℃ 2而 n , 35 个循环 ,最后在 72 ℃下延
伸 5而 n 。
1
.
4 纯化和克隆
所得到 的 rD N A 一 18 5一26 5 CP R 扩增 产物
的纯化与测序均由 BI O A S认 公司提供完成 。
1
.
5 序列分析
利用 DNA MNA V e sr i o n 5
.
0 软件 对假高
粱与丝克高粱 rD N A一 18 5 一26 5 基 因测序结果
进行序列比对 , 观察其碱基变异情况 。
1
.
6 限制性 内切酶的选择
根据碱基变异情况 , 寻找二者不 同的限
制性内切酶 , 根据限制性 内切酶 的位点识别
的特异性和酶切片段在琼脂糖凝胶电泳上的
分离程度 ,综合选择特异的限制性内切酶 。
1
.
7 利用限制性内切酶 胡1 的酶切反应
在 0 . s mL 的离 心 管 中加 人 8拌L rD N A -
15 5
一
2 6 5 基因扩增产物 , 2扛L l o x N E B 缓冲液 ,
0
.
2拌L一0 x B s A , dd氏 0 8 . 8拌L 以 及 内切 酶
1汕 。 将 反应 混合液置 于 37 ℃ 水 浴 中消 化
16 h 后取出 ,用 3 % 琼脂糖凝胶上电泳 , EB( 澳
化乙锭 )染色后于凝胶 成像处 理系统 ( G IS -
10以〕)上观察拍照 ,记录电泳结果 。
2 结果与分析
2
.
1 D N A 提取
本研究对假高粱 、丝克高粱 DNA 的提取
所获得 的 D N A 的纯度 ,即 2 60 n m 和 28 0 n m 的
紫外吸收值之 比 ( OD , lo D , )分别 为 1 . 7 60 、
一 95 6 , 质量浓度分别 为 34 n g l拼L 、 40 2 n g/ 仁L ,
符合 CP R 扩增要求 。
2
.
2 假高粱与丝克高粱的 rD N A一 1 85 一 2 65 基
因序列的差异
利用 DN AMAN Vesr ion 5 . 0 软 件 比对 假
高粱与丝克高粱 rD N A一 18 5 一26 5 基 因序 列显
示结果 为 : 假高粱 与丝克 高粱 的 rD N A 一18 .5
2 6 5 基因序列长度 (含引物 1S S E 、 26 S E )均为
8 5o b p
, 两者在第 18 6 b p ( C~ T ) 、 第 32 2 b p ( T一
e )
、 第 4 16 b p ( A ~ G ) 、 第 68 8坤 ( C ~ T ) 、 第
70 8 bP ( T~ )C 处有 5 个位点存在碱基差异 , 无
插人或缺失位点 。
2
.
3 限制性内切酶的选择
根据假高粱与丝克高粱 的 rD N A 一18 5一2 65
基因序列之间 5 个位点碱基差异的结果及限
一 3 3 1 一
2即 J 年第 6 期 植物检疚 P L AN T Qu ARA N竹N E VOI . 19 N o . 6
制性内切酶的识别位点的特异性 , 假高粱 与
丝克高粱的限制性内切酶的数量和频率上也
存在差异 。 根据已商品化的限制性内切酶与
其特异性 、 酶切片段的大小 、数量和这些限制
性 内切酶在琼脂糖凝胶电泳上分离的程度 ,
筛选出限制性内切酶 胡m (识别位点 : A 今
e RY贯 , 购自 N e w E gln an d B io加b s 公司 )作为
假高粱与丝克高粱的特异性鉴别标记 。
限制性内切酶 胡 m 对假高粱与丝克高
粱的限制性图谱分 析结果显 示 : 假 高粱第
186 帅 位 点 为 c , 该 位点 和其 前 几 个碱 基
( A C A犯 )所构成的基因片段与 胡 m 的识别
序列 A 令C R YG T 不一致 , 不能被 明 1 所识
别 ;而丝克高粱的第 186 坤 位点为 T ,此位点
与其前几个碱基 ( A CA TG )所构成的基因片段
与 胡 m 的识别序列相一致 , 可以被 胡 m 所
识别 ;假高粱与丝克高粱的第 67 6 b p一第 6 81 bp
序列的基因片断分别与 胡 m 的识别序列相
重合 ,此基因片段都可以被 解 1 所识别 。
.2 4 利 用限制性内切酶 胡 1 对假高粱和
丝克高粱的 rD N A 一18 5 一26 5 CP R 产物的酶切
图 1 假高粱和丝克高粱的
rD NA
一
18 5
一
26 5 墓 因的解 m 酶切图谱
M
·
10 如 D NA l a dd er , 1 . 丝克高粱 , 2 . 假高粱
根据丝 克高粱与假高粱的测序结果 显
示三它们的 rD NA 一 18 5 一26 5 基 因序列等长 , 均
为 85 0 b p 。 但被 解m 酶切后 ,前者被切割为
18 l b p
、
174 如 、 4 9 5如 、肠g b p 4 个片段 , 但是 , 由
于 18 1如 在 174 坤 两 个片段长度相近 , 在琼
一 3 3 2 一
脂糖凝胶 电泳 图上 只能看 到 l 条重合的条
带 。 因此 ,经 解 m 酶切后 , 丝克高粱在琼脂
糖凝胶电泳图上出现大小为 6 外 p 、 4 9b5 p 、 约
18 b0 p 共 3 条条带 。 而后者被 解 m 酶切后 ,
