全 文 ：文章编号:1001-4829(2010)03-0866-06
　　收稿日期:2009-10-12
　　基金项目:国家 “ 973”基础研究项目(2007CB108907)
作者简介:陈永霞(197-),女 ,四川西昌人 ,讲师 ,在读博士 , ＊
为通讯作者 , E-mail:zhangxq@sicau.edu.cn。
扁穗牛鞭草种质资源的 RAPD分析
陈永霞 1, 2 ,张新全 2＊ ,马　啸2 ,谢文刚 2
(1.西昌学院动科系 ,四川西昌　 615000;2.四川农业大学草业科学系 ,四川雅安　 625014)
摘　要:用 RAPD标记对 1份来自上海和 45份来自西南地区(四川 、重庆 、云南 、贵州)的扁穗牛鞭草无性系的遗传多样性进行检
测。研究结果表明 , ①14条引物共扩增出 198条谱带 ,平均每条引物扩增出 14.1条带 ,多态性比率(PPB)达 91.9 %,多态信息含
量(PIC)范围为 0.208 ～ 0.313,材料间遗传相似系数(GS)在 0.624 ～ 0.973之间 ,表现出丰富的遗传多样性。 ②对 RAPD分子标
记扩增条带数据进行聚类 ,能将高大直立型和低矮型的材料分开 ,可能是因为所检测到的RAPD标记中存在与形态性状密切相关
的数量性状位点(QTL),这为进一步应用 RAPD分子标记对扁穗牛鞭草群体基因组进行扫描 ,寻找与目标寻找紧密连锁的分子标
记提供了理论基础。
关键词:扁穗牛鞭草;RAPD;遗传多样性
中图分类号:S816.5+1　　　文献标识码:A
GeneticDiversityofHemarthriacompressaGermplasmDetectedbyRAPD
CHENYong-xia1, 2 , ZHANGXin-quan2＊ , MAXiao2 , XIEWen-gang2
(1.DepartmentofAnimalScience, XichangColege, SichuanXichang615000, China;2.DepartmentofGrasslandScience, SichuanAgri-
culturalUniversity, SichuanYa an625014, China)
Abstract:RAPDmolecularmarkerwasappliedtodetectgeneticvariationof46HemarthriacompressaclonesfromShanghaiandSouthwest
China, includingSichuan, Chongqing, YunnanandGuizhou.(i)14primerswereselectedforRAPDanalysisfrom100randomprimers, of
whichamplificationbandswereclear.198DNAfragmentswerefoundwithanaverageof14.1bandsperprimer.Thepercentageofpolymor-
phismbands(PPB)was91.9%, thepolymorphisminformationcontent(PIC)rangedfrom 0.208to0.313withanaverageof0.258, the
geneticsimilaritycoeficient(GS)amongalclonesrangedfrom0.624to0.973, whichindicatedthatthegeneticdiversitywascomparatively
richamongtheclonestested.(i)TheHemarthriacompressamaterialswithhigh-horrentandthickset-lowweredistinguishedthroughUPGMA
cluster.ThereasonmaybethattherewerequantitativetraitlociamongRAPDmarkersdetectedwhichwereassociatedcloselywithmorphical
trait, thatprovidedabasisforscaningHemarthriacompressapopulationgenomebyRAPDmarkertofindmolecularmarkercloselylinkedto
targettraits.Theseresultprovidedusefulinformationforgermplasmstorage, utilizationandbreeding.
Keywords:Hemarthriacompresa;RAPD;Geneticdiversity
　　牛鞭草属(Hemarthria)植物主要分布在热带 、
亚热带及北半球的温带湿润地区 ,我国有 4个种和
1个变种 ,即牛鞭草(H.altisima)、扁穗牛鞭草(H.
compresa)、小牛鞭草(H.humilis)、长花牛鞭草(H.