切割成 6 74 bp 、 174 b p 两个片断 , 可以从琼脂
糖凝胶电泳图上看到 6 74 bp 、 17 4 b p 大小的两
条条带 (图 l ) 。
3 讨论
目前 ,对假高粱及近似种 的研究多限于
形态解 剖特征及组织 细胞结构 等生物学特
性 。 这使在截获种子数量少或种 子不成熟 、
种子不完整情况下依靠形态学特征 、细胞学
特征来鉴定难度较大 。 因此 , 建立相对简便
的分子鉴别方法在应用研究和快速检测中具
有现实意义 。
高等植物中的 rD N A 是高度重复的串联
序列 单位 , 18 5 、 5 . 8 5 和 26 5 rD N A 联 结在一
起 , 作为一个转录单位 。 18 5一 26 5 rD N A 在植
物中有至数个位点 ,拷 贝数可达 5 0 一 4侧X旧。
它是由 18 5 、 5 . 85 和 2 65 rD N A 和位于三者之
间的基因 1巧 (内转录间隔区 )组成 , 其 中 n s
区被 5 . 8 5 rD N A 和所分隔成 1铭 1 和 1铭 2 两
个片段 , 而 18 5 、 5 . 8 5 和 26 5 r D NA 的序列又
非常保守 , 同时 ITS 在核基因组中高度重复 ,
且序列变异较快 ,位点内或位点间同步进化 。
因此 ,本研 究利用分别与 18 5 、 265 序列互补
的引物对 1巧 区进行 PC R 扩增 、 测序 , 比较不
同类群个体间序列大小和核昔酸组成 ;根据
序列差异 , 筛选 出限制性 内切酶 胡 m 作为
假高粱与丝克高粱的特异性鉴别标记 。 本研
究建立高粱属种类分子标记的鉴别方法 , 为
高粱属的分类鉴定提供方法和依据 。
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武汉江夏区出口嘉头种植
基地刺足根瞒的发生与危害 ’
胡浩纹 , 邓望喜 2 杨石城 ` 李建洪 2 展新辉 2 杨 豪 2
( 1
. 湖北出人境检验检疫局 武汉 43 侧 )22 2 . 华 中农业大学植物科学技术学院 )
o c c u n 限毗 a n d d . 翻 aI ge of R从oy lyP h us ec 为加oP us i n sca m曲 e x P 0 rt lP an at 廿on b ase in W u ba n .
H u H
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e n , , D e n g W an 翻 , , Y an g S hi e h e n g , , ` J ian h o n g , , Z han 刀hn u i , , Y a n g H ao , ( 1 . E n t砰 an d
丽 t in s ep e t ion an d 甲晚 nt i n e b u er au of uH be i , Wu h a n 4 30() 2 2 2 . C o l le罗 of p lant s e i e n e e an d ect h n o l o -
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A加 t ar c t hT i s p叩e r er p o ert d t hat al t he s e al i o n “ Ch i n . M e d ” was i n d u e e d 师 hR翻叮加h us hec 做明us
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.
K e y w o r ds cs al ion
,
hR 白珍 l翔h us ce ih 刀习p us , ib ol o gy , d a m ag e
摘要 武汉江 夏区 出 口蓖头种植基地 的蕊头 “ 发瘟 ” 是由重要的地下害蜻一刺足根蜻 的严
重危害引起 , 经一年 多研究表明该瞒 以成靖 、 若蜻及少数休眠体在 田 间地 下鳞茎上越冬 ; 以成
瞒 、 若蜻与幼蜻危害地下部分的鳞茎 、 须根 ,致使变褐腐败发 臭 , 分奠减少 , 导致地上部分叶片
瘦弱矮小枯黄 ,严重时凋萎死 亡 。 全年发生 10 ~ 12 代 , 世代重叠严重 。 9 月上旬蕊 头栽种 后 ,
刺足根蜻于 9 月下旬 一 10 月下旬及翌年 3 月下旬 一 5 月 中旬为发生危害盛期 ; 田 间开始为零
星发生 ,后逐渐扩散蔓延为成片 、 成块发生 ; 田 间初次危害瞒源主要来 自栽种带蜡 的种用鳞茎 。
异地远距 离传播主要也是通过调运带瞒的种用鳞茎 。 田 间扩散主要依赖根瞒 自身从被害鳞 茎
转移至地面后爬迁 ,在软松土中可 以从地下向部近的蕊头鳞茎上转移 ,风雨及人工操作也起到
一定的助迁作用 ;刺足根瞒在采收后的鳞茎上 可继 续繁殖危害 。
关健词 葛头 刺足根蜡 生物学 危害
基金项 目 : 湖北省科技攻关项 目( 2 0 3 A A 20 1C77 7)
收稿 日期 : 2加 5 一 01 一 24 , 2X() 5 一 03 一 21 修回
3 3 3 一