longiflora)和族穗牛鞭草(H.compresavar.fascicu-
late)[ 1] ,其中 ,扁穗牛鞭草是我国特有种 ,主要分布
在长江以南及河北 、山东 、陕西等地 [ 2] 。扁穗牛鞭
草为多年生匍匐性禾草 ,主要靠地上茎繁殖 ,是一种
生长期长 、生长速度快 、抗逆性强 、再生力强和产量
高的常年青绿优良饲草 [ 3] ,是热带 、亚热带建植人
工草地 、南方草山草坡改良的优良草种 [ 4] 。
我国独特的气候条件 ,造就了特有的多样性种
质资源。野生扁穗牛鞭草分布相当广泛 ,存在多种
生态类型 ,不同生境条件下 ,形态差异较大 ,从外形
上分为高大直立型 、纤细低矮型 、粗壮低矮型 3种类
型[ 5] ,不同居群间存在丰富变异 ,居群内也存在一
定程度的变异 [ 6] 。我国审定推广的 “广益 ”、“重高 ”
扁穗牛鞭草品种均由野生材料栽培驯化而来 ,已在
南方多省得到广泛推广应用 。因此 ,进一步加强扁
穗牛鞭草野生资源收集评价对发掘优异种质资源 ,
866
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences　　　　　　　　　　　　　　
2010年 23卷 3期
Vol.23　　No.3
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2010.03.037
培育新品种有重要意义。
随机扩增多态性 DNA技术(RAPD)具有操作
简便 、快速 、省时 、省力 、DNA用量少等优点 ,被应用
于基因定位与分离 、连锁和系统演化等方面 ,已广泛
用于苜蓿[ 7 ～ 8] 、黑麦草 [ 9] 、羊茅 [ 10] 、红三叶 [ 11] 、白三
叶 [ 12]等牧草遗传多样性评价和亲缘关系鉴定 。
RAPD只需要一个引物 ,且引物顺序是随机的 ,因而
可在被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其
基因组进行分析 ,而且通过统一试验条件 ,试验结果
重复性和稳定性大大提高[ 13 ～ 14] 。本研究利用
RAPD标记对来自西南区(45份)和上海(1份)扁
穗牛鞭草种质进行遗传多样性研究 ,将填补 RAPD
标记技术在扁穗牛鞭草资源研究领域的空白 ,为科
学保护和合理利用扁穗牛鞭草资源及新品种培育提
供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
采集自四川 、重庆 、云南 、贵州的扁穗牛鞭草 45
份 、上海 1份 ,种植于四川农业大学草业科学基地
内。随机引物购自上海生工 , PCR所用 Mg2+、Taq
酶 、dNTP、DNAmarker等为北京天根公司产品 。
1.2　DNA提取与纯化
取幼嫩扁穗牛鞭草叶片 , 采用 CTAB法提取
DNA。用 0.8 %的琼脂糖凝胶在 200 V电泳 40
min, EB染色 ,检测 DNA质量 ,合格样品于 4℃冰箱
保存 。
1.3　PAPD引物筛选
选取田间性状差异大的材料 DNA(H053、2003-
5、广益 、重高)作模板 ,从 100对引物中筛选多态性
高的引物 ,再对全部材料进行 PCR扩增。
1.4　电泳
用 1.5 %琼脂糖凝胶(含 0.5 μg.mL-1的 EB)
进行电泳分离检测 ,电泳缓冲液采用 0.5×TBE,点
样 10 μl,电压 120V,电泳 2.5 h,在 Bio-rad的凝胶
成像系统上观察照相。
表 1　试验材料序号和名称
Table1　SampledlocationsandhabitantofH.compresa
序号
Number
名称
Name
采集地点
Colectionlocation
序号
Number
名称
Name
采集地点
Colectionlocation
1 H001 四川大渡河 Daduriver 24 H034 重庆粱平 Liangping, Chongqing
2 H002 重庆畜科所 Chongqing 25 H035 重庆梁平 Liangping, Chongqing
3 H003 四川雅安 Ya an, Sichuan 26 H037 四川达县 Daxian, Sichuan
4 H004 四川名山 Mingshan, Sichuan 27 H038 重庆梁平 Liangping, Chongqing
5 H005 四川雅安 Ya an, Sichuan 28 H039 重庆垫江 Dianjiang, Chongqing
6 H007 四川洪雅 Hongya, Sichuan 29 H040 重庆涪陵 Fulin, Chongqing
7 H009 四川洪雅 Hongya, Sichuan 30 H041 贵州独山 Dushan, Guizhou
8 H010 重庆南山 Nanshan, Sichuan 31 H043 贵州独山 Dushan, Guizhou
9 H011 嘉陵江 Jialinriver 32 H044 贵州独山 Dushan, Guizhou
10 H012 上海农科院 Shanghai 33 H045 贵州荔波 Libo, Guizhou
11 H014 四川大邑 Daye, Sichuan 34 H047 贵州荔波 Libo, Guizhou
12 H016 四川眉山 Meishan, Sichuan 35 H048 云南巧家 Qiaojia, Yunnan
13 H017 四川乐山 Leshan, Sichuan 36 H049 云南巧家 Qiaojia, Yunnan
14 H019 四川雅安 Ya an, Sichuan 37 H050 四川宁南 Ningnan, Sichuan
15 H021 四川绵阳 Mianyang, Sichuan 38 H052 四川自贡 Zigong, Sichuan
16 H022 四川绵阳 Mianyang, Sichuan 39 H053 四川自贡 Zigong, Sichuan
17 H023 四川绵阳 Mianyang, Sichuan 40 H054 四川乐山 Leshan, Sichuan
18 H025 四川绵阳 Mianyang, Sichuan 41 H056 重庆江津 Jjiangjin, Chongqing
19 H026 四川宁南 Ningnan, Sichuan 42 H057 重庆大足 Dazu, Chongqing
20 H028 四川宁南 Ningnan, Sichuan 43 H060 四川西昌 Xichang, Sichuan
21 H029 四川宁南 Ningnan, Sichuan 44 广益 四川雅安 Ya an, Sichuan
22 H030 四川宜宾 Yibin, Sichuan 45 2003-5 四川雅安 Ya anSichuan
23 H033 重庆万洲 Wanzhou, Chongqing 46 重高 四川雅安 Ya anSichuan
8673期 　　　　　　陈永霞等:扁穗牛鞭草种质资源的 RAPD分析
表 2　14条 RAPD引物的序列
Table2　14randomprimersequence
引物编号
Primercode
引物序列
Primersequence
引物编号
Primercode
引物序列
Primersequence
S1 GTTTCGCTCC S30 GTGATCGCAG
S2 TGATCCCTGG S46 ACCTGAACGG
S5 TGCGCCCTTC S64 CCGCATCTAC
S12 CCTTGACGCA S66 GAACGGACTC
S13 TTCCCCCGCT S73 AAGCCTCGTC
S16 TTTGCCCGGA S77 TTCCCCCCAG
S20 GGACCCTTAC S95 ACTGGGACTC
1.5　数据统计分析
对获得的扩增条带进行统计 ,在相同的迁移位
置 ,有带记为 “1” ,无带记为 “0”,仅记录清晰强带和
重复性好的弱带 ,构成原始数据矩阵。根据表征矩
阵 ,统计 RAPD扩增产物条带总数和多态性条带数
量 ,计算多态性条带所占比例(PPB)和引物多态信
息含量(PIC), PIC=2fi(1-fi),式中 , fi表示有带所
占的频率 , 1-fi表示无带所占的频率。采用 NTSYS
软件根据 UPGMA法计算遗传距离及绘制亲缘关系
树状图 。
2　结果与分析
2.1　引物筛选及 RAPD扩增
从 100对随机引物中筛选出扩增条带清晰 、多
态性好 、重复性好的引物 14条(表 2),用于 46份扁
穗牛鞭草 DNA的扩增。正交优化实验所得适合扁
穗牛鞭草 RAPD-PCR反应的 20 μl扩增体系为:20
ngDNA模板 、1×PCR反应缓冲液 、0.75 μM引物 、
250μMdNTP、1.5mMMg2 +、1UTaq酶。 PCR反应
程序:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 1 min, 35 ℃退
火 1 min, 72℃延伸 2 min, 45个循环;72 ℃延伸 10
min, 4℃保存 。
2.2　RAPD扩增结果及多态性分析
14条引物对扁穗牛鞭草 DNA扩增结果见表 3、
图 1,共扩增出 198条带 ,片段大小在 500 ～ 1700bp
之间 ,平均每条引物扩增条带数为 14.1条 ,其中引
表 3　扁穗牛鞭草 RAPD引物的多态性
Table3　Amplificationresultfrom 14RAPDprimer
引物
Primer
条带总数
Amplication
band
多态性条带
Numbersof
polymorphismbands
多态性比率
Percentageofpolymorphic
bands(PPB, %)
多态信息含量
Polymorphisminformation
content(PIC)
S1 14 13 92.9 0.273
S2 15 15 100.0 0.313
S5 10 7 70.0 0.215
S12 12 10 83.3 0.307
S13 11 10 90.9 0.225
S16 12 12 100.0 0.226
S20 17 17 100.0 0.276
S30 14 12 85.7 0.241
S46 14 13 92.9 0.208
S64 14 13 92.9 0.278
S66 13 12 92.3 0.269
S73 17 14 82.3 0.297
S77 18 18 100.0 0.239
S95 17 16 94.1 0.240
总数 Total 198 182
平均 Mean 14.1 13.0 91.9 0.258
868 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
物 S77扩增条带最多 ,为 18条 , S5最少 ,为 10条;
多态性条带总数为 182条 ,平均每条引物扩增的多
态条带为 13.0条 ,平均多态性比率(PPB)为 91.9
%,其中 , S2、S16、S20、S77多态比率(PPB)最高 ,均
为 100 %,最低的为 S5 ,为 70 %。多态信息含量
(PIC)范围为 0.208(S46)～ 0.313(S2),平均为 0.
258,表明 RAPD能检测到较多的遗传位点 ,获得多
态性较好的 PCR效果 。
2.3　聚类分析结果
利用 NTSYS软件计算出 46份扁穗牛鞭草材料
间的遗传相似系数(GS)值为 0.624 ～ 0.973,平均
GS值为 0.737。其中 ,来自大渡河边的 H001和来
自重庆畜科所的 H002的遗传相似系数最大 ,为 0.
973,表明它们之间亲缘关系最近。来自上海农科院
H012与来自四川雅安的 H019遗传相似系数最小 ,
为 0.624,表明其亲缘关系最远。
进一步采用 UPGMA法对供试材料进行聚类分
析(图 2)。在 GS=0.700处 ,可把 46份扁穗牛鞭草
分为两个类群 ,来自上海农科所的 H012单独为一
类(第Ⅰ类),剩下的来自四川 、重庆 、云南 、贵州的
材料聚为一类(第 Ⅱ类)。在第 Ⅱ类材料中 , H001、
H002、“广益”和 2003-5聚为一类(A类),其他的聚
为第 B类。 A类四份材料均属高大直立型 ,且 H001
与 H002相似系数达 0.973。 B类均为低矮型 ,其
中 , 2份粗壮低矮型材料 H019和 “重高 ”在 0.740处
单独聚为一类 ,二者相似系数高达 0.878。从聚类
8693期 　　　　　　陈永霞等:扁穗牛鞭草种质资源的 RAPD分析
结果来看 ,相同或相近地理来源的材料基本聚在一
起 ,但也存在差异 ,如来自四川绵阳安昌河边生境相
似的 H021、H022和 H025相似度较高 ,在 0.874处
聚为一类 , 而来自云南巧家的两份材料 H047和
H048的遗传相似度较低 ,相似系数仅 0.765;另外 ,
来自四川宁南的 H026、H028、H029、H050遗传相似
度也较低 ,在 0.754处聚为一类。
3　讨论与结论
　　对 46份扁穗牛鞭草材料进行 RAPD分子标记
遗传多样性分析 ,结果表明:平均每条引物扩增条带
数为 14.1条 ,多态比率(PPB)为 91.9%,多态信息
含量(PIC)范围为 0.208 ～ 0.313, 遗传相似系数
(GS)值为 0.624 ～ 0.973,从而在分子水平说明不同
扁穗牛鞭草材料间的遗传差异较大 ,遗传多样性丰
富 。本研究中 ,扁穗牛鞭草多态性条带的比率远高
于范彦用 ISSR[ 15] 研究的 84.2 %和刘金平[ 16]用
AFLP检测的 88.6%,这可能是材料不同和研究方
法的差异造成的 ,这也说明 RAPD可有效检测扁穗
牛鞭草种质的遗传变异 ,可作为分子标记辅助育种
的有力工具 。
与形态学分类[ 5]一样 ,对 RAPD分子标记扩增
条带数据进行聚类 ,能将高大直立型和低矮型的材
料分开 ,可能是因为所检测到的 RAPD标记中存在
与形态性状密切相关的数量性状位点(QTL),这为
进一步应用 RAPD分子标记对扁穗牛鞭草群体基因
组进行扫描 ,寻找与目标寻找紧密连锁的分子标记
奠定了基础 。
聚类分析中 ,来自上海的材料 H012与来自西
南区的材料差异比较大 ,单独聚为一类 ,可见扁穗牛
鞭草长期适应当地环境条件会导致遗传上的差异 。
西南区自然条件多样 ,环境条件复杂 ,生态类型多
样 ,蕴含有丰富的种质变异 。研究结果表明 ,同一地
区的不同微生境下也蕴藏着不同遗传基础的生态
型 ,这为选育适应当地生境条件的品种(系)提供了
丰富的基因资源 [ 17] 。
本研究中 ,除了国审品种 “广益 ”、“重高 ”外 ,均
为野生状态下的扁穗牛鞭草材料。通过田间多年观
测 , H001(四川大渡河边)和 H002(重庆)的形态特
征和生产性能均很一致 ,初步断定二者具有相同的
来源。通过 RAPD标记聚类 , 二者相似系数达 0.
973,具有相同的遗传背景。结合外部观测和分子标
记结果 ,认为 H001和 H002具有相同的来源 。扁穗
牛鞭草作为多年生无性繁殖物种 ,采用常规手段选
育新品种 ,前期种质筛选耗时费力 [ 18] 。因此 ,在前
期应用 RAPD分子标记对所收集种质进行检测 ,筛
除遗传背景相同的材料 ,可大大降低田间工作量 ,提
高育种效率。
2003-5是 2009年通过国家审定的扁穗牛鞭草
新品种 “雅安” ,是由 “广益”变异而来 ,在外部形态 、
品质等方面与 “广益 ”有较大的差异 ,但从聚类情况
来看 ,二者的亲缘关系较近 ,相似系数达 0.898,这
可能是长期种植后 ,自然条件和栽培条件的变化产
生的基因变异 ,这为以后扁穗牛鞭草新品种选育提
供了理论依据 ,这与范彦 [ 15]的研究结果一致。
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(责任编辑　李　洁)
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